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[Música]
Hola, hola, ¿cómo están?
Una vez más, vengo a contarles un poquito sobre el origen de la variabilidad genética para la detección antigénica. En este caso, vamos a hablar del complejo mayor de histocompatibilidad, o MHC por sus siglas en inglés, quien es el encargado de presentar los antígenos a los receptores de linfocitos T.
El teórico se va a dividir en dos partes. En una primera parte, vamos a hablar sobre la estructura molecular y la genética del complejo mayor de compatibilidad, y en la segunda parte, vamos a hablar de su relevancia para el trasplante de órganos.
El complejo mayor de compatibilidad se encuentra en el cromosoma 6 del genoma humano y, como lo dice su nombre, es un complejo de genes. Una porción del ADN que alberga un montón de genes relacionados entre sí, con ciertas funciones en común, organizados en tres grandes grupos o clases de genes.
Las clases 1 y 2 codifican para las proteínas que conformarán las moléculas encargadas de presentar antígenos a los linfocitos, y la clase 3 comprende genes involucrados en la respuesta inmune, como TNF y el complemento, así como genes de respuesta a situaciones de estrés celular, como HSP70, involucrado en la respuesta al shock térmico.
Como pueden ver, los genes son muchos y muy variados. Los genes de la clase 1 y 2 en humanos reciben el nombre de antígenos leucocitarios humanos, HLA por sus siglas en inglés, y tienen relevancia importante para la aceptación o rechazo de los trasplantes, ya que actúan, como lo dice su nombre, como antígenos de superficie de los leucocitos humanos.
Hay varios genes HLA de clase 1: A, B, C, y lo mismo para los genes HLA de clase 2: DR, DQ, DP, que conforman el MHC. La clase 2 siempre será del mismo tipo: DRA, DPA, DQA, DQB, que a su vez se subdividen en genes que codifican para cadenas alfa y beta. Es decir, que existe, por ejemplo, un gen HLA-A alfa y otro HLA-A beta.
En cuanto a la estructura molecular de los complejos mayor de histocompatibilidad, están directamente relacionados con los genes HLA de cada clase. El MHC clase 1 es un heterodímero conformado por una única molécula de HLA y la clase 1 A, por ejemplo, cuyos dominios alfa 1 y alfa 2 conforman el sitio de unión peptídica. Al dominio alfa 3 se une una molécula de beta-microglobulina y presenta un dominio transmembrana y otro intracelular.
Mientras que el MHC clase 2 es también un heterodímero, pero conformado por dos moléculas del MHC de clase 2: una alfa y una beta, cuyos dominios alfa 1 y beta 1, respectivamente, conforman el sitio de unión. Tienen también un dominio transmembrana y otro intracelular.
La cadena alfa y beta que conforman el MHC clase 2 siempre serán del mismo tipo: DRA, DPA, DQA, DQB, y sus expresiones son estimuladas por los interferones, el TNF y las interleucinas.
En cambio, el MHC clase 1 carga péptidos de entre 8 a 10 aminoácidos y se los presenta a linfocitos T CD8 positivos. Se expresan en las células presentadoras de antígeno, como células dendríticas, macrófagos y linfocitos B, y su expresión es estimulada por interferón gamma, IL-2 e interleucina 4.
Ahora veamos cómo ocurre el procesamiento y la carga de antígenos peptídicos en estas moléculas. En el caso del MHC clase 1, proteínas citosólicas, es decir, que están libres en el citosol, propias y exógenas, son procesadas por el proteasoma, que las fragmenta en péptidos de distinto tamaño.
Los péptidos de entre 8 a 10 aminoácidos son transportados por la proteína TAP, compuesta de dos subunidades: TAP1 y TAP2, cuyos genes que las codifican están ubicados en la región del cromosoma 6 correspondiente al complejo mayor de histocompatibilidad.
Bien, los péptidos son transportados por TAP al interior del retículo endoplasmático, donde son cargados al surco peptídico de las moléculas de MHC clase 1. Este proceso es un proceso activo, con gasto de energía, consumo de ATP.
