PRUEBAS DE PARALELISMO EN COAGULACIÓN

Hola a todos. Vamos a hablar sobre el uso y aplicaciones del paralelismo como herramienta en la detección de inhibidores en PLA. ¿Cómo podemos hacer actualmente una aplicación de una herramienta que es supervaliosa para el laboratorio de hemostasis, que tiene diferentes usos y que ayudan de una manera muy importante a detectar estos inhibidores de la coagulación?

Para poder llegar al entendimiento del concepto de paralelismo es importante partir de la base. Y la base siempre es comprender por qué se prolongan los tiempos de coagulación. Cuando nosotros eh cuando nosotros encontramos una alteración en los tiempos de población, porque es lo que posteriormente nos va a llevar a la sospecha de una alteración en la coagulación y nos va a llevar a entender cómo debemos estudiar estas alteraciones de la coagulación.

Y en primer momento el paralelismo aplica tanto para las alteraciones de la vía intrínseca como de la vía extrínseca de la coagulación. Por eso, los primeros dos conceptos que vamos a ver es por qué se prolonga el tiempo de protrombina. Y el tiempo de protrombina, al igual que el apett puede deberse a causas congénitas o causas adquiridas. Sin embargo, estudiar la alteración de un tiempo de plotrombina es un poco más sencillo. ¿Por qué? Porque el único factor que tenemos ligado a esta vía de estudio de la coagulación es el factor siete de la coagulación. Entonces, aquí eh es mucho más fácil porque si vamos a a pensar que es una deficiencia, en la mayoría de los casos se debe a la deficiencia del factor 7.

Cuando tenemos una prolongación del tiempo de protrombina, estudiamos la deficiencia del factor 7, pero sin embargo hay otras causas como las causas adquiridas que no debemos dejar de lado y e siempre vamos a hacer un diagnóstico diferencial porque vamos a pensar en estas causas congénitas, es decir, aquellas con las que los pacientes van a nacer. Y también tenemos causas adquiridas, que son las que eh también pueden alterar de forma secundaria a este tiempo, ya que muchos pacientes vienen con comorbilidades y otras patologías adquiridas en los que podemos encontrar este tiempo alterado.

A su vez, vamos a ver que hay varios eh puntos comunes entre lo que puede llegar llevar a una prolongación del tiempo y el aptt, como por ejemplo las alteraciones hepáticas, ¿no? la presencia de inhibidor lúpico o anticoagulante lúpico, también como se llama. Y específicamente en el caso de tiempo de perotrombina, muchas veces se ve alterado por el uso de medicamentos dicumarínicos como es la guarfarina, que ya lo hemos mencionado, o e la deficiencia de vitamina K causada por la guarfarina o también provocada por otras causas.

En el caso de el tiempo de termoplastina parcial activado o aptta, como se conoce en otras regiones de Latinoamérica, vamos a ver que es importante, además de las causas congénitas, identificar las causas fisiológicas, que son una de las razones en las que no pensamos con tanta frecuencia. Entonces, dentro de lo que son las causas fisiológicas, es importante identificar y tener presente que los neonatos, esta población de recién nacidos, va a tener una prolongación natural de tiempo de tropoplastina parcial activado durante al menos los primeros 6 meses de vida por su inmadurez hepática y porque de manera natural nacen con un disbalance en la hemostasis donde algunos factores van a estar más incrementados y otros factores tienden a estar más disminuidos, siendo esto normal para la edad. se empieza a regular después de los 6 meses de edad y en general la población pediátrica hasta los 15 años pueden tener unos tiempos de coagulación que pueden estar ligeramente prolongados, pero que son completamente normales.

Otra condición fisiológica a tener en cuenta en la prolongación de la aptt hemocrito. el hematocrito por encima del 55%, es decir, aquellos pacientes poliglobúlicos, van a tener una prolongación una falsa prolongación de este tiempo de coagulación gracias a una pérdida de la relación entre la proporción de sangre que tiene el paciente, o sea, la cantidad de plasma de un paciente poliglobúlico que va a ser menor versus la cantidad de citrato que existe en el tubo de toma de muestra. Entonces, se pierde esta proporción y en estos pacientes hay que aplicar una fórmula de corrección antes de tomar la muestra. donde la fórmula de corrección a lo que nos lleva es a disminuir la cantidad de citrato para balancearlo a la cantidad de plasma de un paciente poliglobulúo.

Por supuesto, dentro de lo que son las causas congénitas y patológicas están las deficiencias de los factores de la vía intrínseca de la coagulación y otros como es la enfermedad de bombíebbran, donde podemos encontrar un tiempo de coagulación de aptt. En algunos casos puede estar en límite entre lo que es el normal y patológico o puede estar prolongado dependiendo de la severidad de la enfermedad.

Por otro lado, tenemos eh también causas adquiridas como es la presencia de inhibidores de la coagulación, la presencia de eh inhibidores inespecíficos como es el anticoagulante lúpico o inhibidor lúpico, como también se eh se conoce. los e inhibidores adquiridos. Eh, por ejemplo, es una condición que sucede en lo que es la hemofilia adquirida y también tenemos algunas causas como es la presencia de inhibidores farmacológicos, como sucede en el caso de las heparinas. Estas situaciones son causas adquiridas que requieren de la herramienta del paralelismo para poder hacer una apropiada diferenciación diagnóstica, sobre todo en aquellos pacientes que pueden tener concomitantemente dos tipos de inhibidores en el mismo momento.

