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Buenas, bienvenidos todos de nuevo a otra clase del curso de métodos separativos. Hoy vamos a hablar un poco, este, sobre otro tema distinto. En realidad, ya no es tanto sobre la parte práctica, sino que vamos a hablar un poco acerca de la eficiencia de la cromatografía.
Vamos a tratar un poco este tema en general. En un primer momento, la mayoría de los conceptos que vamos a ver hoy van a ser, este, digo, intercambiables para trabajarlos ya sea para GC o para HPLC. Sin embargo, eh, la mayoría de los conceptos que vamos a ver al final de la clase están principalmente volcados a la parte de la cromatografía líquida y no tanto sobre la, la, la cromatografía gaseosa. Okay.
Bien, un poco lo que vamos a ver en, en la clase de hoy. Vamos a hablar sobre, básicamente, sobre tres temas. Uno, eh, ¿qué es la eficiencia? ¿Qué, qué hablamos cuando hablamos de eficiencia? Y también, ¿cómo medirla? O sea, formas de estimar la eficiencia de, de un proceso. Okay. La, la segunda parte es, bueno, ¿cómo vamos a mejorar un poco la, la eficiencia de nuestro proceso cromatográfico? Y vamos a, a terminar la clase esta con una discusión acerca de la, la teoría cinética de la cromatografía. Bien.
Okay, entonces, viene una cosa. Cuando hablamos de eficiencia, sí, esto, esto que tenemos en la transparencia acá es una definición sumamente general. Sí, es una definición que se aplica prácticamente a cualquier proceso que vayamos a usar. Y es eso que podemos definir la eficiencia como la rel, la relación entre los recursos utilizados para un determinado objetivo y los logros conseguidos con el mismo. Okay. Es básicamente una, decir que un proceso es más eficiente que el otro es que si nosotros podemos lograr un mismo objetivo utilizando menos recursos, estamos siendo eficientes. Bastante sencillo. En el, en el, en el modo inverso, si nosotros podemos lograr más objetivos con, con menos recursos, también. No, no es exactamente lo mismo, no estamos diciendo lo mismo en ese caso. Pero bien, este, y eso es lo que, lo que tienen escrito acá en la parte de abajo, que se, es eficiente cuando se utilizan menos recursos para lograr un mismo objetivo o cuando se logran más objetivos con los mismos o con menos recursos. Me acabo de dar cuenta que tengo un puntero rojo y que se me ocurrió poner todas las transparencias en rojo, por lo que el puntero va a estar como complicado de ser visto, pero se ve, se ve. Okay. Pero bueno, esta definición de, de eficiencia es una cosa bastante general, por sobre todo, sí, lo aplicable a cualquier proceso.
Bien, ahora, ¿qué pasa cuando nosotros vamos a la parte de, de trabajar justamente sobre cromatografía? ¿Cómo podemos mejorar una separación? Acá tenemos un cromatograma. Los cromatogramas nos sirven pila porque son una forma, digamos, es la forma visual de ver los resultados de una cromatografía. Nosotros hemos visto que las cromatografías dependen de, de un montón de procesos de interacciones, este, y todo eso se ve reflejado después en un cromatograma. Nuestra forma de evaluar lo que pasa, sí.
Y ahora, nosotros mirando un cromatograma como este, podemos ver una forma rápida y concisa muchísimas cosas. Para empezar, podemos ver que, que no es una buena cromatografía la que tenemos ahí. Sí, hay un montón de cosas que no cuadran dentro de todo lo que ya vimos que debería tener un, un lindo cromatograma. Para empezar, tenemos señales que están superpuestas, por ejemplo, como el pico E con el pico F. Sí, estos picos no, no se encuentran resueltos. Tan bien superpuestos el G y el H están bien superpuestos acá. Esto que tenemos acá sería el frente del disolvente, no nos estaría importando lo demás, más o menos estaría saliendo. Pero a su vez, tenemos, ejemplo, el pico G y el pico H son picos sumamente anchos también, y estamos viendo tailing bastante de esos picos. Sí, no es un buen cromatograma en general. Todo eso lo podemos ver aquí. Tenemos una separación deficiente, picos anchos, no son simétricos, no es una buena separación.
¿Qué sería para nosotros mejorar esto? Lograr algo, algo mejor que esto. Bueno, pasar a un sistema como este. Okay. En el cual nosotros venimos de, de tener montón de cosas que no se resolvían, ahora tenemos toda una serie de picos resueltos. Sí, tenemos todo un sistema con buenos picos, los picos son mucho más simétricos, los picos están correctamente separados, no hay picos, este, superpuestos uno sobre el otro. Esto vendría a ser para nosotros una separación óptima. Como dijimos, picos finos, simétricos, buena separación, todo copado, maravilloso.
Ahora, este cromatograma, por ejemplo, se puede optimizar más. Hay lugar para una, una mayor optimización con respecto a lo que ya tenemos. Y, bueno, o sea, siempre hay lugar para mejoras, decía por ahí, y efectivamente así es. Siempre hay lugar para tener alguna mejora. Por ejemplo, este, en este caso, nosotros, si ustedes miran el tiempo, nosotros tenemos un cromatograma que está demorando alrededor de 15 minutos. Probablemente nosotros podríamos lograr que esa corrida fuese más corta y seríamos más eficientes, logrando que esto se resolviera de igual manera o con una resolución igualmente aceptable en menos tiempo. Okay.
Bien, ahora, ¿cómo medimos nosotros experimentalmente la separación entre, entre varias cosas? Bueno, hay, necesitamos una forma de, de poder establecer, de decir, bueno, esto sigue manteniendo, digamos, bueno, la parte del tiempo la podemos ver claramente, ¿no? Si decimos programa es más corto, eso se ve claro. Ahora, ¿cómo mantenemos la idea de decir, bueno, esto todavía está resuelto? No, siempre tenemos el parámetro de la resolución. Sí, el parámetro de la resolución es una magnitud que nosotros tenemos, es bastante buena, que nos permite de cierta forma medir la eficiencia de nuestro sistema. Si nosotros todavía hemos todos nuestros picos resueltos, podemos decir que estamos teniendo una buena eficiencia. Okay.
Este, entonces, esto es lo que tenemos acá, nuestro parámetro de resolución. El parámetro de resolución ya lo vimos anteriormente, esto es más o menos un recordatorio. Nosotros vemos que este, nuestro parámetro de resolución básicamente se basa en dos cosas importantes. Entre dos picos que tenemos, ¿cómo medimos la resolución? Necesitamos la diferencia entre el tiempo en el que eluye cada uno de esos picos y el ancho de los picos. Sí, medimos la separación entre esos dos picos y cuánto espacio están ocupando cada uno de ellos, y eso es lo que podemos ver claramente en la ecuación esta que tenemos acá arriba. Okay.
Bien, ahora, ¿qué factores son los que están afectando esta resolución y, y cómo podríamos mejorar esta resolución? Okay. Para ver todo ese tipo de cosas, este, para poder establecerlo sobre, en el, digamos, en un sistema macro, es necesario pensar en una teoría acerca de la cromatografía. Okay.
