Bilirrubina Total, Directa e Indirecta

Hola, hola a todos, ¿cómo están? Espero que se encuentren muy bien.

Bueno, en esta oportunidad vamos a hablar un poquitito de cómo vamos a hacer en el práctico la cuantificación de lo que es la bilirrubina total, directa e indirecta.

Estas técnicas las decidí hacer todas juntas en este teórico, ya que son muy similares y vamos a prestar bastante atención porque hay varios pasos que no hacemos en otras técnicas que puede hacer que esta técnica de bilirrubina total o directa sea un poco más complicada.

Vamos a arrancar hablando un poquitito de cómo vamos a hacer en el laboratorio para poder medir la bilirrubina total. Primero que nada, acá les traigo lo que es el fundamento del método. Vamos a leerlo brevemente y después con este dibujito voy a intentar mostrarles un poquito qué es lo que pasa en la cubeta.

Primero que nada, cuando vamos a medir bilirrubina total, este es una parte del inserto, dice que la bilirrubina indirecta, que es la que está unida a la albúmina, se libera gracias a un agente tensoactivo. Entonces, eh, esa bilirrubina indirecta que está unida a la albúmina queda suelta y de alguna manera eh, junto con otro reactivo que se llama sal de diclorofenil diazonio o de acá en adelante DPD. Este DPD va de alguna manera reaccionar con toda la bilirrubina que está en la cubeta dándome un color rojo.

Está. La bilirrubina total, como ustedes saben, es la sumatoria básicamente de lo que es la bilirrubina conjugada, la que no está unida a la albúmina y por supuesto esta bilirrubina que se le considera no conjugada porque no ha pasado por el hígado o también se le llama bilirrubina indirecta que es la que justamente está unida a lo que es la albúmina.

¿Qué pasa? Eh, tenemos que saber que la bilirrubina directa es la soluble, es la que vamos a encontrar en la orina, la tira reactiva de orina, porque justamente tiene la capacidad al ser soluble de poder filtrarse y nosotros la vamos a encontrar en el examen de orina.

¿Estamos de acuerdo que la bilirrubina total entonces es la sumatoria de estas ambas bilirrubinas, de estas dos bilirrubinas de la directa junto con la indirecta?

¿Qué es lo que hace el agente tensoactivo? Justamente esto lo que va a hacer es liberarme la bilirrubina indirecta o mejor dicho la bilirrubina que está unida a la albúmina porque el reactivo sal de diazonio o DPD tiene la particularidad de formar un compuesto coloreado color rojo. De acá ya sabemos que es colorimétrica solamente con la bilirrubina que está libre de albúmina. Está.

Entonces, ¿hago yo para de alguna manera liberar a esta bilirrubina de la albúmina? Se inventaron otro reactivo que es reactivo A, que lo que tiene es este tensioactivo. El tensioactivo hay que pensarlo así, como si tuviéramos una especie de tijera que de alguna manera corta la unión de la albúmina con la bilirrubina indirecta para que justamente esta bilirrubina indirecta que estaba unida a la albúmina ahora quede libre.

Entonces acá tenemos eh las bilirrubinas que van a poder reaccionar con la sal de diazonio para justamente darnos este color rojo.

¿Qué sucede? Esto es a modo de repaso, no más. Ustedes saben que la bilirrubina, en definitiva, es un producto de degradación del catabolismo de los glóbulos rojos. Y esto es a modo repaso. Ustedes se acuerdan que cuando el grupo hemo era capturado en lo que es el vaso, de alguna manera teníamos que recuperar el hierro que dentro que hay dentro de este grupo hemo. Y acá pasaban varias cosas interesantes. Este grupo hemo terminaba abriéndose, formando biliverdina. Nosotros recuperábamos el hierro. Esta era la única reacción que formaba monóxido de carbono y esta biliverdina por diferentes pasos terminaba formando lo que es bilirrubina, que es lo que ustedes ven acá, que es un anillo bastante complejo y lo que termina haciendo en definitiva este DPD es uniéndose a todos los este nitrógenos que está dentro de de este anillo supercomplejo y dándome esta coloración roja que nosotros vamos a cuantificar en el laboratorio.

Pero insisto con esto, nosotros para medir bilirrubina total debemos a través de un agente tensoactivo separar la bilirrubina que está unida a la albúmina. Cuando nosotros logramos ese cometido, ahí el DPD que vamos a utilizar es capaz de unirse a todas las formas de bilirrubina y vamos a poder cuantificar la bilirrubina total.

Vamos a hablar un poquitito del tipo de muestra que vamos a utilizar y vamos a hacer un paréntesis bastante importante. ¿Qué pasa? E, las muestras admitidas para poder hacer la cuantificación de bilirrubina total y bilirrubina directa que vamos a ver en este práctico e, es suero o plasma.

Dos cuestiones bastante interesantes. Primero que nada, todas las muestras deberían llegar al laboratorio protegidas de la luz, porque la bilirrubina es muy lábil a la luz y se deteriora muy rápido. Esto puede hacer que nosotros encontremos resultados falsamente disminuidos si es que nos demoramos en el procesamiento del tubo. E, también además de suero/plasma, tenemos que saber que el plasma puede ser para la bilirrubina total. Si total, bien digo, estamos hablando puede ser si viene plasma de heparina o de.