Y las indicaciones para el estudio de los tiempos de coagulación eh han sido escritas en la literatura eh por un alto porcentaje del eh seguimiento, o sea, se siguen estos tiempos de coagulación. Vamos a ver que eh se se indican en la mayoría de los pacientes eh preoperatorios, un 72% de los pacientes se le indica siempre un estudio de Crasis, un estudio de apttoperatorio y luego también hay porcentajes menores que dependen del paciente eh si el paciente ha tenido historia de sangrado, si el paciente ha tenido historia de trombosis, alteraciones vasculares o alteraciones puntuales de los factores de la coagulación. en los casos de sepsis y cáncer. También son otras patologías en los que hacíamos eh estudio de los tiempos de eh coagulación. También en otras enfermedades como son eh por ejemplo en causas adquiridas la amiloidosis, las homeopatías, las hepatopatías. Entonces, eh en muchas e en distintas causas podemos ver eh prolongaciones en estos tiempos de coagulación y siempre tenemos que tenerlas en cuenta a través del dato clínico que el médico nos suministra al laboratorio. lo que siempre remarcamos que es muy importante para nosotros conocerlo porque eso nos va a permitir correlacionar directamente el valor que obtenemos con la clínica del paciente, evitando la realización de pruebas adicionales eh que pueden llegar a complicarnos el trabajo.

Ya hemos visto en otras clases, nosotros cuando tenemos una prueba de coagulación básica alterada, el siguiente paso dentro del algoritmo es hacer la confirmación del tiempo de coagulación. Primero, ¿no? Siempre que tengo un tiempo de coagulación alterado, tengo que realizarlo una segunda vez. tengo que corroborar realmente que hice las cosas correctas y obviamente eh saber que mi equipo funciona correctamente y la validación tanto del equipo como del reactivo y la muestra es muy importante antes de realizar la de realizar la prueba y una segunda prueba para confirmarlo.

Entonces, e debemos e eliminar todas aquellas interferencias, ¿no?, o barreras preanalíticas que puedan que como sabemos los errores preanalíticos son los que eh suceden con más frecuencia dentro del laboratorio y llevan a un alto de porcentaje de errores en los resultados. Pero eliminando esta parte, el siguiente paso es la hacer la confirmación y el estudio e o la prueba de mezclas. La prueba de mezclas va a ser muy orientativa porque en los que nos va a ayudar es a identificar si el paciente tiene verdaderamente una deficiencia, un factor o tiene la presencia de un inhibidor y es muy orientativa para saber y estimar un poco si el inhibidor es específico o es inespecífico o puedan e estar de manera concomitante, que también nos puede pasar, ¿no? Dejando de lado que hay inhibidores farmacológicos como la heparina, que desde la parte técnica eh ya podemos saberlo de antemano.

Cuando e hacemos el análisis en el laboratorio, en un paciente que tiene una muestra heparinizada puede tener un comportamiento muy similar, casi mimético, a un inhibidor específico como la hemofilia A y el desarrollo de un anticuerpo antifactor 8. Por eso hay que tener mucha precaución y una muy buena correlación clínica con los datos que obtenemos del paciente para no entregar resultados que no correspondan a esta realidad del paciente.

Entonces, una vez que eliminamos todo esto, entonces el siguiente paso es realizar la prueba de mezclas para hacer confirmación del tiempo e identificar la deficiencia de factor o presencia de inhibidor que nos va a orientar hacia el tipo de inhibidor que pueda llegar a tener el paciente. Básicamente vamos a tener este escenario que ven acá y aquí nuevamente para reforzar el mensaje de la importancia de los datos clínicos para interpretación y orientación diagnóstica. E este es un caso de un tiempo de coagulación de un paciente con 98,3 segundos de apttas testigo o normal de 30 segundos. Y lo que queremos ver es si hay corrección o no al hacer esta proporción de partes iguales. Y lo que vemos al volver a hacer el tiempo de coagulación del paciente es que da muy similar al tiempo inicial. Es un tiempo bastante prolongado, 89,6 segundos. Y en este escenario lo que hacemos es pensar si el paciente tiene una clínica trombótica o si el paciente tiene una clínica hemorrágica. Si tiene una clínica trombótica, pensamos en el inhibidor lúpico o anticoagulante lúpico, pero si tiene una clínica hemorrágica, pensamos en la posibilidad de un inhibidor, un inhibidor específico, donde lo más común que estudiamos son los anticuerpos anti el factor ocho. Pero también recuerden que en los inhibidores farmacológicos se pueden parecer a estos inhibidores específicos por lo e por lo que uno de los criterios que debemos evaluar dentro del análisis de estos pacientes y de resultados es si el paciente tiene algún efecto presente de un anticoagulante como un inhibidor farmacológico.

Los anticoagulantes van a tener distintos puntos de acción en los factores de la cascada de la coagulación. la presencia de anticoagulantes que conocemos como inhibidores indirectos. Allí están eh por ejemplo las ceparinas, bien sean lasinas de bajo pues molecular o las peparinas no fraccionadas y se llaman indirectos porque van a atacar a sus factores desde la coagulación, lo que llamamos blancos terapéuticos como el factor 10 activado o la trombina. Necesitan eh estos se llaman indirectos porque necesitan de un mediador que potencie ese efecto anticoagulante como es la antitrombina. Entonces, siempre debemos descartar la presencia de estos anticoagulantes o inhibidores farmacológicos dentro de los estudios del laboratorio para seguir avanzando en la diferenciación diagnóstica.

Otra de las causas por las que se prolonga, además de los inhibidores farmacológicos, un tiempo de coagulación se puede prolongar por la presencia del inhibidor lúpico. Y el inhibidor lúpico puede dirigirse, como se ve acá en esta imagen de la vía de la cascada de la coagulación. puede dirigirse contra cualquiera de los complejos fosfolípidos, proteínas eh en estas vías de la coagulación, no solamente la vía extrínseca o la vía eh común, sino también contra la vía intrínseca de la coagulación. Entonces pueden bloquear los mecanismos de regulación de estas vías de coagulación y pueden formarse estos autoanticuerpos que están dirigidos contra los complejos proteína fosfolípidos, haciendo que se retarde la coagulación en vivo porque hacen la superficie eh catalítica inaccesible. Entonces, es una manera de poder decirles que una de las partes que estudiamos en esta diferenciación para poder llegar al paralelismo es la presencia del inhibidor lúpico. Siempre debe estar dentro de los criterios de diferenciación diagnóstica y descarte de las cosas por las que un paciente pueda llegar a tener prolongado un tiempo de coagulación.

