Métodos Separativos - Clase 4 - HPLC: Detectores

Bueno, buenas tardes a todos de nuevo. Bienvenidos a nuestra segunda clase en versión COVID-19. Y bueno, antes de de arrancar con esta otra clase, teníamos una una serie de anuncios que queríamos comunicarles.

La primera de ellas es que, bueno, como ya saben, estamos colgando las las clases en este formato como para que ustedes puedan seguir el curso de desde una manera a distancia, pero a su vez estamos incorporando nuevas cosas como para tratar de ver si podemos hacer un poco más más ameno o facilitarles por lo menos a ustedes la la situación.

A su vez, aparte de estos videos, ustedes ya saben que tienen las las transparencias en formato PDF también colgadas en el aula virtual, pero también ahora les estamos agregando los foros en los cuales les vamos a ir planteando preguntas. Pero si bien la la idea principal para estos foros es que ustedes puedan comunicarse con nosotros. Ustedes, si tienen alguna duda sobre la clase, como cuando se les está por levantar la mano en una clase, bueno, es lo mismo, pero lo hacen en el foro. Entonces, así mismo podemos llevar una discusión entre todos nosotros y podemos hacerlo un poco más ameno para todos. Está bueno también porque a veces las dudas de uno que alguien no se anima a preguntar, las otro los pregunta y en realidad todos nos nos sacamos la duda de una.

Y la última cosa que estamos agregando son unos cuestionarios de autoevaluación. Que la idea es que tiene una serie de preguntas sobre cada uno de los temas de las clases y y bueno, que después de que ustedes hayan visto las clases y eso, los pueden probar hacer para ver si si les queda alguna duda sobre un tema o si entendieron bien algún concepto o no. Si todos ellos tienen una una retroalimentación al final, entonces las opciones que ustedes seleccionan, pues son todas preguntas de opción múltiple, van a tener una retroalimentación y les van a explicar por qué sí o por qué no.

Bien, ahora volviendo un poco al tema de la clase, esta clase de hoy habíamos dicho que la íbamos a a dedicar exclusivamente a los detectores de HPLC y bueno, vamos a hablar un poco entonces de eso el día de hoy. Más o menos la clase la vamos a dividir en estos cuatro puntos generales. Primero, vamos a hablar de generalidades de todos los detectores de HPLC, cosa que todos se parece en la idea general para todos ellos. Después, vamos a ver unos términos generales que son aplicables a todos los casos. Y después, sí, nos vamos a enfocar específicamente en los distintos tipos de detectores, en los más usados hoy en día para trabajar en HPLC. Y por último, vamos a hacer una una comparativa entre estos distintos tipos de detectores para tratar de ver las las fortalezas y las debilidades de cada uno.

Bueno, entonces acá lo que tenemos es el clásico y nunca también apreciado esquema de cómo funciona un HPLC. Entonces, ahí ustedes tienen este el sistema: una bomba, una inyección de muestra, una columna y siempre está el detector. Y el detector lleva una parte muy importante en todo esto, porque el detector es básicamente, es es el ojo del HPLC, como dice ahí, es lo que nos permite a nosotros determinar los los componentes que realmente están saliendo en nuestra columna. Ustedes imagínense que si nosotros podemos llegar a un sistema cromatográfico muy bueno en el cual podemos separar un montón de de componentes, pero no tenemos forma de saber qué es lo que estamos separando, es completamente inútil. O sea, por más de que nuestro sistema cromatográfico sea muy bueno, si no tenemos forma de saber qué es lo que viene saliendo de ahí y cómo viene saliendo, no nos sirve de nada. Lo bueno que era.

Entonces, el detector es una parte fundamental acá y vamos a tener que valernos de muchas propiedades de los distintos componentes que salen de de ese sistema cromatográfico para poder poder determinarlos, su presencia y sus otras cualidades.

Bueno, básicamente esto es lo que yo les venía explicando. Nosotros vimos en la primera clase, la segunda clase, en la de principios de cromatografía, que cuando nosotros ponemos una mezcla dentro de un sistema cromatográfico, distintos analitos se pueden ir separando por su distinta afinidad por una fase estacionaria y a medida que se van separando, van a ir quedando más retenidos, no algunos de ellos. Y los que quedan menos retenidos empiezan a salir más rápido de nuestro nuestro sistema, a salir. Entonces, lo que necesitamos es una forma de detectarlo. Nuestro detector se va a encargar de eso y y a medida que va saliendo cada uno de ellos, nosotros lo vemos como un pico en un cromatograma.