Entonces, una vez cargado, el HLA clase 1 es transportado en una vesícula que se desprende del retículo endoplasmático hasta la membrana celular para su expresión en la superficie de la célula y la presentación del antígeno a los linfocitos T CD8. Al ser los péptidos que se presentan provenientes de proteínas libres en el citosol, esta vía de presentación antigénica presenta principalmente antígenos de patógenos intracelulares.
En el caso de MHC clase 2, se presentarán péptidos de patógenos extracelulares que han sido fagocitados. Una vez formada la vesícula endocítica, su mero interno se acidifica, degradando los productos que contiene. Se generan fragmentos peptídicos que serán cargados a los HLA clase 2 al fusionarse con una vesícula proveniente del retículo endoplasmático que contiene las moléculas HLA clase 2.
Para prevenir la carga del HLA clase 2 con otros péptidos antes de su fusión con el endosoma, bloqueando el sitio de unión peptídica, se encuentra una cadena invariante, la cual se desprende al fusionarse las vesículas, permitiendo la carga del HLA con el péptido correspondiente.
La vesícula portando el HLA cargado con el péptido antigénico se fusionará con la membrana celular para su presentación a los linfocitos T CD4. Estas vías de presentación antigénica se denominan vía endógena y exógena, respectivamente.
Todo muy bonito hasta acá, pero ¿y la variabilidad para la presentación antigénica? ¿Dónde está? Pues bien, en los sitios de unión peptídica. Estos son sitios polimórficos, es decir, que su estructura, su morfología molecular, no es idéntica entre HLA. Es diferente entre los HLA de una misma clase e incluso entre los HLA de un mismo tipo.
Pero el polimorfismo no se limita al sitio de unión peptídica, sino que se extiende a las regiones adyacentes donde el MHC interacciona con el TCR, con el receptor de los linfocitos T. Me dio la importancia de la selección de los linfocitos que reconocen lo propio y lo ajeno, y la relevancia de la identidad de los HLA para la selección de donantes de órganos.
La variabilidad de presentación antigénica del MHC es producto del polimorfismo, es decir, muchas formas de un mismo gen, muchos alelos para el mismo gen, sumado a la co-dominancia, es decir, a la expresión de los alelos heredados de mamá y papá para cada HLA.
Por lo tanto, por cada gen HLA, vamos a expresar en la superficie de nuestras células las dos formas que hayamos heredado de nuestros padres, los dos alelos. A esto es a lo que se llama co-dominancia. Esto crea la variabilidad de HLA porque, si por ejemplo, de nuestra madre heredamos el HLA-B1 y de nuestro padre el HLA-B5, nosotros vamos a expresar las formas 1 y 5 del HLA.
Lo mismo para el resto de los HLA. De este modo, podemos presentar diversas formas peptídicas, es decir, diversos antígenos a los linfocitos T. Yo les dije que los HLA tienen importancia para los trasplantes. Los principales genes de compatibilidad en trasplante son los HLA-A, HLA-B y HLA-C, en total 6 alelos, porque hay tres pares de genes homólogos: el A, el B y el C.
Y los HLA-DR que hacen un total de 12 alelos, porque las cadenas alfa y beta están en genes separados. Por lo tanto, hay 6 pares de genes. Para la importancia y la extensión del polimorfismo de los HLA, debemos tener en cuenta que en la población humana, al año 2016, se han detectado más de 14,000 alelos diferentes para los principales HLA involucrados en trasplante, que codifican para más de 10,000 proteínas diferentes.
Pero ustedes me van a preguntar: ¿cómo puede ser que si hay 14,000 alelos codificando solo 10,000 proteínas? Esto se debe a que, si bien la secuencia genética puede variar, algunas de estas variaciones no modifican la secuencia de aminoácidos de la proteína del HLA. Recuerden que hay codones sinónimos, es decir, codones que codifican para un mismo aminoácido.