En el caso del inhibidor lúpico, entonces debemos hacer este descarte de su presencia a través de la identificación de estos anticuerpos, a través de cualquiera de las dos vías. Y hoy en día tenemos una muy buena posibilidad de hacerlo a través del tiempo de veneno de víbora de Russel, que es una prueba que según las guías internacionales recientes de la Sociedad Internacional de Mostasisasis y Trombosis, debe estar siempre presente el tiempo de veneno de víbora de Russel, tanto en la prueba de screening como en la prueba confirmatoria, donde su efecto y su acción de búsqueda está un poco más hacia la vía de factor 10 de la coagulación, vía común cubriendo la parte de la vía. extrínseca. Sin embargo, debemos poner una prueba adicional, que es una prueba basada en fosfolípidos, como es el silica cloting time, eh, que es una PTT, que va a identificar la presencia de estos anticuerpos dirigidos contra los factores de la vía intrínseca de la coagulación, tanto en una prueba screening como en una prueba confirmatoria. podemos hacer detección de sensibilidad, es decir, que nos diga si está presente o no el anticoagulante lúpico o inhibidor lúpico a través de reactivos de apttansibles y eh y obviamente podemos eh hacer esta búsqueda de sensibilidad, pero a través de esto no podemos hacer la confirmación de la presencia eh de la presencia, por lo que no es lo primero tener una identificación de una PTT sensible al anticoagulante lúpico, una prueba de screening, una prueba de confirmación de la vía intrínseca de la coagulación. Entonces, es importante tener clara esta diferenciación si eh hacemos solamente el veneno de víbora de Rasel, lo estaríamos cubriendo solo el 50%. Por eso las guías internacionales nos piden que hagamos un tiempo para la identificación de inhibidor lúpico, un tiempo que me valore la activación del factor 10 y otro tiempo que me valore la vía eh intrínseca. Entonces, aquí vamos a abarcar el 100% de la búsqueda de estos anticuerpos.

Entonces, cuando pensamos en estas posibilidades que resumiendo son presencia de deficiencias reales de la coagulación, presencia de interferentes como el inhibidor lúpico o presencia de otros como los anticoagulantes o inhibidores farmacológicos, eso nos lleva a saber cómo vamos a estudiar entonces eh estas situaciones. los siguientes pasos que serían la búsqueda o identificación de una deficiencia, una verdadera deficiencia, un factor de la coagulación. Y si queremos medir los factores de la coagulación, que sería nuestro siguiente paso después de todas estas líneas de descarte, lo podemos hacer a través de dos ensayos principalmente, que son los ensayos coagulométricos, como lo que vemos en esta primera eh parte de la diapositiva, y los ensayos cromogénicos.

Los ensayos cromogénicos aplican para la búsca de deficiencias y de inhibidores en el factor 8 y el factor 9 únicamente y los demás podemos eh buscar mediantes coagulométricos. Sus diferencias están eh basadas en la forma en la que pueden generar la reacción invitro. Los ensayos coagulométricos utilizan la activación de toda la cascada de la coagulación partiendo de factores de contacto. Sin embargo, sabemos que contra esta vía de contacto hay muchos interferentes asociados a lo preanalítico, eh a la presencia del inhibidor lúpico, a la presencia de inhibidores farmacológicos que tienen un alcance incluso a factores de contacto, mientras que los ensayos cromogénicos arrancan eh un poco más avanzados en la coagulación. arrancan aquí a la mitad de la vía de la coagulación, la vía final común, en la activación del factor 10, por lo que el cromogénico arranca en esta vía común y e en esta parte de la vía no se eliminan todos los factores interferentes que pueden estar presentes en la vida intrínseca de la coagulación, lo que confiere una mayor especificidad a la medición del factor 8 y el factor nu de la coagulación, ya que estos se pueden ver eh afectados por distintas situaciones, como ya mencionamos.

Entonces, ¿cómo sucede esto para hacer una determinación de un factor 8o por un ensayo coagulométrico? Simplemente lo que hacemos es una reactivación de toda la vía intrínseca de la coagulación desde los factores de contacto en un plasma diluido que entra en contacto con un reactivo que tiene estos fosfolípidos purificados y que tiene un activador de la vía y con el agregado de cloruro de calcio se desencadena toda la coagulación hasta que podemos medir la formación de un coágulo o la formación de fibrina. Y esto se compara en una curva de referencia o una curva de calibración que podemos establecer, donde podemos establecer el porcentaje de actividad del factor 8 respecto a esta curva de referencia que se ha elaborado en el laboratorio.

El ensayo cromogénico es una prueba por detección de luz. Es un ensayo de paso de luz donde se utiliza un sustrato cromogénico que nos permite establecer la presencia o no de esta dependencia de el factor och8o de la muestra del paciente. Básicamente lo eh lo conocemos y eh lo podemos encontrar y leer en la literatura como un ensayo de dos etapas. En la primera etapa lo que hacemos es una activación del factor 10 de la coagulación. Recuerden que les mencionaba que el cromogénico arrancaba en esta vía final común. Entonces, ¿qué tenemos que hacer para arrancar la vía común? Es convertir el factor 10 en factor 10 activado y de manera indirecta lo convertimos dependiente del factor 8, de la muestra del factor de la muestra del paciente. Entonces, el paciente tiene una x cantidad de factor 8 que lo activamos a través de la adición de unos reactivos como la trombina y le adicionamos un factor nu. para que haga complejo con el factor 8, factor 9, que sucede a nivel del modelo celular y en adición de fosfolípidos y calcio logra activar este factor y lo convierte en una enzima completamente activa que podemos medir en el siguiente paso o etapa dos. Y entonces, ¿qué es? eh va a ser medir cuánta cantidad de factor 10 activado tenemos a través de un sustrato cromogénico específico que libera un color y esto nos permite saber de forma indirecta cuánta cantidad de factor 8 tiene el paciente, ya que a mayor cantidad de factor 8, mayor conversión a factor 10 activado y por supuesto mayor luz vamos a tener aquí en esta segunda etapa y viceversa.