¿Qué es lo que le pedimos nosotros a a ese detector? Bueno, nosotros le ponemos muchísima presión a ese detector y le pedimos que tiene que tener un montón de condiciones. Tiene que tener una alta sensibilidad para que pueda detectar muy pequeñas cantidades de de analito que están saliendo, porque de nada nos vale que nuestra solución esté saliendo coloreada para saber que hay un analito coloreado. Tenemos que saberlo en concentraciones mucho más bajas. Le pedimos que tenga una una respuesta rápida, porque si hay analitos que están saliendo demasiado rápido, lo queremos que estar viendo y no perderlo. Queremos que tengan un amplio rango dinámico lineal, eso lo vamos a ver más adelante qué es lo que significa. Queremos que tenga un bajo nivel de ruido y de deriva, o sea, que la línea de base sea una línea de base bastante estable. Y ese ruido y esa deriva muchas veces dependen de las condiciones del detector. Que sea insensible a los cambios de fase móvil, por si nosotros queremos llegar a aplicar un gradiente, que que sea insensible a los cambios de temperatura, por si queremos hacer gradientes de temperatura también o por si hay oscilaciones de temperatura dentro de nuestro sistema, eh, que no no se vea afectado por cambios de presión, porque hay veces que la la presión, si bien debería estar lo más estable posible, puede variar un poco, particularmente si hace un gradiente de temperatura o composición de fase móvil, la presión evidentemente va a variar. Y que sea sensible también a los cambios de flujo. Y también lo que queremos es que en la celda de flujo, que es la celda del detector, porque ustedes no se olviden que estos detectores van a estar trabajando en un sistema continuo, sí, o sea, esa fase móvil cargada de analitos va a estar corriendo constantemente, nunca se detiene, como pasa en otros casos para que el detector lo analice. Eso vamos a tener que analizarlo simultáneamente mientras se va moviendo, en una celda de flujo. Y lo que queremos es que esa celda de flujo sea lo suficientemente resistente como para soportar este presiones y que sea de pequeño volumen, porque si tiene un volumen muy grande, vamos a tender a juntar mucha cantidad de de muestra y podemos juntar cosas que están saliendo muy pero muy juntitas.

Bien, primero vamos a ahora, primero no, este es el dos, o sea, que es por segundo. Vamos a ver un poco los términos generales con lo que se trabaja en en estos detectores. Si es importante tener en cuenta qué es lo que significan estas cosas, en particular para no cometer errores de interpretación, como puede pasar a veces. Nada que ver con la imagen que está ahí.

Bien, básicamente vamos a definir un poco estos tres primeros puntos que son bastante importantes. Ya ya habíamos hablado un poco de algunos de ellos, pero vamos a dar bastante más énfasis ahora. Primero que nada, tenemos el el ruido. El ruido es es es como se define como está ahí. Vamos a leerlo: es una variación al azar de la señal del detector y generalmente se define para tiempos cortos. Si ustedes miran la la línea esta de base que tenemos acá, esa cosa bien fea negra que tenemos ahí es la línea de base. No, si ustedes lo miran acá, esto que tenemos acá vendría a ser la línea de base de de nuestros cromatogramas, nuestra señal. Esto lo que nosotros lo vemos es como el ruido electrónico. Eso es es una variación al azar que va teniendo constantemente nuestra señal. Eso se puede deber a las pulsaciones de la bomba, problemas electrónicos, eh, inestabilidad de la de la carga eléctrica, millones de cosas. Todo ese tipo de de cosas van afectando la cantidad de ruido electrónico y y por consiguiente van generando este tipo de movimientos al azar dentro de la línea. Y en general se define como la amplitud que hay entre el punto más alto y el punto más bajo. Generalmente se toma uno de los picos hacia arriba y un valle hacia abajo, los dos más altos que se encuentran en una sección y se trazan las paralelas y ahí se puede medir el tamaño del ruido.