Además, algunas de estas mutaciones corresponden a alelos nulos, a los que no codifican una proteína que vaya a expresarse en la superficie celular. Pueden ver que el número de serotipos HLA identificados es significativamente menor que el de alelos y proteínas. Esto tiene relevancia a la hora de seleccionar donantes de órganos, por lo que mundialmente se tiende a implementar la genotipificación de los HLA de donantes y receptores como el método de identificación de tipos HLA, en vez de la serotipificación.
Esto se debe a que constantemente están apareciendo nuevos polimorfismos en la población, resultado de mutaciones en las células germinales. Estos números siempre estarán en aumento, es decir, que constantemente en la población humana estarán apareciendo nuevas formas alélicas de HLA.
Pero debemos tener en cuenta que cada población humana, grupo de personas en una región geográfica con una ascendencia en común, presenta un conjunto particular de esta infinidad de alelos. Por ello, conocer la variabilidad genética de HLA de una población es importante, ya que permite estimar la probabilidad de encontrar individuos con semejanza entre sí.
Los sujetos con una misma ascendencia tienen más probabilidad de compartir formas de HLA entre sí. Miembros de una familia, primos, tíos, padres, hermanos, cuanto más estrechas son las relaciones genéticas entre los individuos, mayor su semejanza a nivel de HLA.
Lo que va a hacer que una población como la nuestra, la argentina, con una ascendencia principalmente europea, española, italiana y de países nórdicos, tenga un perfil de HLA más semejante a la población europea que, por ejemplo, a la población asiática.
Así como el genotipado nos abre las puertas a un mundo de polimorfismos, así también ha traído consigo una nomenclatura especial para poder identificar a cada alelo. El serotipo nos permitía nombrar a los HLA de forma muy simple: su tipo, es decir, qué gen de HLA, A, B o C, y el alelo en particular, 120, 34, 46.
En el ejemplo de esta pantalla, el HLA-B alelos 44. Esta es una determinación grosera de muy baja resolución que solo da información a nivel de antígeno. En cambio, el genotipado y su nomenclatura brindan mucha más información sobre HLA.
Puede ser un genotipado de alta resolución o a nivel de alelos específicos. Nos dice a qué gen HLA corresponde, nos habla de su antigenicidad, pero también qué mutaciones sinónimas tienen, su exón, de mutación en su intrón y el efecto de las mutaciones en su expresión, es decir, si se va a expresar o no el HLA.
La nomenclatura no la tienen que aprender, pero es importante que sepan que existe esta nomenclatura tan compleja y qué tipo de información brinda. Y ustedes me dirán que lo único que importa son las mutaciones a nivel de alelos, por lo cual no debería alcanzar el serotipo.
Pero el serotipo no cubre todas las formas alélicas. No hay anticuerpos para cada una de las formas de HLA, y por otro lado, mutaciones en los exones e intrones afectan la expresión de los HLA, por lo que es importante conocerlas. Pueden tanto evitar que se exprese un HLA como provocar que ese HLA se exprese en mayor cantidad.
Para finalizar esta primera parte del teórico, vamos a ver cuáles son los métodos de serotipado y genotipado HLA. Deben estar un poco cansados a esta altura, pero tengan un poquitín más de paciencia.
El serotipado se remonta a la década del 60 del siglo 20. Existen varios métodos de serotipado, algunos más activos y otros más modernos, pero todos ellos involucran anticuerpos contra los HLA.
En el ensayo del micro linfocito toxicidad dependiente de complemento, se utilizan anticuerpos monoclonales anti-HLA, es decir, anticuerpos capaces de identificar un tipo de HLA en particular, de unirse a un tipo de HLA en particular.
En este ensayo, se toma sangre del paciente y se aíslan las células mononucleares. Las células se distribuyen en pocillos de una placa de 96 pocillos. A los pocillos se añaden anticuerpos monoclonales anti-HLA específicos y luego componentes del complemento.