Pero entonces hay algunas recomendaciones específicas para hacer estos ensayos de factor. Efectivamente eh están las guías recientes de la Federación Mundial de Hemofilia que nos entregan las recomendaciones y nos dicen, por ejemplo, que los ensayos cromogénicos o coagulométricos que utilizamos en los laboratorios deben estar calibrados con calibradores que hayan sido trazados y avalados por Organización Mundial de la Salud. Eh, hace muchos años se utilizaban calibradores que provenían de plasma de muestras de paciente y esto ya no es una práctica que sea muy segura. Y la expresión lleva al uso de calibradores comerciales, calibradores validados por los OMS. Eh, a su vez esto lleva a la expresión de las unidades de presencia de factor que estas ya no sean en porcentajes, sino en unidades internacionales por decilitro ante la sospecha, por ejemplo, de un paciente que tiene una alteración en el factor 8 de la coagulación.

La Federación Mundial de Oofilia nos recomienda realizar los dos ensayos para hacer el diagnóstico inicial, es decir, hacer el ensayo coagulométrico y el ensayo cromogénico, sobre todo en aquellos pacientes que tienen hemofilias leves o moderadas donde pueden pasarse eh muy fácilmente de una clasificación a otra cuando tienen valores que están muy borden de la clasificación de la hemofilia. Pero esta recomendación tan importante que nos menciona eh nos dice que ante la presencia de anticoagulante lúpico se recomienda usar reactivos de apttir e y que estos sean sensibles al anticoaguelante lúpico, porque el anticoaguelante antelúpico es uno de los mayores interferentes que tenemos cuando hacemos mediciones de factores de la coagulación. Entonces, siempre el anticoaguelo antelúpico será un interferente. Tenemos que buscar la forma y una forma de hacerlo es justamente a través del paralelismo.

Y aquí hay otra recomendación puntual que tiene que ver con el paralelismo y es que en estos ensayos de una etapa debemos usar dilusiones de la muestra que estén dentro de esta curva de calibración, pero además realizamos al menos tres dilusiones diferentes a este plasma que queremos testear para la identificación eh la eh de la realidad de una deficiencia o de un factor de la coagulación y que guarden estos dos datos claves porque eh es lo que vamos a Ver, cuando eh veamos esto del paralelismo, eh se recomienda las guías internacionales recomiendan la realización de tres dilusiones diferentes para excluir la presencia de, por ejemplo, anticoagulante lupo.

Entonces, ¿qué pruebas vamos a condensar en esto que llamamos paralelismo, que tiene que ver mucho con el diagnóstico diferencial de la hemofilia y coagulopatías que son más de origen combinado, pero en hemofilia lo usamos mucho, es tener un tiempo de protrombina, en este caso normal para el caso de la deficiencia de factor 8, vamos a tener una apttongado y un factor 8 que va a estar disminuido versus al valor de referencia al límite. de referencia y tener la presencia de inhibidores, que es el punto final del estudio de estas deficiencias de factores. Y es que a todo factor disminuido le medimos el inhibidor que le corresponda para identificar que exista o no la presencia de los inhibidores de la coagulación.

Pero entonces tenemos que entender además qué son los inhibidores en hemofilia. son anticuerpos eh de clase IGG tipo 4 que van a interferir con la función de este factor o factores de la coagulación y también van a interferir con los productos que se utilizan para el tratamiento de la hemofilia. Básicamente es el producto con el que se repone este factor que el paciente no tiene para evitar que haga sangrados espontáneos que puedan afectar, por ejemplo, sus articulaciones. Los inhibidores se consideran presentes cuando se definen a partir de un título mayor a 0,6 unidades betesda y son significativos cuando se encuentran en más de dos ocasiones presentes en momentos diferentes o analizados en momentos diferentes en un periodo de 4 semanas. Es decir, dos detecciones en 30 días van eh cada 30 días van a empezar a ser eh a ser inhibidores que son significativos por encima de este punto de corte de 0,6 según eh las guías internacionales.

Sin embargo, los inhibidores no solamente están presentes en la hemofilia congénita, sino también pueden estar en la hemofilia adquirida, que es otra causa. En la hemofilia congénita, la presencia de los inhibidores va a depender del grado de severidad. Se presentan con una alta frecuencia en la hemofilia severa, es decir, en aquellos pacientes que tienen menos de una unidad internacional por decilitro de presencia de factor 8 o factor nu, bien sea así la hemofilia A o B. Y esta búsqueda es muy importante porque va a llevar a que los clínicos puedan hacer las apropiaciones de sus tratamientos para evitar que estos inhibidores puedan ser un fuerte interferente en la respuesta que puedan tener los pacientes a los tratamientos en eh hemofilia.

Mientras tanto, en la hemofilia adquirida, pues vamos a tener eh múltiples causas que puedan llevar a la presencia de estos inhibidores. Sin embargo, un porcentaje resulta ser idiopático, es decir, no le encontramos una causa asociada. Por lo general, dentro de lo que son las enfermedades que se describen, pueden llevar al desarrollo de estos inhibidores de manera adquirida. son las enfermedades autoinmunes, las malignidades, trastornos en la piel, hipersensibilidad, algunos medicamentos y el embarazo son de las condiciones que se han descrpto y reportes de casos que muestran que pueden estar asociados a la presencia de este tipo de inhibidores.

La hemofilia adquirida tiene una grave característica y es que es un trastorno hemorrágico que primero es raro, pero es potencialmente mortal. También es causado por estos autoanticuerpos, como sucede en el inhibidor lúpico, y se dirigen específicamente contra un factor de la coagulación donde con mayor frecuencia se dirigen contra el factor 8o de la coagulación. Su incidencia es rara, pero también tenemos una alta tasa de diagnóstico por ser un trastorno autoinmune, raro, distinto a lo que es la hemofilia congénita. Y como les mencionaba, eh, es grave y potencialmente fatal. Eh, y esto tiene unas poblaciones que e a uno le ayudan porque se puede encontrar una alta sospecha de estos inhibidores, que son, por ejemplo, las mujeres alrededor entre los 35 y 40 años en el periparto, los adultos mayores que están alrededor de los 65 70 años donde presentan previamente un estado clínico normal y no tienen antecedentes familiares ni personales de tener una alteración de la coagulación que de repente aparecen con un aptolongado y con estas manifestaciones de piel eh de grandes hematomas que deben ser tratados rápidamente en el corto e corto tiempo.