Por otro lado, eso se difiere un poco de lo que es la deriva. Que la deriva es es la pendiente, el que va en torno a este ruido para tiempos largos. ¿Qué qué es bien la deriva? Bueno, la deriva es básicamente la la inclinación que tiene esta línea de ruido. Sí, si ustedes lo miran en tiempos cortos, esto es muy muy muy ruidoso, pero si nosotros agarramos este cromatograma de repente y lo ampliamos muchísimo, esto parece ser una línea casi que recta. Cuando lo miramos muy chiquito, sin embargo, la deriva que corresponde a a la inclinación que tiene esto, si a la pendiente, lo que va a pasar es que se va a ir incrementando con el tiempo. Entonces, lo que nosotros llegamos a ver es como que se empieza a formar una rampa y eso se llama deriva.

Y la otra cosa que tenemos que definir es qué es un pico, porque nosotros hablamos de que cuando salen nuestros analitos del sistema cromatográfico, nosotros vemos un pico como una señal. Y al final y al cabo, ¿qué es un pico? Bueno, los picos se definen como que es una señal, pero ustedes tengan en cuenta que esto que se ve acá también es una señal. Sí, pero es una señal que tiene una relación de tamaño en general 3:1 respecto al ruido, o sea, que el pico tiene que ser tres veces más grande de lo que es el tamaño de ruido. Muchas veces este algunas personas lo pueden definir como 2:1 también. Cualquiera de las dos opciones es válida, depende mucho de los casos, eh, pero eso es es gustable a cada situación, pero entre 3:1 y 2:1 es donde está casi siempre lo que se define como una mínima cosa para decir que tenemos un pico.

Bien, entonces habíamos dicho un poco del ruido, qué es lo que lo originaba. Bueno, el ruido está originado por por ejemplo, con por problemas instrumentales. Eso es lo más básico que pueden ser las bombas y las pulsaciones, el detector y la electrónica, problemas de la alimentación eléctrica. Ustedes tengan en cuenta que variaciones mínimas del voltaje pueden llegar a afectarlo también. Pero hay otras cosas que que afectan mucho el ruido. Una de ellas es es la fase móvil. La fase móvil puede tener una falta de homogeneidad, eh, baja pureza de los reactivos, podemos estar usando disolventes que no son de la calidad apropiada, podemos haber preparado un buffer con una sal de una calidad que no era tan buena, eh, y también las microburbujas. Habíamos hablado también de la importancia del desaire y de la importancia de de usar sistemas de desgasificado en línea, eh, la formación de microburbujas a veces puede llegar a generar que el ruido sea grande dentro de todo esto. Y una de las cosas principales que que también da problemas en el ruido es la misma muestra. Ustedes tengan en cuenta que que la misma muestra también origina un poco de ruido. Y si bien este uno a veces puede tratar de incrementar la la cantidad de la de la de la muestra que uno está agregando para poder mejorar la relación señal-ruido, eh, la concentración de las muestras también aumenta la cantidad del ruido. Sin embargo, no crecen de la misma manera. O sea, si uno aumenta la la concentración de una muestra, no es que el ruido crece exactamente igual que la muestra. Generalmente la muestra crece con un crecimiento cuasi lineal y el ruido crece en un factor de una raíz cuadrada. Entonces, es como que el ruido empieza a achatar antes, pero también aumenta un poco con las concentraciones de la muestra. Sí.

Bien, entonces si nosotros tenemos, por ejemplo, acá en este caso, este dos picos que vemos ahí, sí, si miramos este uno y otro, realmente es claro que uno de los dos picos es muchísimo más grande que el otro. Si el pico de la izquierda claramente más grande que el pico de la derecha. Sin embargo, cuando hablamos de relación señal-ruido, sí, para estos dos picos, si lo miramos así, miren las comparaciones de abajo. Okay, esta es la relación señal-ruido para este pico que tiene un ruido de alrededor del 10%, entonces la relación señal-ruido es de 10:1. Sin embargo, para este otro pico que está acá, que es mucho más pequeño, la relación señal-ruido es de 25:1. Si uno lo mira por la altura del pico o por el área del pico, el pico de la izquierda es muchísimo más grande, pero sin embargo, la relación señal-ruido para el pico de la derecha es más amplia. Por consiguiente, a veces es más fácil tratar de integrarlo y da una señal más limpia para trabajar.