Bien, y acá es donde pasan a jugar Martin y Synge. Martin y Synge plantean este, la, la teoría de los equilibrios sucesivos o la teoría de los platos teóricos. Okay. ¿En qué se basa esta teoría? En la teoría esta, básicamente se basa en comparar a una columna cromatográfica con una columna de destilación. Ustedes probablemente se acuerdan de cuando hablamos de una, hablaron de una destilación fraccionada en, en el laboratorio de química orgánica. Sí, en el cual nosotros veíamos, teníamos una columna de destilación y nosotros, a medida que va evaporando el disolvente desde un recipiente, eso condensa y vuelve a generar una nueva ebullición en un punto más alto, y así nosotros íbamos, este, haciendo como múltiples destilaciones, lo que mejoraba la, este, la pureza del destilado que se obtenía. Sí. Bueno, entonces, en este caso, en un sistema parecido, la cromatografía la describimos como numerosas capas contiguas y estrechas. En cada uno de esos puntos, establecemos un equilibrio. ¿Cuál es el equilibrio que tenemos esta vez? Bueno, no es una condensación y una nueva ebullición, sino que es el equilibrio entre los analitos entrando a la fase estacionaria y volviendo a la fase móvil, y así sucesivamente. Okay. Esto, vimos una, vieron una cosa similar en realidad en la clase anterior, que la vieron como uno.
Bien, a semejanza de como se decía con la destilación, la eficiencia la podemos cuantificar entonces con el número de los platos teóricos, que va a ser el número N. Okay. Este, el número N, el número de los platos teóricos, venía justamente también de, de la, que es algo, es un término que se utilizaba en las, en las destilaciones fraccionadas por las columnas de destilación. Sí, y una vez que uno define el número de platos teóricos, que en el caso justamente de las destilaciones era el número de equilibrios que se iba dando y que en su momento se le llamó platos teóricos, eran los puntos donde se daban esos equilibrios en los cuales teníamos la, la condensación y la nueva ebullición. Y como decía, se llamaba platos porque las columnas de destilación tenían como sistemas como platitos que se iban formando. Entonces, por la forma, este, eso se van dando son los puntos en los que se van dando distintos equilibrios y se lo toma de esta misma manera en la cromatografía. Es una, una extrapolación. En la parte donde tenemos un equilibrio, se considera que tenés un equilibrio entre la fase móvil y la fase estacionaria. Sí, lo que se está dando la separación. Y después, como ya definimos que hay una cosa que se llama los números de platos teóricos, que es el valor N, también vamos a definir que ese plato teórico va a tener una altura, la altura equivalente a un plato teórico, que va a ser H. Okay, que es la distancia de esa columna en la cual está dándose ese equilibrio. Okay. Y por consiguiente, H se define como esta ecuación que tenemos acá. Sí, donde L es el largo de la columna. Okay. Claramente, o sea, solo podemos ver si una determinada columna tiene número de platos teóricos, la altura de ese plato teórico va a tener que ver con el largo de la columna. Está todo relacionado. Que eso también se le decía la altura del plato teórico porque, claro, las columnas de destilación siempre están colocadas verticales, entonces por eso se medía la altura de esos platos teóricos.
Bien, ahora, ¿cómo mejoramos entonces la eficiencia de nuestro sistema? ¿Cómo mejoramos que nuestro sistema sea más, más eficiente? Dentro de todo lo que nosotros vamos a querer, de todo esto, es mejorar la separación de alguna manera. Y la eficiencia cromatográfica en general la podemos aumentar con el factor N, con nuestro número de platos teóricos. Okay. Al aumentar, sí, que en general el factor N puede ser en el orden de, de cientos de miles, eso lo vamos a ver más adelante también. Sí, tenemos distintas opciones. Si nosotros, por ejemplo, tenemos un número de platos teóricos, no, nosotros tenemos, por ejemplo, en este caso, seis platos teóricos. Estos no son justamente platos teóricos, son platos comunes, pero les vamos a llamar teóricos a esto. Son los clásicos platos fondos. Si tenemos seis platos teóricos en un largo L cualquiera sea, y nosotros tenemos una determinada, digamos, separación con ese sistema, si nosotros queremos volverlo más eficiente, queremos mejorarlo, como yo les decía, queremos aumentar N. La primera opción es directamente aumentamos el largo. Okay. Si nosotros aumentamos L, como lo vemos en la ecuación de acá arriba, si nosotros aumentamos L, N va a aumentar. Supongamos entonces que tenemos el doble de largo en nuestra columna, tenemos 12. Entonces pasamos a tener 12 platos teóricos en nuestro sistema. Maravilloso, tenemos el doble de platos teóricos y es todo genial. Ahora, está todo muy bien, pero eso produce una desventaja, porque si nosotros aumentamos el tamaño de nuestra columna, de nuestro sistema cromatográfico, lo que vamos a tener son tiempos de análisis más largos también. Okay. Y eso nos va en detrimento en cierta forma de la eficiencia, y aparte eso no puede producir un, un gasto excesivo de disolventes, sí, lo cual no es positivo de esa forma. Pero bueno, mejoramos entonces la cantidad de platos teóricos, podríamos mejorar la resolución de cierta forma.
Ahora, ¿cuál es la otra opción? Si nosotros no queremos aumentar el largo, podemos hacer otra cosa. Podemos disminuir el alto. Disminuimos H. Si disminuimos el factor H, nuevamente debería aumentar N. Entonces, si ahora en vez de trabajar con nuestros clásicos seis platos teóricos, trabajamos con seis platos teóricos que son más finitos, nosotros estamos trabajándolo en una columna de largo L sobre dos. Entonces, lo que nos lleva a eso es que si nosotros tenemos nuevamente nuestra columna L, pero con una altura de plato teórico de la mitad, tenemos el doble de platos en el mismo tamaño, y ahí tenemos mayor resolución, pero con el mismo tiempo de análisis. Okay. O sea, que una de las cosas que está buena para poder mejorar la separación es poder mejorar el poder separador de nuestra fase estacionaria en sí. Nosotros queremos poder mejorar esa fase.
Bien, la teoría de los platos teóricos también, de cierta forma, nos permite a nosotros explicar la forma gaussiana que tienen los picos cromatográficos. Sí, eso lo vimos en, en la, en la clase de, de principios de cromatografía, que los picos idealmente son gaussianos. Okay. Esto se debe básicamente al desplazamiento que tienen los analitos, sí, en donde vamos a tener, este, una distribución relativamente homogénea alrededor de un máximo de concentración. Y esa distribución que nosotros tenemos, no, este, es nuestro máximo de concentración acá arriba, nuestra distribución que está hacia los lados está dada por la varianza que tenemos en ese caso. Okay. Como nosotros suponemos que, que nuestro cromatograma tiene una forma de pico gaussiano, bien, vamos a definir H en función de la varianza. Okay. Y lo relacionamos a partir de esta ecuación, en la cual tenemos, este, la altura, a la, W sería, perdón, la altura no, es el ancho del pico a la mitad de la altura. Si supongamos que la altura, un 100% de la altura es acá, esta es la media altura, y tenemos el ancho del pico acá, el ancho del pico multiplicado por este factor por la varianza, sí, que está acá, y lo podemos relacionar de esta manera, donde H es igual al cuadrado de la varianza sobre el largo. ¿Por qué lo medimos? El ancho del pico se tiende a veces a medir a la mitad de la altura en general, porque es más fácil experimentalmente que medirlo sobre la base. En la base, en general, es más difícil medir los anchos de los picos porque es más difícil determinar dónde empiezan y dónde terminan. Okay. Porque a veces no se sabe bien cómo la tienden a decaer, en una forma casi que sobre la línea de base, a veces no se sabe dónde terminan los. Sí.