Sin embargo, estos inhibidores van a tener una cinética y un comportamiento diferente. Si es hemofilia congénita, vamos a ver que lo llamamos inhibidores tipo uno. Y si es hemofilia adquirida, lo llamamos inhibidores tipo dos. La diferencia entre uno y otro no tiene que ver mucho con los aspectos técnicos de la titulación intra laaboratorio. En realidad, para detectar cualquiera de los dos tipos de inhibidor, aplicamos la misma técnica de búsqueda. Sin embargo, es mucho más difícil titular de manera más precisa en unidades betesda un inhibidor en la hemofilia adquirida porque casi que la relación un poco se pierde. Por más que hacemos dilusiones de la muestra del paciente y ponemos un plasma en reacción, siempre van a quedar anticuerpos que están por ahí sueltos, libres, que interfieren y que no alcanzamos a titular de una manera muy contundente. Distinto a lo que pasa en la hemofilia congénita, que la relación es básicamente de una unidad de anticuerpo por una unidad de factor contra la que se dirigen y allí podemos hacer una titulación que es mucho más cercana.

¿Qué pasa con estos inhibidores? es que el individuo no va a poder producir este factor de la coagulación y va a interferir con este proceso de hemostasis bloqueando la acción o favoreciendo su salida rápida de la circulación. Entonces, lo que vemos es que estos inhibidores van a eh neutralizar completamente la actividad coagulante del factor 8 y después de que reaccionan ya no se mantienen eh cuantificables, pueden perder fuerza rápidamente a medida que vamos haciendo dilusiones, sería de la muestra del paciente y esperamos que caigan en un rasgo específico para poder entregar un título al médico que le permita estimar la potencia de estos inhibidores.

Así que los inhibidores se van a clasificar de acuerdo a su potencia, también eh a su presencia y a la duración. Pueden ser clínicamente relevantes, que son estos que mencionábamos en la definición de la Federación Mundial de Hemofilia. Son aquellos que se documentan en dos ocasiones distintas por encima del título de referencia que es 0,6 en un periodo máximo de 4 semanas. Tenemos inhibidores clínicamente significativos y son aquellos que no permiten que se recupere el paciente cuando se le infunde un factor de la coagulación para suplir esta deficiencia de factor. Después de que se infunde el factor, hacemos una medición de medimos el factor 8o y si este factor es inferior a 66% después de que tomamos la muestra los 15 minutos de la infusión, decimos que el paciente es candidato a tener un inhibidor clínicamente significativo que no permite que se recupere con la apuesta del factor de reposición.

Pero no pierdan de vista que hay inhibidores transitorios. Podemos tener inhibidores transitorios como en hemofilia, tanto en inhibidores transitorios como el inhibidor lúpico que van a desaparecer en el tiempo y en hemofilia específicamente son inhibidores que inicialmente fueron positivos, pero que cuando los medimos a los 6 meses después de esa documentación inicial continúan eh a pesar de que este desafío antigénico de infundir factor para su tratamiento, estos se negativizan 6 meses después de esta documentación inicial.

La evolución de las técnicas de inhibidor también se describen en la literatura y la recomendación nos entrega hoy una literatura actualizada y es migrar de la modificación de los ensayos Betesda que nos dejó la doctora Carol Casper en 1975 y la actualidad es el ensayo modificado en Nickyen, descrito desde 1998 que mejora la especificidad de la presencia de estos inhibidores, sobre todo cuando se encuentran en títulos bajos de entre 0,6 y 2 unidades veteranas.

Entonces, para poder sacar esta titulación de inhibidores tenemos distintos tipos de ensayos. Podemos hacer inhibidores por los métodos coagulométricos, por los métodos cromogénicos, eh por métodos inmunofluorescentes y por técnicas de lisa convencional, que tenemos aquí que eh resaltar que los ensayos coagulométricos pueden ser modificados como les mencionaba con otros tipos de inhibidores como el lúpico y los farmacológicos. Entonces ahí tenemos que hacer una muy buena diferenciación. Los ensayos cromogénicos no van a tener interferencia por inhibidores específicos como anticoagulante lúpico. Los inmunofluorescentes son los más sensibles de todas las técnicas, sin embargo están limitados porque necesitan infraestructuras de inmunofluorescencia especializada y los ensayos Elisa. Nos permite detectar la presencia del inhibidor, pero no titular la cantidad de inhibidor presente. Y esta es la limitante de los ensayos de Elisa.

Entonces, la recomendación es hacer el ensayo, el ensayo Nickmen, modificado por el ensayo cuagulométrico o cromogénico según decida el laboratorio, según aplique para el tipo de paciente que se quiere analizar. Y simplemente es establecer un cálculo de las unidades betesda basados en una técnica donde utilizamos el plasma de paciente y se combina con un buffer especial que mantiene el pH de la muestra y evita el consumo exagerado del factor de la coagulación, lo cual aumenta, por ejemplo, la titulación de los inhibidores de una manera falseada. Por lo cual, en esta técnica hay que cuidar la calidad de la muestra, hay que cuidar el pH de la mezcla, hay que cuidar la incubación para que finalmente podamos obtener un resultado que sea confiable y que correlacione de una manera muy precisa con la clínica del paciente.

Esta técnica ya la hemos visto. Entonces, simplemente lo que hacemos e lo que he dicho en este en este momento es hacer un pantallazo para poder llegar específicamente a la utilización del paralelismo. que todo esto parece muy complicado, hay que tener bastante experiencia para realizarlo, pero hay conceptos claves que tienen que quedar claro que ya lo estuvimos conversando. Básicamente, después de hacer estas técnicas de dilusiones de muestras y coágulos, medimos en un analizador automatizado el factor residual, es decir, cuánto factor me queda después de que pongo a reaccionar un plasma normal con unas muestras de pacientes que han sido previamente diluidos, donde está el inhibidor. Vamos a ver qué tanto se consume en esta mezcla y posterior a esto, pues podemos establecer el cálculo a través de una gráfica semigilogarítmica o a través de la formulación de una tabla de Excel con un logaritmo que lo que se observa aquí también en pantalla nos permite expresar el resultado en unidades betesda. Se considera que el cuando se cuando queda libre el 50% del factor residual a nosotros hacer esta técnica y estos cálculos corresponden a una unidad BT.