Pero me quiero detener en algo bastante interesante. ¿Qué sucede? El color propio de lo que es el suero o el plasma está dado por concentraciones normales de bilirrubina, de otros productos endógenos, pero principalmente la coloración normal del plasma, aunque tengamos bilirrubina normal, esta coloración es propia de la bilirrubina. Está. Vieron que tiene como un color ámbar, un color amarillo pálido.

¿Qué pasa si nosotros colocamos este suero o plasma en el espectrofotómetro? Nosotros ya habíamos aprendido que la ictericia o lo mejor también decir la bilirrubina tiene un pico de absorbancia que de hecho la siempre hablamos de ictericia como un agente interfiere. ¿Qué es lo que pasa? Si nosotros colocamos el tubo en lo que es el espectrofotómetro, vamos a tener una absorbancia propia de lo que es la muestra, porque la muestra ya tiene bilirrubina y la bilirrubina absorbe, sobre todo en este rango acá, de 400 a 500, está, más o menos en este rango acá.

Entonces, claro, de alguna manera yo voy a eh generar un color, un color rojo, como me decía el inserto, pero además de estar midiendo ese color rojo, yo voy a estar midiendo también el color propio de lo que es el suero o plasma, porque justamente también tiene bilirrubina, que es un pigmento que, como les digo, es el que nos da el color propio a este suero y a este plasma.

Entonces, ¿qué pasa? Tenemos una absorbancia propia de la muestra. Entonces, este es la primera técnica que vamos a aprender, donde yo tengo que hacer un blanco de muestra para de alguna manera hacer que esta esta coloración no me interfiera en lo que es la técnica. Insisto con esto, este color que nosotros tenemos normalmente en suero/plasma está dado por la bilirrubina, ¿está? Y la bilirrubina es un componente endógeno que absorbe color, ah, absorbe luz, ah, y no quiero que la reacción se me contamine por la propia coloración de lo que es el suero o el plasma, ¿está?

Entonces, primer práctico donde vamos a tener que hacer un blanco de muestra para después restárselo a lo que es la muestra con el reactivo, para obtener lo que es la absorbancia real.

A su vez, la cosa se empieza a complicar un poquitito más porque cuando nosotros utilizamos el estándar, el estándar también tiene un color muy similar a lo que es el suero o plasma. Entonces, claro, nosotros si no hacemos un blanco de estándar, vamos a estar agregándole color propio del estándar al color que va a tener el estándar con la reacción. Acuérdense que nosotros con con el reactivo e, acuérdense que nosotros utilizamos siempre un estándar para poder utilizar eh y hallar lo que es el factor, que es lo que vamos a terminar multiplicando con con la absorbancia de nuestro desconocido.

Entonces, también lo que debemos tener en cuenta es que si este estándar tiene color y es similar a lo que es el color de lo que es el suero, como ustedes van a ver en el práctico, nosotros debemos hacer un blanco de estándar porque justamente el estándar también tiene absorbancia propia. Y como van a ver el y como hacemos en todas las técnicas, el estándar lo hacemos reaccionar con el reactivo y va a dar un color. Y yo lo que quiero es medir solamente el color que me da la reacción del estándar con el reactivo. No quiero que el color propio del estándar me sume más absorbancia a lo que es el sistema. Por ende, debo hacer un blanco de estándar para obtener un una absorbancia del estándar real, si se quiere.

Entonces, vamos contando que tenemos blanco de muestra y blanco de estándar. Pero como la cosa no es tan fácil, que tenemos que los reactivos, ambos reactivos, también pueden llegar a tener color o pueden absorber algo de luz. Entonces, para que de alguna manera no me interfieran en lo que es el color de la reacción propiamente, yo debo también tener un blanco de reactivo.

Entonces, cuando uno sigue leyendo el inserto, se da cuenta de que la cosa se empieza a complicar porque empiezan a haber siglas que no hemos visto. Entonces, ¿qué es lo que propone este procedimiento? Nosotros vamos a tener un tubo que le vamos a llamar BR o que es lo mismo blanco de reactivo, donde lo que vamos a colocar es el reactivo A y es el reactivo B el que me ofrece el DPD y el que me ofrece lo que es el agente tensoactivo, ¿ya? Y vamos a colocar cierta cantidad de agua destilada. Nosotros vamos a medir la absorbancia de este blanco de reactivo porque después vamos a ver qué vamos a hacer con ella.

Después tenemos algo que se llama BM. Creo que lo tengo acá. Ahí va. Esto es lo que les voy a ir comentando. Vamos a lo que les acabo de comentar. Vamos a colocar en un en un tubo cierta cantidad de reactivo A, cierta cantidad de reactivo B con agua destilada para llegar a un volumen final que todos los tubos tengan lo mismo. Y vamos a medir la absorbancia de de lo que es la conjunción de estos dos reactivos con el agua destilada.

Después, ¿qué es lo que pasa? Nosotros tenemos que hacer un blanco, ¿está?, de lo que es B. Acá se llama BM. Vamos a tener que hacer un blanco de muestra porque dijimos que la muestra tenía color y vamos a tener que hacer un blanco de estándar o de calibrador, ¿está?, porque justamente dijimos que el estándar también tenía color.