Bien, entonces, a partir del, del desarrollo teórico en sí de la, de los platos teóricos, bien, se puede llegar a una ecuación para, en la cual se puede determinar el número de platos teóricos a partir de parámetros experimentales. Parámetros que podemos medir en el mismo cromatograma. El desarrollo teórico, este, yo les decía que está marcado acá con un asterisco. Eso, si quieren, lo pueden ver en, en los, los libros clásicos de química analítica. Por ejemplo, en el, el Skoog, en la edición novena, creo que es la última, está en el capítulo 31. Uno, creo que en la que está en biblioteca está en el capítulo 26, si no me equivoco. Pero eso lo pueden buscar en cualquier libro de, de química analítica. Es, este desarrollo está. No viene al caso tampoco todo el desarrollo para la ecuación, pero lo interesante de todo esto es que veamos que el número de platos teóricos lo podemos obtener a partir de los parámetros experimentales, que son cosas que podemos medir. Y la otra cosa que es importante, esto es el segundo punto acá, que esto se define para una columna y para un determinado analito. Sí, si ustedes miran acá, el nuestro número de platos teóricos va a estar definido por el ancho del pico y el tiempo de retención, básicamente dos parámetros que podemos extraer fácilmente. En este caso, tenemos el ancho del pico en la base o el ancho del pico a la mitad de la altura, como yo les decía, es una medida más exacta. Okay.
Bien, y acá, como les explica acá abajo, N y H se van a definir para cada analito en particular. O sea, que cada analito nos va a dar que tiene un número y una altura de platos teóricos diferentes. Sí, y eso va a ser para unas condiciones determinadas de fase móvil y una separación isocrática e isotérmica. O sea, que no modificamos fase móvil, no modificamos la temperatura. Okay. Eso es, es bien importante. Si nosotros modificamos factores, va a cambiar el número de platos que, que puede llegar a tener.
Bien, esa es básicamente la ecuación que vamos a, a terminar trabajando más, es la que se usa más, este, más seguro, porque lo, como yo les decía, más es más certero medir la altura de pico, no en la base, sino cualquier otro lado.
Esto que tenemos acá es, este, una hoja de control de calidad de una columna cromatográfica. Esto es una, una columna de HPLC. Acá en la descripción, ustedes pueden ver que es una columna modelo Luna de 5 micras con un relleno de tipo C18 por Dec Armstrong. Okay. Y que tiene un tamaño de 150 por 4,6 milímetros, este, la columna completa. Okay. Eh, esto que nosotros vemos acá es el, un análisis inicial que viene con la columna. Cuando uno compra una columna, dentro de la columna, en general, viene un, una hoja en la cual se, se le corre un análisis con estándares a la columna en la fábrica y se lo mandan a uno para mostrarle lo lindo que separa esa columna. Entonces, uno mira sus picos ahí, dice, pero qué lindo cómo se para, mira estos picos que da. Después, uno lo prueba con los que tiene en su casa y le dan espantosos. Es como cuando uno mira a cualquiera cocinando en la televisión, siempre le salen las cosas del horno y son un disparate, y vos sacas el que yo tuyo y está todo hundido y está quemado y está todo mal. Bueno, pasa lo mismo con las columnas cromatográficas. Te lo mandaron, este, es como el que sale en televisión. Después a vos te va a salir otra cosa, pero probablemente si usas la misma mezcla de estándares, te queda una cosa bastante parecida. Sí, pero lo importante de todo esto es el parámetro que está acá arriba. Ahí arriba les marca una eficiencia que está marcada en platos teóricos por metro de columna. Okay. Y nos da un número de 75,567 platos por metro, definidos para el pico del naftaleno. El pico del naftaleno, acá les dice que el tiempo de retención es 7,1 minutos, es el último pico, este, que está acá. Cuando uno lo mira así, dice, qué columna, mira 75,600 platos teóricos, una cosa. Pero no nos olvidemos que también está marcado en platos por metro, y nuestra columna no mide 1 metro, nuestra columna mide 15 cm. Sí, entonces, la cantidad de platos teóricos que realmente nosotros tenemos efectivamente usando para nuestro pico de, del naftaleno, en este caso, no es 75,600, van a ser menos. Okay. Pero bueno, para qué también nos sirven, este, este tipo de análisis que a nosotros nos muestran, no es simplemente para pavonear que puede dar muy lindas cosas la columna con, con una mezcla de analitos. Sí, también nos sirve para comprobar si nuestra columna está en buenas condiciones y si se mantiene en buenas condiciones en el tiempo. Sí.
Acá tenemos el, este es el mismo análisis. Acá tenemos en el costado las, las condiciones de análisis. Okay. Y acá abajo están realmente todos los demás factores de, de trabajo. Importante, acá está marcada la eficiencia, que vendría a ser nuestro número de platos teóricos. Ahora sí, expresados para cada uno de los analitos, ya no por metro de columna. Sí, si ustedes se fijan, el número de platos teóricos para el naftaleno es de 11,350, lo cual está bastante bien, es un número bueno de plato teórico, lindo número. Okay. Pero distante de nuestros 70,000 platos que teníamos por metro de columna. Okay.
Bien, hay otras cosas interesantes también en base a este, a este cromatograma. Si ustedes miran, hay un pico pequeño primero de 1,31 que corresponde a uracilo. Sí, el uracilo es un compuesto que se usa muchísimo para, para la parte de calificaciones de columna, porque el uracilo es un compuesto que no tiene prácticamente retención en, en los sistemas de fase reversa. Sí, y como no tiene retención en los sistemas de fase reversa, no, no tiene interacción con la fase estacionaria, se mantiene siempre en la fase móvil. Entonces, se usa como un marcador del tiempo muerto. Okay. Se usa como un marcador de un compuesto que no se retiene nada en la columna, sería casi que como fase móvil, pero sabemos en qué momento sale y lo podemos corroborar con el tiempo de la inyección. Okay. Bien, este, eso, eso es un dato anecdótico y super interesante.