Pero ahora consideremos un pico mínimo. No habíamos dicho que tener una relación 3:1 nos daba algo que nosotros podíamos considerar una señal. Ahora, si nosotros queremos incrementar la relación señal-ruido, en este caso, una de las opciones que tenemos era, como les decía recién, es aumentar la cantidad de muestra que se inyecta. Si uno aumenta la cantidad de muestra que inyectamos, yo les decía que la la señal de la muestra crece muchísimo más de lo que crece el ruido y podemos aumentarla, por ejemplo, como en este caso, tenemos una relación 6:1. Aumentando la cantidad de la muestra, el ruido se mantiene bastante parejo, debería incrementar un poco, pero se mantiene bastante similar.

La otra opción que tenemos cuando nosotros queremos mejorar la relación señal-ruido es claramente disminuir el ruido. Y para disminuir el ruido podemos hacer una serie de cosas. Podemos estabilizar la corriente, podemos mejorar la calidad de los reactivos. En este caso, tenemos un pico que tiene una relación señal-ruido 8:1, sí, pero que tiene la misma altura y la misma área que este pico que tiene una relación 3:1. La única diferencia es que nosotros acá disminuimos el ruido en la línea de base. Okay, o sea, que cuando nosotros queremos mejorar la relación señal-ruido, podemos aplicar a cualquiera de las dos opciones: aumentar la cantidad de muestra que estamos inyectando para generar una señal más grande o disminuir el tamaño del ruido. Eso era bastante claro. Sí.

Bien, hoy hablamos también un poco de, les decía, entre las cosas que se buscan en en un detector es que tenga un rango dinámico lineal bastante grande, ¿no? Bien, ¿qué es lo que es el rango lineal o el rango dinámico? Miremos esta gráfica un poco y vamos a tratar de de sacar un par de de datos de acá y un par de definir un par de términos importantes acá: rango dinámico, rango lineal y sensibilidad. Sí, cuando hablamos de sensibilidad, nosotros hablamos de la mínima cantidad que podemos detectar en un detector. Okay, ustedes tienen un detector, cualquiera sea ese detector, va a ver una cantidad mínima de muestra de una muestra dada que puede llegar a ver y eso va a determinar la sensibilidad de ese detector para ese analito particular en esas determinadas condiciones. Es importante saber la sensibilidad porque ya a partir de eso ya no podemos determinar más ese analito. Entonces, si nos vamos en la parte baja de esta gráfica, ustedes van a ver acá donde dice la mínima cantidad detectable, eso vendría a ser la sensibilidad de nuestro equipo. Okay, a partir de acá nosotros podemos determinar que ese analito está, de ahí para abajo no podemos determinar que esté. Y después esta línea empieza a crecer acá. Si ustedes se fijan, esto empieza a generar una línea recta hasta básicamente este punto acá. Esto está medio torcido en realidad, pero vamos a poner que el punto en el rango en el que la respuesta entre la concentración, perdón, la relación entre la concentración de la muestra y la respuesta del detector tiene una curva de tipo lineal, así vamos a hablar que es una recta. Vamos a hablar de que estamos dentro del rango lineal. Sí, cuando nosotros tenemos que al aumentar la concentración, la señal del detector aumenta este como una recta, entonces estamos dentro del rango lineal del equipo.

Y ahora vamos a ver por qué es útil y cuál es el rango dinámico. Bueno, el rango dinámico lo que nos dice es el rango en el cual al aumentar la concentración de la muestra, vamos a tener un aumento en la respuesta del detector que no tiene por qué ser lineal. Ya si se fijan acá, acá tenemos un aumento, pero prácticamente logarítmica la cosa. Y después de este punto, ya el detector no puede determinar que hay una. Entonces, nosotros podemos aumentar mucho más la concentración de la muestra, pero la respuesta que vamos a obtener del detector va a ser siempre la misma. Ahí ya estamos fuera del rango dinámico. Al aumentar la concentración no cambia lo que nos dice el detector. Y pasa exactamente lo mismo para abajo. Si nosotros a partir del punto de sensibilidad, nosotros bajamos la concentración, la respuesta del detector va a ser básicamente la misma. Sí.

Estos tres términos, acuérdense los porque son bastante importantes para lo que vamos a seguir ahora. ¿Qué es lo que pasa cuando nosotros nos pasamos del rango dinámico? Bueno, es lo que se llama la saturación del detector, que es básicamente lo que se nota en los picos, que los picos llegan hasta un punto en el cual no pueden crecer más y se ven cortados. Y acá un poco de trazado en una cosa media de humor negro, eh, esto es básicamente lo que pasa cuando se satura un detector. Nosotros no podemos ver lo que hay más allá de esta parte de la señal. Esta es una una representación gráfica un poco violenta de repente, pero es este en forma explícita lo que sucede con los detectores cuando se saturan.