¿Qué es lo que vamos a hacer? Vamos a agarrar un tubo donde voy a poner reactivo A, donde voy a colocar, por ejemplo, 80 microlitros de la muestra y voy a medir lo que es la absorbancia. Después voy a agarrar otro tubo, voy a colocar reactivo A y voy a colocar 80 microlitros, pero de lo que es el estándar, justamente para hacer el blanco del estándar y el y el blanco de muestra. ¿Está? Entonces, ya voy teniendo un tubo, dos tubos, tres tubos. Tranqui, que acá se los tengo más desglosados, pero vamos de a poco porque la cuestión en en esta medición se puede complicar.

Entonces, BR creo que está bastante entendido, los blancos creo que también están bastante entendidos y después, ¿qué pasa? Tengo que llevar a cabo la reacción propiamente. Esta M, ¿qué me está diciendo? Tengo que hacer reaccionar la muestra con el reactivo y tengo que hacer reaccionar el calibrador con el reactivo. De hecho, ustedes ven que acá, por ejemplo, pongo reactivo A 1 ml, 80 microlitros en un tubo lo voy a colocar en la muestra y en otro tubo voy a colocar 80 microlitros, pero del estándar, ¿está? En ambos tubos voy a colocar 1 ml de lo que es reactivo A y voy a colocar reactivo B, ¿sí? Si ustedes suman, van a ver que los volúmenes son iguales. En definitiva, lo que estoy haciendo en esta tercera, este, en este tercer tubo, acá en esta tercer eh columna estoy midiendo propiamente la reacción, ¿está? Y acá tengo los blancos de muestra y los blancos de estándar y los blancos de los reactivos, ¿sí?

Estamos de acuerdo y dijimos más eh anteriormente que yo debo tener lo que es una absorbancia real de la muestra y una absorbancia real del estándar. Es por eso que justamente hacemos estos blancos para después restársela, ¿no?

Entonces, hasta ahí creo que vamos bien. Entonces, eh, esto es como otro en suma de esto que les acabo de comentar para que quede aún más claro. Vamos a hacer un blanco de lo que es reactivo, porque este reactivo puede llegar a tener color o de alguna manera puede absorber luz y me estaría falseando el resultado. Vamos a hacer un blanco del estándar y de la muestra porque justamente tienen color. No quiero que este color de alguna manera me interfiera en lo que es el el resultado final.

Entonces tenemos un tubo. Acá intenté mezclarles estos dos colores y acá vamos a tener un tubo para hacer el blanco el estándar y un tubo para hacer el blanco de muestra. BM, no se confundan que sea blanco de muestra, sino que BM es lo que usa la sigla acá, que si ustedes ven acá en la referencia, BM es igual a blanco de muestra, a blanco o a blanco de calibrador, que para nosotros es un estándar. Y después, en una tercera oportunidad, lo que nosotros vamos a hacer es esta MM, que es simplemente hacer reaccionar la muestra con el reactivo y lo que es el reactivo con el estándar para ver qué absorbancia tenemos.

Recordar que eh tenemos los blancos para después restarles. Entonces, esto que yo les pongo en verde es lo que siempre venimos haciendo. Mido una absorbancia del blanco y de alguna manera mido la absorbancia que me da la muestra con el reactivo y el estándar con el reactivo. ¿Qué es lo nuevo que yo en esta técnica puntualmente tengo que hacer? Además de blanco de reactivo, tengo que hacer blanco de muestra y blanco de estándar para obtener una absorbancia real del estándar y una absorbancia real de lo que es la muestra.

Creo que hasta acá va todo un poquito, vamos lento, pero quiero que quede bastante digerido porque ya les digo, es una técnica bastante engorrosa si no no se entiende bien.

Entonces, ¿qué sucede cuando nosotros seguimos leyendo? Ah, porque para algo tenemos que hacemos el blanco de reactivo. Cuando nosotros seguimos leyendo, tenemos que nos dice mezclar e incubar 5 minutos inmediatamente después leer en espectrofotómetro 546. Que 546 ya sabemos que es una técnica colorimétrica, llevando a cero el aparato con el blanco de reactivo. Esto es lo que ya hemos hecho en otras técnicas. Coloco el blanco de reactivo en lo que es el espectrofotómetro y él va a medir una absorbancia, pero con el botón de cero yo obligo a que el espectrofotómetro cuando se encuentre con algo similar a esto me diga la absorbancia es igual a cero. Con esto yo ya tengo solucionado que de alguna manera el color del reactivo no me va a interferir en lo que es la reacción final.

Después me dice, "Bueno, vamos a tener que hacer una lectura uno." Esto es lo que dice el inserto, que es o también le llama desvío óptico uno. ¿Qué es lo que tengo que hacer? O lo que me dice, tenés que agarrar lo que es el blanco de muestra o el blanco del calibrador y medirle la absorbancia.

Entonces, ¿se acuerdan que estaríamos acá en el BM? Agarramos el blanco de la muestra y agarramos el blanco de lo que es el calibrador o el estándar y lo paso por el espectrofotómetro. Acá lo que estoy solamente midiendo es la absorbancia de la muestra pelada, a ver cuánto absorbe y el voy a medir la absorbancia del estándar pelado, ¿está?, sin ningún sin ningún tipo de aditivo. A ver cuánto es que absorbe.