Después, aparte de los factores de eficiencia, está el tema de la simetría, si, que es un factor que está acá atrás, ustedes lo pueden ver. Este es el valor de asimetría de los picos. Este es otro factor que es importante para medir un poco la, la eficiencia de las columnas, porque nos permite ver en realidad qué tanto se deforman esos picos. Sí, y bueno, yo les comentaba hoy, para qué aparte nos servía este tipo de análisis que uno tiene. Bueno, ¿cómo sabemos si nuestra columna se mantiene en buenas condiciones a medida que nosotros la vamos usando? Nosotros nos llega una columna, compramos una columna nueva, la abrimos, vemos este, este es maravilloso. Este, en general, es una, es también una buena política el que cuando uno recibe una columna de este estilo, hace de vuelta el análisis para entonces repetir que esto da igual a como salió de fábrica y no vaya a ser que en el viaje se haya baqueteado un poco, la hayan golpeado, le hayan puesto la caja de los elefantes arriba, cualquier cosa de esas que puede dañar las columnas durante el viaje. Pero a su vez, después de los repetidos usos que uno le va dando a la columna cromatográfica, también está bueno repetir este análisis y verificar si la columna se degradó o no con el tiempo, con el uso. Sí, y si todavía están en unas condiciones similares a las condiciones iniciales. Originalmente, los fabricantes con las columnas les mandaban un balche en el cual tenían todos esos analitos y teníamos la mezcla tal cual y la pinchábamos y el resultado manteniendo las condiciones que tienen ahí. Hoy en día, este, estamos ahorrando en ese tipo de cosas, ya no nos mandan más nada. O sea, le mandan la columna pelada y todo lo demás está online. Bien, gracias. Pero no tenemos por qué usar necesariamente eso. Entonces, hay un montón de otros tipos de mezclas desarrolladas para calificar columnas. Sí, acá les estamos mostrando uno que, que trabajamos nosotros a veces, que es el recomendado por, por la NIST. La NIST es la National Institute of Standards and Technology, que como lo pueden ver acá, escriben con letras góticas, y cualquiera que escriba con letras góticas es un organismo respetable. Sí. Bueno, la NIST, ellos desarrollaron una mezcla de estándares que utilizan para calificar columnas. Nosotros podemos probarla con esta y con el tiempo vamos probando a ver cómo, este, va cambiando esa columna a lo largo del tiempo. Si ustedes ven, la mezcla de estándares contiene uracilo, que es lo que yo les comentaba, se usa un marcador del tiempo muerto. Después hay una mezcla de, de tolueno y etilbenceno, que son una mezcla de compuestos homólogos de cadena. Sí, eh, son una cadena hidrofóbica completamente y que se homologa en un carbono. Eso es un típico medidor del, de la retención en, en sistemas de fase reversa. Sí, siempre vemos que el que es un poco más lipídico debería retenerse más, entonces el etilbenceno debería retenerse más que el tolueno en todos los casos. Por otro lado, la quinizarina, este, el compuesto que está acá abajo, la quinizarina es un quelante de metales. Sí, ya que este, este tipo de sistemas que nosotros vemos acá son fuertes quelantes de metales, entonces la quinizarina interacciona con residuos metálicos que puedan haber en nuestra columna. Y de dónde vienen estos residuos metálicos, en general, los residuos metálicos siempre vienen de impurezas de la sílica. O sea, es algo que viene en la fabricación de la sílica. Si nosotros usamos una sílica que no es muy pura, puede tener trazas de metales. Okay. Y al tener trazas de metales, esos metales van quelando a la quinizarina y la retienen de diferentes maneras dentro de, de, de la columna. Y eso es lo que nos da distintas formas en los picos que nos permite evaluar cómo está la cantidad de metales que tiene. Y por otro lado, contiene amitriptilina. La amitriptilina es este compuesto que tenemos acá, es una amina. Las aminas, obviamente, interaccionan fuertemente con, con los residuos ácidos y particularmente se utiliza para medir, este, la presencia de grupos silanol, grupos silanoles libres. Los grupos silanoles libres son, son, este, relativamente ácidos y, y claro, ¿de dónde vienen estos silanoles libres? O una de dos, o pueden venir de, de digamos, que la columna no tuvo un silanizado lo suficientemente extensivo como para cubrir toda la columna, o lo más común que pasa con las columnas es que con el uso se van degradando los grupos silanol, este, perdón, las cadenas silanizadas, estas se van hidrolizando, dejando los silanoles libres. Okay. Y eso es lo que produce es que aumenta la actividad ácida de nuestra columna y eso se puede medir con la amitriptilina. Generalmente, la amitriptilina es el pico grande, este, que vemos acá, que puede dar picos relativamente simétricos hasta picos con muchísimo tailing, que marcan una alta actividad de grupos silanoles. Sí.
Bien, ¿qué más podemos hacer midiendo nosotros los picos? Bueno, hay muchísimos factores que nos permiten medirlos. Hoy hace un ratito hablábamos del factor de la asimetría, que nos marcaba. Hay dos factores que se utilizan mucho que son el de simetría y asimetría. El factor de simetría y asimetría básicamente es lo mismo, pero dependiendo de a quién se le ocurrió ponerlo como medirlo. Okay. Miden el mismo fenómeno, miden si los picos son gaussianos o no. Si son gaussianos, porque los picos gaussianos es una cosa sumamente rara. Miden qué tan lejos de la gaussianidad. Ustedes nunca repitan esto que voy a decir, pero miden qué tan lejos de la gaussianidad están los picos. Okay. Un pico puede tener tailing o fronting. Tailing significa que tiene una colita y se estira hacia la cola. Fronting es este fenómeno dado vuelta al pico, lo mismo. Y el factor de simetría y asimetría es básicamente la misma cosa medida al revés. Sí, acá tenemos las ecuaciones, por ejemplo, en el factor de asimetría nos dice que es la distancia BC dividida la distancia CA. O sea, medido de este lado. Si nosotros tenemos un pico con tailing, este factor de asimetría nos va a dar mayor que uno, porque este va a ser más grande que este. Y si tenemos un pico con fronting, el valor este nos va a dar menor que uno. Sí. Para el caso del tailing, el factor de tailing, también llamado a veces, este, la simetría de pico, es a la distancia completa del ancho del pico dividido dos veces la primera parte. Okay. De A a C. En este caso, por ejemplo, este factor no va a dar mayor que uno, porque C A B es más largo que A a C. Y si nosotros tuviéramos fronting, nos daría menor que uno. Una cosa importante que tienen acá que ver es que si bien es al 5% de la altura del pico que se mide el ancho de pico en este caso, y en este caso es el 10% de la altura, siempre es por encima de la línea de base. Okay. Siempre tratamos de no medir la línea de base porque hay muchísimo más error midiendo la altura de la línea de base. ¿Por qué se usa uno u otro? Dependiendo de quién lo pide, hay determinados organismos reguladores que te dicen que tenés que medirlo con una ecuación y de una forma, y hay otros que te lo piden de otra. Al final y al cabo, los dos miden el mismo fenómeno, pero es importante saber cómo lo estamos midiendo. Okay. Una de las cosas interesantes que les dice acá abajo es que los valores altos de asimetría pueden ser causa de un descarte de una columna para un análisis. Nosotros queremos que los picos estén cerca de la gaussianidad, pero picos que se van demasiado de eso ya no nos empiezan a ser útiles. Sí, porque es difícil trabajarlos bien.