De esta manera vamos a clasificar los inhibidores de acuerdo a ese valor o título y decimos que los inhibidores son de título alto o de título bajo. Los de título alto van a ser aquellos que superan las cinco unidades betesda, ya que actúan poderosamente y neutralizan el factor rápidamente. Y los inhibidores de título bajo van a ser aquellos que sean menores a cinco unidades betesda, donde actúan débilmente y neutralizan lentamente el factor. Estos inhibidores a su vez van a ser de alta respuesta, donde el título inhibidor rebasó las cinco unidades betesda por lo menos una vez y va a estos inhibidores de alta respuesta, según la exposición repetida de al factor, van a desencadenar nuevos inhibidores rápidamente y los de baja respuesta, aquellos de título inhibidor que nunca rebasó las cinco unidades y la exposición al factor desencadenará nuevos inhibidores. pero más lentamente.

Pero, ¿por qué toda esta historia de los inhibidores? Porque les mencionaba que pueden haber efectos combinados o presencia concomitante del inhibidor lúpico con un inhibidor específico anti8cho, es decir, que tendríamos un inhibidor inespecífico con un inhibidor específico al mismo momento y esto sí que dificulta mucho más la titulación y la búsqueda en el laboratorio para hacer este para poder hacer esta diferenciación, ¿no? En lo que observan aquí en pantalla, lo que eh encontramos es que cómo existen estas diferencias entre uno y otro, ¿no? Estas diferencias entre un inhibidor lúpico con un inhibidor antiocho. En el inhibidor lúpico, el apttasma normal no corrige, mientras que el inhibidor anti8o no corrige, pero estos tienen además un efecto tiempo temperatura dependiente. decir que para poder detectar estos inhibidores específicos debo hacer la incubación de la muestra del paciente en esta técnica de inhibidor para poder potencializar su efecto. Digamos que eh al anti8cho le gusta el calor, le gustan los 37 gr y les gustan las 2 horas de incubación. Y con esto lo que uno va a ver es que va a haber una prolongación adicional de estos efectos según el tiempo temperatura. En el eh por ejemplo en el anticoagulante antelúpico, cuando hacemos estas pruebas que tienen una gran cantidad de fofolípidos, logramos hacer una neutralización, mientras que en los inhibidores anti8, pues por más que eh por más fofolípidos que vayamos añadir a la muestra, no logramos una neutralización de los mismos.

En el anticoagulante lúpico vamos a tener una prueba específica que es el veneno de víbora de Russel, que esta prueba va a resultar positiva, que no va a tener una corrección eh cuando le adicionamos plasma normal, porque el inhibidor va a seguirse mostrando, mientras que si a un paciente que tiene inhibidores de anti8 específicamente le hacemos un veneno de víbora de Rasel, este va a resultar normal. Hay otros test que podemos aplicar como el que mencionábamos, el test específicos como el silica cloting time y en el anti8 pues es ideal cuando tenemos la sospecha de efectos combinados utilizar ensayos cromogénicos que puede eh pasar en en que puede pasar en el anticoagulante lúpico y es una de las razones por las que usamos paralelismo y es que puedan tener concomitantemente varios factores de la coagulación disminuidos. Entonces, muchas veces los médicos asocian esto a errores preanalíticos, pero es un eh pero eso es puede ser no puede ser la realidad realmente, porque puede pasar en coagulación es que varios factores de la coagulación estén disminuidos por la presencia de un anticoagulante lúpico. Lo que pasa muchas veces es que se repiten y se repiten las muestras pensando en errores preanalíticos, pero hay que pensar en la presencia de un anticoagulante lúpico ante esta situación.

Si es específico el inhibidor e contra el factor 8, lo único que vamos a encontrar disminuido será el eh factor 8. Y en el caso de la del anticuagulante lúpico, muchas veces podemos encontrar otros factores de la vía intrínseca disminuidos. Pero ojo, porque e está descrito en la literatura esto de que cuando tenemos un anti8, muchas veces encontramos únicamente el factor 8 disminuido, pero podemos encontrar pacientes específicos en los que eh no solo está el factor 8 disminuido, sino también otros factores de la coagulación. Eh, porque este antiocho es bastante potente. Eh, se ve mucho en los pacientes hemofílicos en realidad cuando se desarrolla un anticuerpo antifactor 8 muy potente que puede neutralizar su efecto puede neutralizar a otros factores. No es tan común, pero se puede observar.

Entonces, más o menos lo que puede tener uno cuando tiene el efecto de un inhibidor lúpico en los factores de la coagulación es que cuando nosotros medimos el factor con la dilución normal que traen los analizadores en general nos da bajito. Y aquí en este ejemplo, por ejemplo, dio 14. Y a medida que nosotros diluimos o aplicamos diluciones mayores a la muestra del paciente, lo que ven acá es que progresivamente el factor de la coagulación va a ir aumentando hasta que llega a una normalización. Esto hace pensar y confirma que el factor no está deficiente por una deficiencia real del paciente, sino que es una falsa deficiencia por la presencia de un inhibidor blú.

Entonces, en el paralelismo lo que nosotros buscamos es encontrar una una verdadera deficiencia de factores de la coagulación. Ante una sospecha clínica de estas deficiencias, al médico le va a interesar saber por qué las deficiencias en los tratamientos también son bien marcadas. Y no es lo mismo tratar una deficiencia real de la coagulación que una deficiencia adquirida secundaria a un inhibidor lúpico. Los tratamientos son diferentes y por esta razón cuando tenemos esta sospecha en pacientes que antes no tenían ningún diagnóstico de coagulopatía y que aparecen con deficiencia de un factor repentino o cuando aparecen con múltiples deficiencias de los factores, lo que tenemos que hacer es diluir la muestra del paciente. Y aquí, por ejemplo, pueden ver eh las tres dilusiones diferentes que nos decía antes la recomendación de la Federación Mundial de Hemofilia, tres dilusiones a esa muestra de plasma del paciente.