Entonces tengo acá que el BM, que es esta sigla que utiliza del estándar, me lo inventé 0,1 es la absorbancia y el BM de la muestra que también me lo inventé, es 0,2. Esto es lo que el el inserto dice como DO1, pero después aparece lo que es lectura 2 o DO2, que es desvío óptico dos. ¿Qué es lo que me dice acá? Bueno, ahora vas a tener que medir los tubos M. Tenemos estos dos tubos M, el tubo de lo que es la muestra con el reactivo A y el tubo de lo que es el estándar con el reactivo, donde está la reacción propiamente dicha.

¿Qué es lo que yo veo acá? que tengo como reacción de la muestra una absorbancia de 1,7 y que la reacción de lo que es el estándar con el reactivo me vale 1,5. ¿Está? Esto está bueno ya ir sabiendo que ya tiene restado eh lo que es la no tiene en cuenta, digamos, lo que es el color propio del reactivo porque yo ya llevé el espectrofotómetro a cero. Lo que sí tienen estos dos estas dos muestras, el la muestra con el reactivo y la muestra con el estándar, el reactivo con con el estándar, perdón. Lo que sí tienen y yo le tengo que descontar son las respectivas absorbancias de la muestra pelada sin nada y del estándar pelado sin nada.

Entonces, ¿qué es lo que sucede? Ustedes acá ven que tenemos lo las absorbancias de la reacción, si se quiere, y las absorbancias de los blancos. Entonces, cuando me dice, yo tengo que calcular los resultados y siempre que hacemos un analito, que calculamos un analito, nosotros sabemos que es el desconocido por un factor. ¿Qué es esto de DO2 - DO1m? Bueno, primero que nada, cuando nosotros hacemos eh como les decía e, la queremos hallar la concentración de un analito, siempre hacemos desconocido por factor. Esto acá DO2m, si ustedes se ven acá DO2 es M de muestra, es decir, yo tengo que agarrar esta absorbancia, ¿ya? ¿Y a qué le tengo que restar? tengo que restarle el resultado de DO1, o sea, DO1 del blanco de la muestra, o sea, del blanco de la muestra. Blanco de la muestra. En definitiva, lo que estoy haciendo acá, este, esta perolata que se ve bien fea, estoy haciendo la absorbancia de la muestra real. ¿Está? Nuestro D de desconocido real, porque ustedes ven que lo que estoy restando es de alguna manera la reacción se la estoy restando a lo que es el blanco de la muestra, porque el blanco de la muestra de alguna manera esta muestra ya coloreada me está dando cierta absorbancia que no es real, no es de la reacción.

Entonces es en realidad lo que estoy haciendo acá, es la absorbancia de la muestra real. Y después eh, esto con respecto para hallar la D, que lo tengo que multiplicar por el factor, que el factor siempre lo hallamos de la misma manera. Concentración del estándar dividido lo que es la absorbancia del estándar.

Entonces, ¿qué es esta otra perolata? me dice, "Bueno, acá abajo vas a tener que poner DO2 de lo que es el calibrador." Entonces, me vengo acá DO2 del calibrador. Lo que me está pidiendo es, en definitiva, la reacción del estándar con el reactivo. ¿Y está? Entonces, me está pidiendo que acá ponga 1,5. Y y a qué me a qué se le qué le tengo que restar a 1,5. DO1 BC. DO1 BC. Ah, que BC en realidad es el blanco, el calibrador que para nosotros el estándar. En definitiva, lo que me está pidiendo acá es la absorbancia del estándar real. Ah, ven que todo esto que parece medio chino cuando uno lo ve e con con números y con cosas con dibujitos y demás, eh queda como mucho más claro. ¿Está? Absorbancia de la muestra real y absorbancia del estándar real.

Cuando uno sustituye, que es lo que vamos a hacer ahora, ¿qué tenemos? Vamos a tener un calibrador que es un calibrador universal que van a ver que vale esto y si no vale esto porque cambió el razonamiento es lo mismo, pero el estándar vale 3,71 mg/dL.

Entonces, ¿qué pasa cuando yo hallo el factor? ¿Qué es lo que hago? El la concentración es esta, me la da 3,71. ¿Por qué lo tengo que dividir? Por la absorbancia del estándar real. Estos valores lo que yo hago es sustituirlos. Son estos que están acá. 1,5 es vendría a ser lo que es la el estándar con el reactivo, este que me da este valor de 1,5 y se lo tengo que restar a lo que es el el blanco de estándar para hacer la absorbancia del estándar real. Cuando yo hago estos cálculos, obtengo que el factor, es decir, por lo que tengo que multiplicar al desconocido, vale 7,42.

Entonces, ya tengo el factor. Entonces, ahora solamente me me queda hallar lo que vendría a ser la absorbancia de la muestra real. ¿Qué es lo que hago? Esta misma ecuación es la misma de acá arriba. La absorbancia real, ¿cómo está dada? Agarro y digo, bueno, 1,7 es la reacción. Le tengo que restar lo que es el blanco de la muestra, ¿está?, porque esta muestra tenía color. Cuando hago los cálculos y lo multiplico por 7,42, que es el factor que hallé acá arriba, me dice que la concentración de este paciente de bilirrubina total es de 11,13 mg/dL.