Volviendo un poco al tema de la resolución, sí, Martin y Synge siguieron trabajando sobre ese tema y extendieron un poco el desarrollo teórico, eh, de la, aquella ecuación de la, la resolución que habíamos visto, y en ese desarrollo teórico hicieron, pudieron determinar que hay tres factores básicamente que afectan la separación. Sí, y los pueden expresar de esa manera. La resolución con esa ecuación que vemos ahí. No, esa ecuación no se usa básicamente para calcular eso, es una ecuación que nos permite para ver cuáles son los factores que, que afectan en realidad. Eh, la ecuación que se usa para calcular resolución es siempre la que vimos anteriormente, sí, la que usa el tiempo de retención y el ancho del pico. Este, lo que nos permite ver es que hay tres parámetros que se están trabajando, que son los que afectan básicamente la resolución de nuestro cromatograma, que son la eficiencia, que está basada por el número de platos teóricos, que es el primer parámetro que vemos, la selectividad y la retención. Okay. Estos tres parámetros son independientes. Okay. Y es importante también saber que tienen, vienen de distintos lados, como decirlo de alguna manera. K y Alfa dependen de, de situaciones más bien cosas de asuntos químicos, digamos, sí, viene depende de la composición de la fase móvil, de la fase estacionaria, pero se están dependiendo básicamente de la química del sistema. Mientras tanto que N depende de las características físicas de la columna que estamos utilizando, depende de la calidad de la columna, del largo, del tamaño de las partículas. Okay, ese tipo de cosas afectan N, y la parte de la química acá, Alfa. Y ahora vamos a ver un poco esos tres factores cómo afectan de por sí a la resolución, porque cada uno de esos factores afecta de distinta manera a la resolución.
Primero que nada, tenemos el factor K, que es el que está en verde, que es la retención. Disculpen, la retención. ¿Qué es lo que podemos ver en la gráfica? Si ustedes ven que esta gráfica que tenemos acá, tenemos tres escalas, una en cada color para cada uno de los factores. Okay. Y todos van viendo en distintos tamaños. Acá podemos ver que el factor K, sí, crece fuertemente al principio, en una forma medio logarítmica, ahí, y después tiende asintóticamente a quedarse estancado. O sea, que al principio, básicamente entre cero y, sí, menos inclusive, tenemos un crecimiento muy fuerte en cómo afecta la retención a la resolución. Pero a partir de ese punto, ya no afecta más a la resolución. Sí, este, es importante ver que la retención, que, qué tanto se, digamos, queda retenido un analito dentro de la columna, es un factor que afecta mucho al principio, pero ya de un determinado punto, no, ya no tiene mucho, no tiene mucha importancia. Después ya no cambia tanto. Si nosotros aumentamos cómo se está reteniendo, por qué, porque si nosotros retenemos muchísimo un analito, el fenómeno que sucede inmediatamente es que el pico se empieza a ensanchar y al ensancharse el pico, perdemos resolución. Sí, entonces, al principio retenerlo está bueno, porque si no lo retenemos nada, que es lo que pasa acá, si tenemos una, una retención de cero, okay, no tenemos nada de resolución, porque sale todo junto, es como que sale todo con el uracilo en el cero. Ahora, si la aumentamos demasiado, los picos se ensanchan y ya llega un punto que no mejora más el seguirlo reteniendo. Sí, este, por eso también es que siempre les marcamos que en general tratamos de que K sea menor de 10 en todos los casos.
Después, este, el segundo factor que vemos acá es el, el factor de los platos teóricos, sí, la eficiencia. El, esto tiene un, digamos, una importancia interesante en la resolución, porque nosotros podemos ver que empieza a crecer en esta forma. Tiene un crecimiento muy alto al principio, sí, y crece después en este tipo de curva, en donde podemos ver un crecimiento, pero que ya después, pasando los 15,000 platos teóricos, ya no hay un crecimiento tan, tan marcado. Sí, podemos seguir aumentando la cantidad de platos teóricos, pero si aumentamos la cantidad de platos teóricos hasta un punto, lo vamos a poder hacer, y después vamos a ver las restricciones en platos. Eso, pero cuanto más aumentemos entonces en ese caso nuestro, este, nuestro número de platos teóricos, entonces mejoraría y la resolución, pero el crecimiento más grande se da siempre acá al principio.
Y después está el factor de la selectividad, que es el que tiene el mayor impacto en la resolución. Y esto es lo que está muy controlado por la química de, digamos, de nuestro, de nuestro sistema, y lo que pueden ver es que esto prácticamente crece de una forma lineal, sí, desde, desde uno. Cuando nosotros tenemos una selectividad de uno, como lo pueden ver acá, este, directamente el factor este es cero, entonces no tenemos nada de resolución. Uno significa que la selectividad entre dos picos, uno es que están totalmente solapados uno con el otro. Y la, si empezamos a crecerlo, ya hasta 1,25, una cosa así, es lo que podemos tratar de separar esas dos picos para poder ver qué es lo que sale. Ya más allá de un 95, en general estamos trabajando con picos que ya no son picos contiguos, o sea, hay algo más entre medio. Tiene una mezcla que tiene varios analitos, como vimos al principio, probablemente la selectividad entre el primer y el último pico sea mayor que eso. Sí, pero no, no es lo esperable para picos contiguos, porque si no, ya más de ese valor de 1,25, este, estamos ganando demasiada resolución y es inútil, pues estamos perdiendo tiempo.
Okay, ¿cómo se ven esto, digamos, en el cromatograma? Una cosa así. Nosotros tenemos el primer cromatograma que vemos es un cromatograma inicial que tenemos dos picos y los dos picos están bien solapados uno con el otro. Sí, no podemos tener una resolución decente entre esos dos picos. ¿Qué pasa si nosotros variamos la, cómo es, variamos nuestro, nuestro factor K, la retención de nuestro analito? Si nosotros hacemos que esos analitos tengan una retención mayor, lo que va a pasar es que estos se van a empezar a retener más en el cromatograma y se van a ir hacia atrás en el tiempo, van a empezar a salir en tiempos más grandes, pero al también al aumentar la retención, lo que yo le decía, los picos se ensanchan y entonces empiezan a solaparse por el ensanchado, no mejora la resolución en sí. La otra opción es, nosotros disminuimos la retención, pero si disminuimos la retención, en general lo que pasa es esto, se aprieta todo contra el inicio del cromatograma.
La otra opción es, incrementar la selectividad, que era lo que nosotros decíamos, incrementamos la selectividad, entonces lo que hacemos es que mejora la forma en la que se separan los dos picos. Los dos picos se ven iguales, pero se, este, aumenta la separación entre ellos. Uno de ellos está más lejos. Ahora no tiene el mismo tiempo de separación entre los dos. Si bien las bandas tienen el mismo ancho, y la otra opción es incrementar el número de platos teóricos. Y eso lo que llevaría es a una disminución del ancho de las bandas, si bien no se mueven los picos porque la selectividad es la misma, y eso se explicaría en una forma de esta así como esto. Tenemos el tiempo de retención de los dos picos es exactamente igual, lo único que las bandas son más finas, entonces permite tener una mejor resolución.