Entonces, básicamente basados en los puntos de calibración de la curva de calibración que les mencionaba, porque esto solamente aplica a los ensayos eh cuagulométricos. El paralelismo no se puede hacer en los ensayos cromogénicos, solamente en los cuágulométricos y basados en esa curva de calibración que también les mencionaba que hacemos cada vez que hacemos un factor 8o. Nosotros al hacer en el laboratorio la determinación del factor 8o, tenemos que tener una curva de calibración creada para poder extrapolar el valor del paciente y poder obtener el valor del paciente. Entonces, lo que vamos a observar es cómo se comportan estas dilusiones de paciente. Si las dilusiones del paciente se forman, se portan de manera paralela a la curva de calibración y de ahí viene el término paralelismo, si están de manera paralela a la curva o si estas dilusiones del paciente atraviesan esta curva de referencia y se cruzan en algún punto.

Entonces, aquí eh aquí podemos desprender el término de hay paralelismo cuando el paciente se porta igual que la curva o no hay paralelismo cuando el paciente atraviesa la curva de calibración. Básicamente, cuando se porta paralelo a la curva, decimos que existe una verdadera deficiencia de la coagulación. Y cuando el paciente atraviesa la curva, decimos que existe un efecto interferente que debemos de buscar en estos pacientes. Entonces, o es eh déficit de factor o es la existencia de una interferencia por un inhibidor. Lo que se observa ahí en la en la imagen es la calibración la curva de calibración de el del factor y la curva del paciente, ¿no? eh sistemas automatizados me permiten e ya de por sí lo hacen automáticamente. Yo no es que tenga una función específica para lo que es la determinación de factor 8 y factor 9, porque es para lo que se utiliza eh el paralelismo directamente lo hace, ¿no? porque va a extrapolar lo va a comparar la curva que se va a generar por estos tres puntos de dilusión del paciente con la curva de calibración para el factor 8. Entonces, vamos a ver si estas se comportan, como decíamos, de forma paralela, podemos decir que es una real deficiencia de factor y si se cruzan en algún punto tenemos la interferencia por un inhibidor.

Entonces el paralelismo de factores lo aplicamos en estas tres situaciones que se observan aquí. Primero la en la deficiencia de factores sin clínica hemorrágica, las deficiencias combinadas de factores, factor 8 y factor 9. Es una deficiencia rara, pero se puede eh encontrar y en la presencia de anticoagulante lúpico positivo más la deficiencia de eh factores. Entonces, e hay que hacer siempre la búsqueda de este paralelismo cuando tenemos un paciente que tiene un anticoagulante lúpico positivo y que adicionalmente tiene factores de la coagulación disminuido. en ellas en estas tres situaciones que es donde debemos aplicar el paralelismo.

¿Para qué sirve? Para aumentar la calidad de los resultados de estos ensayos de factor y para poder revelar las posibles interferencias que pueden afectar estos test de la coagulación, donde ya mencionamos los tipos de inhibidores que pueden estar eh presentes. Entonces, ¿cómo utilizamos este paralelismo? Tengan en cuenta estas cuatro recomendaciones. La primera de realizar de dos a tres dilusiones. E lo correcto es utilizar tres dilusiones del plasma a analizar, que el resultado de una muestra diluida tiene que estar dentro del rango de linealidad para los tests. Los resultados de varias dilusiones del test deben mostrar paralelismo con resultados obtenidos con un plasma calibrador. Y las dilusiones de la muestra de plasma y las realizadas con plasma calibrador deben ser tomadas.

Dentro del rango del rango de parametrización establecido por el fabricante. ¿Cómo entregamos los resultados a los médicos? Pues esto va a tener una media que es como el 100% de los resultados diluidos y saca un promedio de estos tres resultados que han sido replicados, diluidos y nos va a sacar una media de los resultados corregidos donde saca el porcentaje de cada dilusión y luego saca como un factor de corrección incluida su dilusión para a su vez sacar los cálculos de los resultados que hemos corregido con el eh paralelismo.

¿Qué es importante aquí? Es que no existen guías oficiales que nos digan acerca de cómo del uso del paralelismo, eh una guía como si como si existen para las guías del anticoagulante lúpico, las guías de Bonilbrand, las guías de hemofilia. No existe ninguna guía oficial eh eh como tal. Se basa en análisis matemáticos o estadísticos que nos entregan, sí, obviamente, literatura reconocida, indexada de varias revistas que nos pueden dar como el aval del uso y que como se han mostrado en los distintos pacientes y casos se analizan a nivel mundial, pero son análisis matemáticos y estadísticos.

Y entonces aquí básicamente se comparan pendientes de las curvas, se chequean algunos valores como el R cuadrado. Eh, el R cuadrado vamos a ver que está incluido dentro de lo que son las curvas de calibración y es el que tiene que estar aproximadamente entre 0,96 y 0,99 para validar una curva de calibración. En los autoanalizadores, eh se chequea, por ejemplo, la varianza para mirar cómo cambian estos recálculos entre primer valor y los valores diluidos. Pero básicamente estos cálculos matemáticos y estadísticos, por lo que eh cumplir con los cuatro criterios que mencionábamos anteriormente eh esté todo dentro de las valoraciones de la casa matriz, dentro de la linealidad, dentro de la curva de referencia, que es lo que nosotros mejor podemos hacer para garantizar los eh resultados.

Cuando nuestros pacientes entonces tienen estos interferentes, ustedes van a ver a encontrar una muestra de un paciente que tiene múltiples interferentes como el inhibidor lúpico, que hace que se prolongue la PTT, pero que cuando yo diluyo en muestras adicionales o muestras seriadas vamos eh como casi que quitando el efecto inhibidor lúpico. Y es como decir, "Permiso, señor lúpico." Por un lado, permite, permítame medir el factor real que tiene el paciente y se recalcula el valor de concentración del factor. Una vez que al hacer dilusiones seriadas, al hacer la dilusión con un buffer, lo que hago es eliminar el inhibidor. Entonces, me va a dejar libre el factor que quiero determinar. Entonces, básicamente lo que tenemos es en este ejemplo una muestra de un paciente que no tiene inhibidor.