¿Está? Esto insisto, uno intenta, yo incluso cuando lo lo estoy explicando ahora lo tengo que pensar un poco para no confundirme, pero bueno, nada, es simplemente eh aclararles un poquito estas cuestiones de de números y de letras, que es simplemente las absorbancias reales y después tener cuidado de no de no cruzar valores, ¿verdad? Acá lo bueno que podrían hacer es una cuadrícula para que justamente los valores queden en el recuadro que tienen que quedar para que no se mezclen y estemos restando cualquier cosa. Pero esta es la forma que nosotros tenemos para medir bilirrubina total y este sería el valor real de este paciente.

¿Qué sustancias tenemos conocidas? Normalmente son las mismas de siempre. Acá el inserto hace referencia a que las globulinas cuando están elevadas pueden causar interferencia. Esto en realidad porque me aumentan lo que es la turbidez o algún desvío óptico que para la técnica de bilirrubina es como muy sensible en ese sentido.

Después, la hemólisis también interfiere cuando tenemos e que pasa por determinado valor, porque, ¿qué pasa? ¿Ustedes se acuerdan que la hemoglobina este absorbía cierta longitud de onda, que esa longitud de onda no es nada más ni nada menos que donde yo estoy midiendo la bilirrubina? Es por eso que me interfiere, ¿está? Y eh también e vamos a ver que eh la lipemia también cuando supera cierto valor eh también interfiere porque los quilomicrones aprendimos que son macromolecularmente muy grandes y me pueden desviar la luz.

¿Qué pasa la hemólisis? Acá arriba, yo les digo que de alguna manera como absorbe a la misma longitud de onda que voy a medir la bilirrubina, de alguna manera me puede aumentar los resultados. Pero, ¿qué pasa? En el balance general se ve que la hemólisis termina disminuyendo los resultados. Y esto tiene un porqué y se los quiero mostrar acá. Acá eh la hemólisis juega para los dos lados, valores porque es un interferente eh espectral, pero me lo disminuye por esto que yo les voy a mostrar.

¿Qué pasa si yo tengo una muestra hemolizada? Este es el mismo dibujito que les mostré anteriormente, donde el blanco de muestra ustedes ven que vale 0,2. Cuando yo tengo una muestra, lo que estoy haciendo es aumentando el blanco, porque claro, cuando lo paso por el espectrofotómetro, el espectrofotómetro lo que va a hacer es leer el color propio de la muestra, de la bilirrubina que tiene la muestra, pero sin la reacción, lógicamente, sino la bilirrubina que le da el color a lo que es el plasma, pero también va a medir lo que es la absorbancia propia de la hemoglobina, porque la hemoglobina va a absorber también. Entonces, claro, en definitiva, me termina aumentando el blanco.

¿Y qué pasa cuando yo quiero hacer la absorbancia de la muestra real? Ustedes ven que si yo utilizo la la absorbancia sin hemólisis, es decir, los valores que yo les mostré en las diapositivas anteriores, tengo que 1,7, que es el el valor de la reacción, le tendría que restar, como muy bien ya hicimos, el valor de la muestra que es 0,2. La absorbancia de la del blanco de muestra que es 0,2. obteniendo este valor. Pero, ¿qué pasa? Si yo tengo la muestra con hemólisis a 1,7, que es lo que me da la reacción, le tengo que restar 0,7, que es la lo que es el blanco de muestra. Entonces, claro, ustedes ven que paso de 1,5 a tener 1. Cuando yo hago este valor de 1 por el factor, obtengo que eh de 11,13 paso a 7,42.

Entonces, en definitiva, nosotros sabemos que la hemólisis es un una hemólisis en en esta en esta técnica es un interferente espectral que me tira el resultado hacia arriba, pero en el balance general, en el balance general pesa mucho más la cantidad de veces que aumenta el blanco de muestra y esto hace que por consecuencia la concentración final sea menor. Entonces, en suma, la hemólisis disminuye falsamente los resultados. Esto lo saqué del libro de Química Clínica, donde este párrafo justamente está citado de ahí. Pero bueno, me parecía importante mostrarles las dos aristas para nada eh comentarles para que ustedes lo sepan, pero hacerle énfasis puntualmente que en esta técnica la hemólisis juega para abajo.

¿Cuáles son las limitaciones de este procedimiento? Tenemos que saber, como ya les nombré, que la la luz la luz natural o la luz de los artefactos de lo que son las luces este artificiales degradan a la bilirrubina. Entonces, de alguna manera, eh todas las muestras tendrían que llegar al laboratorio e tapadas o cubiertas con algún tipo de protector de color negro para que justamente eso no suceda. Acá ustedes ven como el mismo inserto que en una hora se puede perder hasta el 50% de la bilirrubina presente. Y esto es un problema porque ustedes imagínense que tenemos un paciente que tiene una bilirrubina elevada y yo me demoro o la muestra se demora en llegar, estoy perdiendo bilirrubina y capaz que puedo llegar a tener un resultado normal cuando en realidad no es así.