Y bueno, ¿cómo aumentamos entonces la resolución? Lo que veníamos hablando recién. Opciones, este, aumentar K. Okay, aumentamos, este, aumentamos la retención, los picos se separan, pero se vuelven más anchos, los tiempos de análisis se vuelven largos, y si trabajamos con K muy grandes, lo que pasa es que nuestro factor pasa a tener a uno. Generalmente tratamos de achicar eso. Sí, para aumentar K, en general, cuando uno trabaja en, en GC, la, la forma de aumentar K es disminuir la temperatura del horno. Sí, entonces eso hace que las cosas estén más retenidas. Y cuando uno trabaja en HPLC, la, la solución es disminuir la fuerza de la fase, la fase móvil. Okay.
La otra opción para aumentar nuestra resolución es aumentar la selectividad. Sí, aumentamos la selectividad al, para aumentar la selectividad, lo que tenemos que hacer es que el tiempo de retención de unos compuestos cambien más que para los otros. Tenemos que cambiar el cómo esos se están sintiendo. Y ahí tenemos montones de cosas para cambiar, por ejemplo, el pH, la composición de la fase móvil, composición de la fase estacionaria, temperaturas, uso de pares iónicos. Tengan en cuenta, por ejemplo, en el caso de, de modificar el, el pH, si nosotros tenemos una serie de analitos donde uno de ellos es ionizable y el resto no, si nosotros modificamos el pH, vamos a afectar a ese solo que es ionizable. Sí, este, esto nos permite para mejorar la separación entre picos próximos.
Y la otra opción que les decía es, aumentamos N. Sí, que como ya lo vimos anteriormente, en la transparencia de los, de los super platos que no giraban, pero podrían girar perfectamente, se puede aumentar L, o sea, aumentar el tamaño de nuestra columna, o disminuir la altura del plato teórico. Okay. Los picos no van a cambiar su posición respecto uno del otro, pero como se afinan las bandas, permite una mejor separación.
Y ahora, este, viene la, la mejor parte de todo esto, que es una animación que ya la guardé porque la había hecho Danilo y me pareció demasiado buena, entonces la guardé, y que hace así. P. ¿Cómo se disminuye H? Me encantó la explosión esa. Super. ¿Cómo disminuimos H? Bien. Y para ver cómo disminuimos H, tenemos que pasarnos a la parte de, de ya un desarrollo más grande, que es la parte de la teoría cinética de la cromatografía. Okay. ¿Qué es básicamente la teoría cinética de la cromatografía? Bueno, preguntas. No hay. Tenemos una serie de preguntas. H, la altura de nuestro plato teórico depende del flujo y cuál sería el flujo óptimo. Bueno, si uno mira, este, en realidad, hay una serie de curvas por acá. H, se puede medir mentalmente en base a los tiempos de retención, los anchos de los picos para diferentes flujos. Una cosa que se vio empíricamente trabajando con un montón de, de sistemas es que la altura de los platos teóricos variaba con el flujo. Okay. Esto es totalmente empírico. En base a eso se desarrollaron, este, este tipo de curvas que nosotros vemos acá, en los cuales podemos ver que en la parte más baja es donde estamos trabajando en un flujo óptimo, porque en este flujo tenemos la menor altura de plato teórico. Al tener la menor altura de plato teórico, tenemos la mayor cantidad de platos teóricos. Sí, y esto llevó a todo un desarrollo de, de una, de una teoría cinética, la cual nos permitía un poco explicar todo este fenómeno que se vio empíricamente. Acá les dejamos un ejercicio, sí, para que ustedes puedan hacer después que termine de mirar este video, cuando miren las transparencias, es que traten de calcular la altura del plato teórico para el naftaleno.
El análisis que se muestra en la diapositiva 13, si ustedes vuelven para atrás, era la diapositiva que tenía la la calificación de una columna. Sí. Y ustedes, a partir del número de platos teóricos que tiene, sabiendo cuál era la columna que estaba usando, pueden calcular la altura del plato teórico. Y si saben la altura del plato teórico, podrían calcular a cuántas partículas corresponde una altura de plato teórico, porque ustedes también saben el tamaño de partículas que teníamos en esa columna. Sí. Así que traten de hacerlo eso para después como como un un ejercicio mental.
Bien. Entonces, para la teoría, esta tuvimos que cambiar un poco el paradigma. Sí. Hay una teoría que estudia este ensanchamiento de la de bandas en relación a la velocidad de los procesos de transferencia de masa en la separación cromatográfica. Y esto es muy así como suena, pero todo esto lo desarrolló el señor este que está acá. Porque el señor holandés, me costó, pero tratar de aprender cómo se pronunciaba el nombre, ni me lo pregunte. Este era un físico, ingeniero holandés, que es muy importante, aparte de porque usaba un saco con cuadritos muy pero muy copados, por el desarrollo de la ecuación de F. Esta es la que vemos acá. Es una la ecuación esta que es tan conocida, en la cual está conectando la altura de un plato teórico con tres factores, A, B y C, en los cuales B y C a su vez dependen de la velocidad lineal. Sí. Acá tenemos qué es lo que significa G, un U vendría a ser la velocidad lineal de la fase móvil, que está relacionada con el factor B y el factor C. A es independiente de la velocidad lineal. El factor A vendría a ser la división por la multiplicidad de caminos o factor de turbulencia, también conocido como factor de Ed. B es la difusión molecular longitudinal. Y C es la resistencia a la transferencia de masa entre la fase estacionaria y la fase móvil. Y ahora vamos a ver uno por uno cada uno de estos factores para ver a qué es lo que refiere cada uno.
El primer factor, el factor A, la multiplicidad de caminos. Sí. Esto es básicamente una una dispersión que se produce por los obstáculos a los que se encuentra nuestro analito al moverse a través de de la columna. Sí. Y acá lo que tenemos es lo siguiente. Nosotros tenemos analitos que arrancan en un mismo lugar, que están acá. Estos dos analitos arrancan un mismo lugar y se mueven en su fase móvil, con un flujo determinado, a través de todo el sistema. Pero qué es lo que pasa. Uno de los dos analitos decide tomar un camino y el otro decide tomar otro camino. ¿Por qué? Porque hay caminos diferenciales dentro de esta columna. Mientras el analito de abajo toma toma la línea recta, el de arriba toma la ruta panorámica. Y como va tomando la ruta panorámica, nos lleva básicamente al cuento de Caperucita Roja. El lobo salió derecho, la Caperucita Roja se fue por la ruta panorámica, el lobo se come la abuela. Todo mal. Lo que sucede es que este analito llega hasta este punto primero que este. Y esto lo que produce es de dos analitos que partían desde la misma altura, una banda única y finita, llegamos a una banda más ancha porque este se retrasó más por el este por el camino que tomó su ruta panorámica. Es interesante porque este factor no depende del flujo, porque si nosotros aumentamos el flujo o disminuimos el flujo, los dos se van a mover más rápido a través de los diferentes caminos. Entonces la diferencia es entre los dos es por la distancia que recorre. Okay. Este factor sí es directamente proporcional al diámetro de las partículas de relleno. Cuanto más grandes son las partículas de relleno, lo que va a pasar es que el vamos a generar mayor cantidad de inserti y esos inserti son donde se producen esas turbulencias que nosotros tenemos. Y esas turbulencias son las que enlentecen de cierta forma también todo el sistema. Y ahí es donde viene el que se le llama este el factor de Edi o de turbulencia. Edi no es por por una persona. Edi es como es es en inglés de decir un remolino, una turbulencia. Entonces es por eso que se llama Edi, pero todo por mucho tiempo yo me pensé que Eddie era el señor que había hecho algo en el factor este, pero no, nada que ver. Sí.