En aquellos pocillos donde los anticuerpos reconocen y se unen a moléculas HLA en la superficie de las células mononucleares del paciente, los componentes del complemento que se unen al anticuerpo desencadenarán la lisis de las células.
Como nosotros sabemos qué anticuerpo anti-HLA específico pusimos en cada pocillo, podemos saber que HLA presenta dicho paciente. Otra forma de este ensayo es incubar células del donante con suero del receptor. Esto se llama prueba de reacción cruzada.
Este ensayo en particular nos permite saber si el receptor posee anticuerpos preformados contra HLA presentes en el donante. Si existen dichos anticuerpos, van a reconocer y unirse a los HLA, y se va a producir la lisis de las células del donante por acción del complemento.
Esta prueba no permite conocer los tipos específicos de HLA ni del donante y del receptor, pero es sumamente importante para prevenir rechazos hiperagudos del órgano trasplantado por la presencia en el receptor de anticuerpos preformados contra HLA.
Aquí puede expresar las células del donante. Otro método, un poco bastante más moderno, es la citometría de flujo, que utiliza anticuerpos monoclonales anti-HLA conocidos, unidos a fluorocromos, es decir, que el anticuerpo está unido a una molécula que es un fluorocromo que va a emitir fluorescencia cuando se ha excitado por un láser.
Cuando se utiliza esta prueba, al igual que en el primer caso del ensayo de micro linfocito toxicidad anterior, se va a poder identificar cuáles son las áreas específicas en la superficie de las células del paciente que está siendo evaluada.
Pero aquí no habrá lisis celular, sino que la emisión de fluorescencia de las células cuando se unen a sus HLA, los anticuerpos específicos, es lo que nos va a decir qué tipo de HLA expresan dichas células.
La citometría de flujo consiste en el conteo y evaluación individual de las células, de sus características morfológicas y la detección de moléculas fluorescentes asociadas a ellas. Se utilizan células con anticuerpos que detecten moléculas específicas en la superficie de las células, y si estos anticuerpos primarios están marcados por un fluorocromo o son a su vez detectados por otro anticuerpo secundario marcado por un fluorocromo, lo que se llama inmunomarcación directa o indirecta, respectivamente.
Entonces, detectores especiales en el equipo de citometría de flujo pueden detectar cada célula que atraviese el láser en el citómetro, así como si dicha célula emite o no fluorescencia y qué tipo de fluorescencia.
Entonces, si los anticuerpos que usamos son anti-HLA específicos, cuando se detecte una célula que emite fluorescencia, sabemos que dicha célula expresa el HLA que reconoce el anticuerpo con el que incubamos las células.
La forma en que se visualiza qué células presentan fluorescencia o no es por gráficos donde se representan la cantidad de células versus la fluorescencia que emiten. Como pueden ver en pantalla, las células sin fluorescencia se grafican en negro y aquellas que expresan HLA clase 1 presentan fluorescencia en rojo.
También en citometría de flujo se pueden realizar pruebas de reacción cruzada. En este caso, se usa sangre completa del donante y suero del receptor. Este suero puede o no tener anticuerpos anti-HLA preformados.
Además, se utilizan dos sueros positivos: uno con anticuerpos específicos contra CD3 para detectar linfocitos T y el otro con anticuerpos contra CD19 para detectar linfocitos B. Se incluye en esta prueba un suero negativo sin anticuerpos.
Se analiza la sangre del donante con cada suero por separado y se agrega un anticuerpo anti-Ig humana unido a fluorocromo. Se analiza entonces el patrón de fluorescencia, viendo dónde se detectan las células incubadas con el suero del receptor.
Si el suero del receptor tiene anticuerpos anti-HLA preformados para HLA clase 1 presentes en los linfocitos T del donante, entonces estas células van a emitir fluorescencia y la curva que se grafica va a coincidir con aquella del suero positivo con anticuerpos anti-CD3, que está marcando linfocitos T emitiendo fluorescencia.