Después otra cosa interesante que siempre discutimos en estas charlas es la el concepto de linealidad, que es muy preguntado de que saber qué es. Y esta técnica puntualmente es lineal hasta 250 mg/L. Si yo quiero convertir estos 250 mg/L en dL, en mg/dL, se acuerdan que en el dL tengo 10 veces menos que en el L, entonces divido entre 10, por eso me queda 25 que ustedes ven acá. Ah, esto lo pueden ver en la parte de uno de los videos que les dejé dentro de esta lista, esta playlist, el concepto fundamentales que justamente cómo hacemos las conversiones.

Bien, eso con respecto a lo que es la bilirrubina total. Vamos a hacer un parate y vamos a seguir con la bilirrubina directa.

Bien, vamos a seguir con lo que es la bilirrubina directa, que van a ver que es un papel de calco para e igual que la que la bilirrubina total. ¿Qué pasa? Yo ahora quiero medir lo que es la bilirrubina directa. Ah, si quiero medir la bilirrubina directa, claramente el resto no me interesa. ¿Por qué? Porque, opa, se me fue la diapositiva. ¿Por qué? Porque todo lo demás yo lo tenía en cuenta porque quería medir la bilirrubina total. Pero en este caso lo único que me interesa y mi atención va a estar solamente en lo que es la bilirrubina directa. Entonces ya no me importa la indirecta. Por ende, el agente tensoactivo no me interesa. Por eso ustedes ven que acá en la descripción del reactivo A no hay agente tensoactivo. Y de alguna manera lo que tengo que hacer es simplemente hacer reaccionar este reactivo DPD con la bilirrubina que está en la sangre, que yo ya sé como no utilicé tensioactivo, que va a ser la que no está unida a la albúmina, la que está libre de la albúmina justamente por la cual el DPD quiere reaccionar directamente. ¿Está? E, por supuesto que se va a formar el mismo color rojo, pero tengo un paso menos si se quiere.

Entonces, e, esto es muy similar. Ustedes ven que vamos a utilizar suero/plasma, proteger de la luz natural porque se degrada, vamos a utilizar heparina, ¿se acuerdan? En caso de utilizar plasma, vamos a utilizar plasma con heparina. ¿Se acuerdan que cuando hablamos de bilirrubina total utilizábamos? Lo cierto es que hoy utilizamos o suero o plasma con heparina. En el sentido, no no no nos cambia mucho.

Después tenemos que la hemólisis produce valores falsamente disminuidos. Vieron que acá específicamente en la bilirrubina directa lo especifica, pero bueno, eh, yo se los comentaba anteriormente porque para la bilirrubina total yo necesito medir la bilirrubina directa. Entonces, bueno, si tengo hemólisis de alguna manera la bilirrubina total va a estar este también afectada. También la lipemia. Bueno, estos son los mismos interferentes que estamos acostumbrados a ver. Y esto es lo mismo, la acción de la luz puede destruir hasta un 50% de la bilirrubina, por eso es que debe llegar este protegida de la luz.

Pero me interesa muchísimo cómo partimos de un esquema muy grande y terminamos simplemente en este en este renglón, en esta columna donde vamos a medir solamente la bilirrubina directa que va a reaccionar con esta sal de diazonio para darnos este color e que en definitiva vamos a terminar midiendo.

¿Qué pasa cuando uno ve el procedimiento? Se da cuenta de que es exactamente igual. ¿Qué es lo que pasa? Voy a tener también un blanco de reactivo. ¿Para qué? Para llevar el espectrofotómetro a cero, porque el reactivo me puede contribuir con el color. Voy a tener que hacer un blanco de muestra y voy a tener que hacer un blanco estándar por el mismo fundamento de que la muestra tiene color y el estándar tiene color. Voy a medir eh sus absorbancias para después, ¿qué hago con esas absorbancias? Restárselas a quiénes? A los valores de absorbancia de lo que es la reacción. Porque después, si recuerdan, eh esta M era simplemente llevar a cabo la reacción entre lo que es la muestra y el reactivo y entre lo que es el calibrador y el reactivo. Entonces, claro, yo voy a tener una absorbancia producto de esta reacción y otra absorbancia producto de esta reacción, pero ya aprendimos que eh estas absorbancias están infladas por quién, por estos e por estos propios colores que tiene la muestra y que tiene el estándar. Por eso yo tengo que hacer lo que es la absorbancia real haciendo esta resta.

Cuando uno ve la forma de cálculo se da cuenta que es exactamente lo mismo. ¿Qué pasa esto acá arriba? Cuando voy a medir la bilirrubina directa me dice que tengo que hacer DO2m - DO1bm. Esto en definitiva es la absorbancia de la muestra real. ¿Está? Lo que yo tengo que hacer es agarrar la muestra, que en este caso es 0,8, ¿ya está? Y le tengo que restar lo que es el blanco, que eso lo tengo acá, pero no lo vamos a ver ahora en unos segundos.

Entonces el factor se calcula de la misma manera. Concentración del estándar dividido absorbancia del estándar. Esta perolata acá abajo es con palabras más sencillas la absorbancia del estándar real. Entonces vamos a hacer un unos cálculos a ver qué es lo que nos da. Vamos a imaginarnos que el estándar vale 2,23 mg/dL. Ustedes en su práctico esto lo corroborarán y pondrán el valor que corresponda.