Las tecnologías hoy en día de manera automatizada pueden hacer el paralelismo. Las tecnologías que no lo tienen, eh lo que hacemos es hacer las diluciones de estas muestras de paciente por fuera del analizador y simplemente ponerlas en el analizador ya diluidas para que hagan la medición del factor de la población, pero requiere, sin embargo, los cálculos pues ya no podrán ser automatizados y no van a tener que ser eh calculados los valores promediados manuales y las diferencias por los coeficientes de variación entre una determinación y la otra cuando son automatizados es más fácil. Saca todos los valores que les mencionaba, el valor medio, el 100% valor de calculado porcentual de las dilusiones y también saca los coeficientes de variación que le permiten eh establecer las diferencias entre una y otra medición. Entonces, adicional a esto, eh puede sacar como unos mensajes de alarma o unos avisos donde dice que hay una buena, alguna fuente de error o interferencia que el laboratorista debe analizar y saca estos valores primarios y los valores corregidos que nos permiten saber de manera visual mucho más rápida las diferencias entre estas dilusiones.

Entonces, eh aquí en este caso, por ejemplo, eh es una muestra sin inhibidor. Tenemos una línea verde que es como la curva de referencia y la línea azul que es la línea paralela de paciente, como se ve que se comporta paralelo, es decir, que es una verdadera deficiencia de el factor. Distinto a lo que pasa en esta gráfica, que ven ahí es un paciente que efectivamente tiene un inhibidor. Aquí genera unas alarmas de paralelismo donde dice que una o más dilusiones están excediendo estos valores estadísticos y estas medias y varianzas dice como que tiene que analizar y cuando uno mira la curva lo que ve es que la curva de calibración que está completamente atravesada por los valores de los tres puntos de dilusión que se analizaron en este paciente, entonces uno dice aquí no hay paralelismo y debemos buscar el factor interferente. Siempre vamos a tener una clínica que nos va a ayudar, obviamente.

¿Qué es lo que podemos llegar a ver en estos resultados? Además de los valores numéricos, matemáticos y estadísticos, también permite evaluar estas gráficas o estas curvas de calibración. Aquí muestra entonces el valor inicial, el valor corregido. Digamos que el valor corregido es bastante similar entre ellos. Lo mismo pasa en este ejemplo de esta parte donde acá está la alarma. Podemos ver la alarma en el reporte, eh podemos ver el comportamiento de la curva y podemos ver los valores corregidos. ¿Cuál es el valor que vamos a reportar? Pues el valor eh a reportar la media porcentual de los valores corregidos donde ya no va eh a probar eh nos va a probar que van ascendiendo a medida que se diluye la muestra del paciente y que las variaciones entre ellos son aceptables dentro de la variación, no puede ser más del 15% entre una y otra dilución.

Entonces, acá directamente nos está eh informando que las curvas se cruzan y que existe la presencia de un interferente. Y cuando nosotros hacemos las dilusiones, como se observa en en la imagen, vamos a ver que esas dilusiones e valores e valores con distintas dilusiones, las dilusiones van aumentando el porcentaje. Entonces, nos quiere decir que hay la presencia de un inhibidor y nos salen estas alarmas donde nos indica que hay una alteración en estos valores de dilusiones. Estos son otros dos casos de reportes reales de paralelismo.

Entonces, lo que ven aquí es un paciente que es completamente paralelo, es decir, reportamos tranquilo la deficiencia del factor, al igual que en el otro ejemplo, que vamos a observar en en este caso que los valores de las dilusiones por ser deficiencias de factores no hay mucha diferencia entre ellas. O sea, yo no tuve que eliminar nada del medio para poder observar un comportamiento correcto de lo que estoy determinando, sino que eh en este caso no hay inhibidor y en todas las dilusiones donde se realiza la muestra voy a obtener valores prácticamente parecidos, que no es lo mismo que sucede en el inhibidor. El inhibidor va a comenzar con un valor de factor muy bajo, pero nosotros hacer la dilusión, ese factor va quedando libre y voy a poder determinarlo de forma correcta.

Sin embargo, existen eh algoritmos, diagnósticos, eh guía donde más se publican estas concomitancias de inhibidores y estas interferencias en las hemofilas adquiridas. Es donde más algoritmo podemos encontrar. Y lo que quiero mostrar de e de acá es que como todo parte del hilo conductor, que es un tiempo de coagulación prolongado de manera aislada. En este caso partimos de una historia clínica del paciente, si tiene un sangrado que se ha explicado o inexplicado, que descartamos la presencia de estos anticoagulantes farmacológicos, como ya vimos, la heparina y que seguimos con este paso que es el PTT, si eh corrige o va a seguir prolongado. Si corrige, consideramos la deficiencia de factores de la coagulación, donde lo más común que medimos es el factor 8o y si el factor 8 está normal podemos considerar la presencia de anticoagulante lúpico y que sea la causa de la prolongación de este PTT.

Pero el factor 8o puede estar reducido y reducido dependiendo de la clínica del paciente, si el paciente sangra o no. Si el paciente no sangra, si el paciente tiene este factor 8 reducido y no sangra, pues nos eh vamos a estudiar el anticoagulante lúpico, pero adicional a confirmar la deficiencia por un ensayo cromogénico. También recuerden que el ensayo cromogénico no tiene interferencias para anticoagulante lúpico. Entonces eh yo tengo el anticoagulante lúpico más un ocho bajo, pues le mido el factor 8 con un ensayo cromogénico que me quita la interferencia del anticoagulante. Sin embargo, si el paciente sangra, es muy importante consultar o interconsultar con los especialistas, en este caso los hematólogos, para que ellos puedan hacer esta confirmación diagnóstica, pedir los ensayos de inhibidores y dar el tratamiento apropiado que corresponda a estos pacientes.