Caso contrario, la curva va a coincidir con aquella del suero negativo por no detectarse fluorescencia en las células. Recordemos que el suero negativo no tenía anticuerpos, y si se compara con la fluorescencia emitida por el anticuerpo anti-CD19, entonces se puede saber si existen anticuerpos preformados contra HLA de clase 2 presentes en los linfocitos B del donante.
En el ejemplo en pantalla, el receptor no presenta anticuerpos anti-HLA preformados contra HLA del donante, ya que la curva que brinda el suero del paciente, que se representa en rojo, coincide con la curva correspondiente al suero negativo.
Si coincidiera con la curva que representa a los linfocitos T o la curva que representa a los linfocitos B, entonces el paciente presentaría anticuerpos anti-HLA contra HLA presentes en el donante, es decir, de clase 1 o de clase 2.
Igual que en el caso del ensayo del micro linfocito toxicidad por reacción cruzada, aquí no podemos identificar qué tipo de HLA específico tienen donantes y receptores, pero sí si existen anticuerpos preformados en el receptor, lo cual es fundamental para saber si existirá o no rechazo hiperagudo.
Otra forma de serotipado es mediante ELISA, donde en una placa de 96 pocillos se siembran antígenos HLA conocidos, se incuba con el suero del paciente y se detecta la presencia de anticuerpos anti-HLA específicos preformados con anticuerpos anti-Ig humana unidos a una enzima que provoca una reacción colorimétrica cuando se agregan sustratos que reaccionan con la enzima.
En este caso, sí podemos saber específicamente qué anticuerpos anti-HLA específicos tiene preformados el paciente, porque nosotros conocemos qué sustratos de HLA hemos sembrado en cada pocillo.
Finalmente, veremos los métodos de genotipado que arrancaron la vida por la década de los ochentas del siglo pasado. Uno de ellos es la PCR-RFLP, que estudia los polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción, es decir, los patrones de fragmentación del ADN.
Lo que se realiza es una amplificación de los genes de HLA por PCR y esas copias se exponen a enzimas de restricción. Las enzimas de restricción reconocen secuencias específicas del ADN y cortan el ADN a la altura de dicha secuencia, creando un patrón de fragmentación del ADN específico de cada individuo.
Si comparamos patrones entre individuos, podemos saber si la secuencia en su HLA es la misma o es diferente. En el ejemplo en pantalla, para un individuo se observa una única banda, pues la enzima no cortó el ADN, y para el otro individuo se observan dos bandas, pues la enzima sí cortó el ADN, lo que nos dice que las secuencias son diferentes.
Otro método de genotipado es la PCR-SSP, que utiliza primers específicos para cada secuencia de HLA. De este modo, los patrones de amplificación que se obtienen de la PCR nos indican qué HLA tiene cada individuo.
En el ejemplo que vemos, los dos primeros sujetos no presentan HLA de tipo DR4 y DR13. El tercer sujeto presenta HLA de tipo DR4 y el cuarto sujeto HLA de tipo DR13. También se pueden identificar HLA por la hibridación de sondas específicas de secuencia.
Se amplifican los genes de HLA y los productos de amplificación se incuban con sondas específicas unidas a fluorocromos. Si hay hibridación, en la siguiente ronda de amplificación se emitirá fluorescencia y se identificarán los HLA.
Finalmente, la secuenciación es el método de genotipado más sensible, pues nos permite identificar alelos a nivel de nucleótidos. Se toma el ADN del individuo y se secuencia de forma fragmentada, es decir, se secuencian pequeños trozos del ADN de ese individuo y luego se alinean los fragmentos para reconstruir la secuencia.
Se compara contra secuencias HLA conocidas y se determina el HLA del individuo. Incluso se pueden identificar nuevas formas alélicas de HLA.
Y eso es todo por el momento. Tómense un respiro, descansen un rato y luego busquen la parte 2. ¡Hasta pronto!
[Música]
Todo, nadie como tú, tú no hay un sustituto.