Entonces, em, vamos a hallar el factor. Tenemos que poner arriba, porque la fórmula me lo dice, lo que es la concentración dividido lo que es la absorbancia del estándar real. Cuando uno viene, se da cuenta que tiene que agarrar la reacción, lo que le dio la la absorbancia de la reacción del estándar, 1,5. Ustedes ven acá 1,5, 1,5 menos lo que es el blanco del estándar, que el blanco del estándar es 0,3. Cuando uno hace esta cuenta se da cuenta que el factor es 1,85, ¿ya está? Esto es lo que va acá.

Ahora yo lo que tengo que hallar es la D, que es el desconocido. ¿Cómo lo hago? Hallando lo que es la absorbancia real. 0,8, que es la absorbancia de la reacción, le tengo que restar 0,2, que es el blanco de lo que es la muestra, porque la muestra tiene color y me interfiere. Entonces, en definitiva, esta resta la voy a multiplicar por el factor y me termina dando la concentración de bilirrubina directa, que en este caso es 1,11.

Al igual que la bilirrubina total, la bilirrubina directa tiene una linealidad, que insisto con esto, preguntas de recontraexamen, ¿qué es la linealidad y qué pasa cuando la supero? Hay que diluir claramente. En este caso, la linealidad es lineal la técnica hasta 100 mg/L, que incluso acá el fabricante nos ayuda y nos da las este la el valor en miligramos/dL. Esto es lo que yo les comentaba. Cuando paso de miligramo a miligramo no tengo que hacer nada, pero de litro a decilitro, en el decilitro yo tengo 10 veces menos, es por eso que divido 100 entre 10 y me queda 10. Es por eso que acá la linealidad es máxima eh 10. Obviamente es que si la supero tengo que diluir para entrar en curva y después no olvidarme de esta concentración nueva que hallo, multiplicarla por lo que es el factor de dilución.

Y en definitiva, la bilirrubina indirecta termina siendo la resta entre la total y la directa. Acá como que no hay mucho misterio, no hay reacción, no hay este que llevar adelante ningún tipo de reacción para la indirecta, sino que simplemente sale por diferencia.

Bien. Y llegamos a esta parte que ya estamos al final nosotros. Esta este esta cuadrícula la vimos también cuando vimos transaminasas y dijimos que acá nosotros teníamos varios tipos de de información, ¿no? Parámetros de lesión, parámetros de función y parámetros de obstrucción. Hoy vimos bilirrubina total y bilirrubina directa, que ambos, ambos me ofrecen muchos datos sobre la cómo se está llevando a cabo la función hepática y y si tengo algún problema en la obstrucción, si tengo algún algún canalículo obstruido, puede ser que la bilirrubina total o directa, que tienen que volcarse a lo que es el duodeno, no puedan y termine refluyendo todo hacia atrás, hacia la sangre. Es por eso que nosotros nos vemos color amarillo cuando tenemos un aumento de lo que es la bilirrubina en sangre.

Después, esto ustedes ya lo saben, no vale interpretar un resultado aislado porque no ninguna de estas pruebas es específica del hígado. Y por supuesto que cuanto más datos yo tenga, un dato clínico, una historia clínica, va a ser mucho mejor para poder interpretar ese resultado.

Entonces, como siempre me gusta terminar con un caso eh para poder discutir, que bueno, puede ser que les toque en el examen parcial o lo en algún lado, se realiza la cuantificación de bilirrubina total, bilirrubina directa y lo que es la bilirrubina indirecta de un paciente. Y si obtienen que para la bilirrubina total un resultado de cinco con un valor de referencia menor a uno. Bilirrubina directa 4,5 cuando el valor de referencia es el 30% siempre la directa de de la total, o sea, menor a 0,30 y la bilirrubina indirecta de 0,30 a 0,70 y tiene un un resultado de 0,50. ¿Está? Ustedes ven aquí claramente la bilirrubina total está aumentada y la bilirrubina directa también. ¿Qué opinión le merece este resultado? ¿Qué causas de hiperbilirrubinemia prehepática, hepática y posthepática conoce? Y bueno, ¿cuál es la utilidad clínica?

Como siempre, si quieren ponen un un segundito pausa, lo piensan ustedes y después la respuesta que se las doy a continuación.

Bien, el paciente presenta una hiperbilirrubinemia a expensas de la bilirrubina directa. Esto está bueno aclararlo porque dependiendo si la bilirrubina eh total es a expensas de la directa pienso en una etiología y si es a expensas de la indirecta pienso en otra etiología. Eso forma parte de la utilidad clínica. También en este caso tenemos que tenemos una hiperbilirrubinemia a expensas de la bilirrubina directa que puede ser, por ejemplo, cuando uno pregunta las causas, puede ser por virus, por fármacos, por una colangitis, por un cáncer de páncreas, hasta una insuficiencia cardíaca también puede de alguna manera darnos este una hiperbilirrubinemia a expensas de la directa. Esto está explicado en el teórico de cuál es el teórico que se explica esto no me acuerdo bien. Creo que es cuando vimos, bueno, no me acuerdo, no me acuerdo. Después chequenlo bien, pero está la explicación, o sea, el tema es que hay un aumento de líquido en lo que es el el parénquima hepático. Eso comprime todo lo que son los canalículos biliares. Entonces, al disminuir la luz, no puede ir la bilis hacia lo que es el duodeno y termina refluyendo todo hacia hacia lo que es la sangre. Es por eso que encontramos que ya pasó por el hígado, por eso está conjugada, por eso es directa, pero no puede volcarse al duodeno para poder excretarse y la encontramos en sangre.

e lo que son virus hepáticos sería una causa hepática, los fármacos serían causa hepática, la colangitis sería algo poshepático porque el problema está en el colédoco, el cáncer de páncreas sería algo posthepático y la insuficiencia cardíaca, si se quiere, sería puede ser algo, por ejemplo, posthepático o prehepático, dependiendo de cómo uno lo vea.