Bien. A su vez, nuestro nuestro factor A, este se ve afectado por la poca homogeneidad de nuestro lecho de nuestra fase estacionaria. Cuanto más homogénea es nuestra fase estacionaria, sí, la posibilidad de tomar caminos diferenciales y generar zonas de turbulencia va a ser menor. Sin embargo, si nosotros tenemos tenemos una dispersión muy grande, sí, en los tamaños de las partículas, lo que nos va a pasar es que tenemos zonas donde se puede generar turbulencias de entre medio y muchas zonas en los cuales los caminos van a tener distintas distancias. Por consiguiente, va a generar esa dispersión mucho mayor. Así que partículas grandes y poco homogéneas tienden a aumentar mucho el factor A. Las partículas este, perdón, tienen afectar que la la altura del plato teórico vaya bajando. Vamos a tener bandas más anchas. Y si tenemos partículas más pequeñas y más homogéneas, mejora mucho la altura de los platos teóricos. Okay.
Nuestro segundo factor es la difusión longitudinal B. Sí. Y que se produce por los gradientes de concentración. Qué es lo que pasa. Nosotros tenemos nuestra columna ahí en ese caso. Y si nosotros sobre nuestra columna agregamos un analito cualquiera, nuestro analito está ahí en esa situación. Okay. Tenemos un agregado, un analito. Obviamente uno no inyecta está la mitad de la columna como se muestra ahí, pero esto es un ejemplo gráfico. Eh, ese agregado de analito, si uno lo pone en un lugar donde hay una solución, va a pasar lo que va a pasar siempre. Sí, es que eventualmente eso va a difundir. Como leí por ahí en algún lado, este los analitos adentro de una columna son como como una serie de niños, eventualmente van a tratar de separarse entre sí. Este, entonces está la situación es eso va a tratar de diluirse donde hay más concentración a donde hay menos concentración. Y eventualmente lo que vamos a pasar es que todo el lecho va a tener la misma concentración del analito si lo dejamos estático ahí. Okay.
Bien. Ahora, ¿qué es lo que pasa cuando nosotros tenemos exactamente la misma situación? Tenemos un agregado, un analito, pero en este caso tenemos un flujo de base móvil. La fase móvil está empujando sí nuestros analitos en un sentido determinado. Lo que va a pasar es que ahora nuevamente nuestro analito va a tratar de difundir de la misma manera que difundió en el caso de arriba, pero tiene un flujo de fase móvil que lo está empujando en una dirección. Y eso lo que va a llevar es a este tipo de sistemas en los cuales lo que va a pasar es que se va a tratar de difundir, sí, pero en el otro sentido. Uno se va a ver acelerado y el otro se va a ver enlentecido. Y lo que vamos a ver en la vuelta, el final, es que vamos a estar disminuyéndolo, o sea, se va a seguir difundiendo, pero esas bandas se van a fundir también y se van a mover a la vez. Vamos a tener la difusión y el movimiento todo junto. Okay. Y eso va a llevar entonces a que tengamos una banda un poco más estrecha en ese sentido.
Bien. Y el tercer factor que nosotros tenemos acá, sí, este que sería la transferencia de masas, es nuestro factor C. Bien. ¿Cuál es el asunto? Nosotros tenemos partículas que son porosas, que son lo que están haciendo digamos nuestra fase estacionaria. Bien. Hay moléculas de soluto que difunden en los poros, okay, y van a pasar por dentro de los poros de la partícula. Y otras que van a pasar de largo a través de ellas. Las que van a pasar dentro de la fase estacionaria y se distribuyen dentro de la fase estacionaria, se van a quedar retrasadas con respecto a las que están en la fase móvil. Sí. Y eso lo podemos ver básicamente acá. O sea, las partículas que entran cuando entran, se retrasan de las que no entran. Cuando llega al final, y a su vez, dependiendo de qué tan profundo penetran las partículas, sí, per tan profundo penetran los analitos en la partícula, qué tanto más se van a retrasar. Okay. Los que penetran más profundo, como este que vemos acá, tiene un mayor retraso. Al final, lo que tiene es que este fenómeno sí depende del flujo. También es como la difusión longitudinal que vimos recién. Sí, también depende esto sí depende del flujo, porque si nosotros aumentamos el flujo, lo que va a pasar es que el retraso de estas partículas que entraron y salieron de vuelta es cada vez más grande. En este caso, con un flujo más pequeño tenemos un retraso X, con un flujo mayor tendríamos un retraso más grande, porque estas partículas se ven demoradas el mismo tiempo adentro de, perdón, los analitos estos se ven demorados dentro de la partícula. Así sería la cosa.
Bien. Ahora, cuando miramos el el gráfico general de nuestra ecuación de F, así vemos que nosotros veíamos nuestra nuestra nuestra curva que tenía generalmente esta forma. Sí. Y nuestros tres factores A, B y C. Pero A, B y C van a aportar eh de distinta manera. Okay. A a nuestra curva esa. Para empezar, el factor A, sí, este que era el factor básicamente que hablaba acerca de cómo estaba compuesta nuestra columna, del tipo de partículas que tenía, ese factor no varía con el flujo. Sí, eso lo habíamos visto en el principio. No varía con el flujo y eso lo que marca es nuestro piso. Este es nuestro factor A. Nuestro factor A no cambia, no importa cuánto cambiemos el flujo. Okay. Y al no cambiar, este va a ser nuestro mínimo. Nuestra altura de plato teórico nunca va a poder ser más baja que esto. Okay. Por otro lado, los factores B y C sí van a variar con el flujo. Okay. Entonces, lo que tenemos acá es que el factor B tiene un cambio sumamente fuerte al principio, a flujos bajos. Okay. Al estar trabajando a flujos bajos, cuanto más bajo es el flujo, mayor va a ser la difusión longitudinal que va a tener adentro de la columna. Sí. Si nosotros vamos con un flujo muy despacito, va a tender a dispersarse muchísimo eso ahí adentro. Si nosotros tenemos flujos muy rápidos, no le va a dar tiempo. Van a empezar a a como es a difundirse dentro de la columna el analito y por consiguiente va a salir en bandas más finas. Sí. Y tiene este tipo de comportamiento. Y por otro lado, el factor C aumenta con el flujo, porque como ya vimos, cuanto más rápido va la fase móvil, más se van a retrasar los analitos que penetran dentro de las partículas. Sí. Entonces, entre estos tres factores es que se define la curva final que vamos a ver, donde podemos ver que el mínimo de la altura de plato teórico que podemos llegar a tener está por este punto acá. Okay. Pero es bueno entender que todos estos factores tienen este una distinta componente y que cada uno afecta en un punto o en el otro. Si una vez que nosotros aumentamos el flujo lo suficiente, ya la difusión longitudinal no importa porque está por debajo de los caminos este diferenciales dentro de la columna. Y ahí es donde vemos nuestra velocidad lineal óptima.