Después tenemos, por ejemplo, causas de hiperbilirrubinemia a expensas de la bilirrubina indirecta. Vamos a imaginarnos que acá los valores están invertidos, ¿qué causas tenemos? Hemólisis intravascular, ¿sí? Donde acá juega un rol bastante importante la aptoglobina. Si se acuerdan, la proteína que llevaba este de regreso a la médula ósea, lo que es la hemoglobina. E, un partido muy importante juegan los recién nacidos. Recuerden que el recién nacido nace con un una inmadurez hepática donde no se puede conjugar toda la bilirrubina, por eso tengo mucha indirecta y a su vez tiene una masa eritrocitaria mucho mayor que tiene una vida media muy corta. Entonces, claro, eh se rompen muchos glóbulos rojos, eso hace que llegue más grupo hemo al vaso, que se forme más bilirrubina indirecta y claro, no la puedo conjugar para poder eliminarla porque tengo la inmadurez hepática. Esto es un problema porque el aumento de bilirrubina indirecta puede generarme en los niños una enfermedad que tiene como consecuencia el retardo mental, que es el kerníctero. Ah, después busquen fotos, pongan kerníctero en Google para ver de qué es lo que estoy hablando. Y después también tenemos este hemólisis intravascular como causa prehepática. Lo que tiene que ver con el recién nacido también es prehepático. Lo que es el síndrome de Gilbert y síndrome de Crigler-Najjar son dos eh síndromes con genéticos donde de alguna manera me falta la enzima que me conjuga la bilirrubina. Entonces, claro, no puedo pasar de indirecta a directa. En definitiva, lo que termino teniendo es un aumento de la total a expensas de lo que es la indirecta. Estos dos síndromes son eh lo que me explica porque esto es este hepático, el problema está en el hígado propiamente.

Después eh con respecto a la utilidad clínica, discútanla ustedes para sí mismos. Ahora ya les doy la respuesta.

Tenemos e utilidad clínica de las bilirrubinas. Son varias. Primero que nada, dijimos que son patrones de que me hablan de función y de una posible obstrucción, que es este primer renglón. Me permite valorar la etiología. Si es algo a predominio de la directa, pienso que el problema está en el hígado o después del hígado, que puede estar, por ejemplo, en lo que es el páncreas o puede estar, por ejemplo, lo que es el colédoco, una colangitis. e me permite evaluar la etiología porque es si es a predominio de indirecta, yo pienso en una hemólisis intravascular, en todo lo que habíamos comentado en la diapositiva anterior. Y esto es lo mismo de siempre. Siempre debe valorarse en contexto con otros analitos y el contexto del paciente, ¿está? No es lo mismo un paciente de 75 años que venga con una bilirrubina total elevada a expensas de la directa y que no tenga fiebre. Eso es una ictericia fría y a mí me ponen la pista de que ahí puede estar el problema con un cáncer de páncreas. ¿Está? A que, por ejemplo, venga un chiquilín joven donde el cáncer de verdad no se plantea, por lo menos de primera mano, que venga con bilirrubina total elevada a expensas de la directa y que tenga fiebre con un dolor en lo que es el el epigastrio o el hipocondrio derecho. Ahí de alguna manera me ponen la pista de que puede llegar a tener una colangitis. ¿Por qué? Porque tiene fiebre. ¿Está? Es una cuestión bastante importante si tiene fiebre o no tiene fiebre en un contexto cuando alguien está amarillo, ¿no? Cuando alguien tiene una ictericia y no tiene fiebre, se le llama ictericia fría. Uno piensa algo más en lo maligno, pero cuando tiene una ictericia, es un paciente joven, eh, con algún dolor ahí en lo que es este el hipocondrio derecho y algún algo más de la anamnesis, puede plantear, por ejemplo, desde una colangitis, desde algún alguna hepatitis y demás. Por eso ver el contexto del paciente es fundamental y me permite, por supuesto, eh valorar el riesgo de kerníctero. Cuanto más bilirrubina indirecta tenga un recién nacido, más chance tiene de que esa bilirrubina indirecta pase la membrana, este, la barrera hematoencefálica y se deposite en los ganglios basales. Eso es un problema porque si se deposita en los ganglios basales, las neuronas no pueden funcionar correctamente. Hay como un cortocircuito neuronal y el paciente este niño no se desarrolla este normalmente y puede terminar con retardo mental.

Así que bueno, chicos, nada, clase capaz que un poquito larga, pero me pareció interesante detenerme en algunas cuestiones, eh, ir suave, porque vieron que hay muchas cosas que entender, pero bueno, nada, cualquier cosa, como siempre quedo a las órdenes, me mandan mail, mensaje, lo que ustedes quieran y lo discutimos.

Bueno, gracias por todo, nos vemos. Saludos.