Bien. Nuestros gráficos, este lo que podemos el gráfico de la altura de plato teórico versus el flujo. Esto es algo que va a ser distinto para cada analito. Sí. Siempre van a tener la misma forma las curvas, pero van a ser variar levemente para cada uno. Okay. En general, tienden a tener un digamos un el flujo óptimo anda muy parecido para casi todos los analitos dentro de un mismo sistema. En la práctica, si si uno quiere saber exactamente cuál es el flujo óptimo para trabajar, en general uno no empieza a tratar de ver todos los parámetros y tratar de ver esta ecuación y elucidar cuál es la posibilidad para hacer cuál es el flujo óptimo. En general, la forma más fácil de hacerlo es ir directamente a la hoja de calificación que viene de fábrica. Sí. En la cual en esa hoja nosotros teníamos todos los datos del cromatograma y una de las cosas importantes ahí de esos cromatogramas es que nos dan un flujo. Y es importante saber que los vendedores siempre quieren vender y nos van a dar y nos van a mostrar sus columnas en las mejores condiciones posibles. Ellos no nos van a mostrar una columna trabajada sobre las condiciones más rigurosas. Ellos te van a mostrar el mejor análisis que te pueden mostrar. Y entonces, en general, ese análisis está hecho con un flujo óptimo. Sí. Que eso lo pueden ver, lo pueden sacar de ahí. Generalmente pueden sacar el flujo óptimo de trabajo a partir de la la hoja de calificación para las columnas HPLC típicas que trabajamos, por ejemplo, la que teníamos hoy en el ejemplo, una columna 150 por 46, un tamaño de 5 micras. General el flujo óptimo de trabajo es alrededor de 1, 1.5 ml por minuto.
Ahora, la ecuación D tiene una una extensión. Por qué hubo un punto en el cual se vio que la transferencia de masa entre la fase estacionaria y la fase móvil no era un término tan sencillo, sino que se basaba en dos términos. Sí. Ya que en realidad los fenómenos que ocurrían cuando se transfiere el analito desde la fase estacionaria a la fase móvil no son iguales que cuando se transfieren de la fase móvil a la fase estacionaria. Entonces, lo que hicieron fue dividir el término C en dos términos, Hs y Hc. Sí. Eh, básicamente lo demás es lo se mantiene igual. Y y esta forma de de expresar la ecuación tiene una forma numérica desarrollada para poder trabajarla, que es la siguiente. Esta sería la fórmula desarrollada de la ecuación de de Van Deemter. Okay. En la cual tenemos un montón de factores. Hay una serie de constantes. Pero lo que yo quería que que se fijaran de todo esto es la parte importante de todo esto es el diámetro de partícula. Esto que tenemos acá es el diámetro de partícula. Y acá tenemos de vuelta el diámetro de partícula al cuadrado. ¿Por qué? Porque el diámetro de partícula es uno de los factores primordiales que nosotros tenemos dentro de nuestro sistema, que nosotros podemos modificar y que nos permite aumentar la altura de plato teórico. Sí. La disminución del diámetro de partícula es un parámetro sumamente importante para disminuir la altura de plato teórico y por consiguiente vamos a mejorar la eficiencia de nuestro sistema. Sí. La disminución del tamaño de partícula es como nuestra clave. Pero claro, trae sus contrariedades. Ustedes saben que no podemos achicar las partículas a de terro. Okay. Por eso de esta ecuación no es necesario que se la acuerden. No es necesario que vean esa esa deducción gigante. Lo importante es que vean que en la parte numérica de esto nos encontramos con el diámetro de partícula como un factor que pesa bastante al momento de definir nuestra altura de plato teórico.
Y bueno, básicamente como para mostrar un poco cómo es que que ha ido afectando eso en el tiempo. Esto que vemos acá es este un gráfico de de altura de platos teóricos versus la velocidad lineal para diferentes sistemas. Por ejemplo, acá lo que tenemos son columnas de 10 micras de tamaño de partícula, que eran lo lo usado básicamente este en los años 70. Sí. Con primeros desarrollos de HPLC se trabaja con columnas de 10 micras. Y ustedes pueden ver que la altura de plato teórico es digamos, tiene un piso por acá. Y básicamente cambiaba muy pero muy rápido al modificar el flujo lineal. Sí. El flujo óptimo era bastante pequeño. Ya después, a partir de los 80, se empezaron a desarrollar columnas de tamaño de partícula alrededor de 5 micras. Okay. Que es ya tienen un comportamiento bastante distinto, en el cual la altura de plato teórico es bastante más baja. Sí. Tiene mucha mejor eficiencia y tienen este tipo de comportamiento. Ya no es tan pronunciada la creciente después. Sí. Y después a partir ya de de 1990, el desarrollo de columnas de 3,5 micras. Okay. Y ya trabajando con este tipo de curvas donde cambiamos bastante y ya podemos ver que la parte del flujo óptimo es bastante más amplia. Sí. Y lo último, ya las columnas este más pequeñas de todas, la columna de por debajo de dos micras. Ya estamos trabajando con sistema de UHPLC, UPLC. Y esto ya podemos ver que hay un cambio muy pero muy grande en la altura de los platos teóricos. Lo que vemos acá es que en los desarrollos se han volcado muchísimo al pasar de los años en la disminución del tamaño de partícula. Sí. La disminución del tamaño de partícula, como ustedes saben, también trae el problema de la presión que se genera, porque al aumentar el tamaño, al disminuir el tamaño de partícula, perdón, aumenta el el empaque que tiene nuestra columna y por consiguiente la resistencia que vamos a tener a la fase móvil. Y eso lo que trae es un aumento de presión. Por eso ya hasta sistemas de 3,5 micras se pueden trabajar en HPLC, pero ya más pequeños que eso no. En algunos casos ustedes lo van a ver más adelante, este se pueden trabajar en algunos sistemas más pequeños de 3,5 micras, pero no con este tipo de partículas que nosotros venimos tratando hasta ahora. Okay. Porque esto bueno, es el desarrollo hasta este momento. Los desarrollos después empezaron a tirar por otro lado. Ya no es simplemente achicar el tamaño de partícula, sino modificar los tipos de las partículas para modificar los otros parámetros. Todo eso lo vamos a ver más adelante este en el curso cuando veamos este otros tipos de de cromatografía en en HPLC. Pero está, por ahora los dejo con la espina no más de eso.
Muchas gracias por por su atención y nada, nos vemos en la próxima.