Bien, ahora cuando nosotros, eh, aparte de determinar un compuesto, queremos cuantificar en el HPLC, tenemos que hacer una serie de de acotaciones. La primera es que tenemos que tener constancia en las condiciones cromatográficas. Nosotros vamos a a cuantificar una muestra, muchas veces la mayoría de los casos en HPLC se usan estándares externos. Y para correr primero un estándar y después correr una muestra, vamos a tener que tener siempre las mismas condiciones cromatográficas. No podemos variar las condiciones cromatográficas. Si usamos siempre las mismas condiciones cromatográficas, la reproducibilidad es muy buena y podemos entonces cuantificar de esta manera.

La segunda es, bueno, vamos a tener que definir claramente el pico cromatográfico. ¿Cuál es el pico que, perdón, en qué momento tenemos un pico? Nosotros sabíamos, hemos hablado de tener una resolución mayor o igual a 1.5, más cercano a dos es todavía mejor, sí, un valor de dos o superior es mucho mejor para poder hablar que tenemos un pico bien definido, pero hay que poder separarlo y se tiene que poder resolver de de los otros componentes de la muestra para poder cuantificarlo.

Y lo otro que estamos pidiendo es que el valor medio, sí, de lo que nosotros estamos cuantificando, esté dentro del rango lineal. Nosotros necesitamos que un valor que nosotros queremos cuantificar tiene que estar dentro del rango lineal. Tiene que haber una una ecuación que sea de una recta que nos permita a nosotros este obtener los valores extrapolando. Sí.

Y otras cosas que tenemos que definir son el el LOD y el LOQ, que son el límite de detección, que vendría a ser un poco como la sensibilidad, y el límite de cuantificación de la muestra, porque tengamos en cuenta que el límite de de detección no es exactamente igual al límite de cuantificación. Y la otra cosa que siempre es importante cuando se quiere hacer cuantificaciones en HPLC es tener los métodos correctamente validados.

Bien, vamos a definir un poco qué es el LOD y el LOQ. El límite de detección es la mínima cantidad de un analito que se puede detectar con seguridad. Entonces, en eso estamos hablando que generalmente es entre dos y tres veces la relación señal-ruido. Sí, es como tener un un pico que nosotros veíamos que fuera una relación 3:1 con respecto al ruido. Eso es un pico que uno puede decir, acá hay un pico realmente y no es simplemente un poco de ruido que se fue de la escala. Está. Y esto es como dice ahí, es un resultado de todo el sistema cromatográfico, porque sabíamos que dependía del equipo, depende de las condiciones, depende de, eh, de la muestra y depende de los tipos de disolventes que estamos usando.

Y por otro lado, tenemos el límite de cuantificación, que esta es la mínima concentración de analito para una determinada matriz, la cual podemos cuantificar por un método, pero la cual podemos llegar a cuantificar. Tengan en cuenta que el que lo podamos detectar no significa que lo podamos cuantificar. Cuantificar ya es un poco más complicado. En general, para cuantificar se pide que sea tipo 10 veces una relación señal-ruido, por lo menos. Ahí les dice entre 10 y 20 veces. Y de ahí para arriba, muchas veces se pide simplemente que sea tres veces el límite de detección, o sea, que sea una relación alrededor de nueve veces la señal-ruido.

Y otra de las cosas que que se pide muchas veces es que cuando tengamos validados unas ciertas concentraciones para trabajar, que estemos más o menos por el medio. Sí, eh, si uno valora entre una o dos determinadas concentraciones un método y sabemos que tenemos un rango lineal entre esas entre esas dos concentraciones, tratamos siempre de trabajar en la mitad para cuantificar.

Bueno, ahora vamos a tratar de de abordar un poco, sí, los tipos de detectores distintos en los cuales se pueden trabajar. Y por qué es importante ver que tenemos distintos tipos de detectores. Bueno, porque e muchas veces las las mezclas que uno tiene que analizar son sumamente complejas. Estas mezclas que son tan complejas van a van a contener muchos tipos de analitos distintos y cada uno va a tener propiedades distintas. El hecho de que todos los analitos tengan propiedades distintas nos va a hacer que hay veces ciertas cosas sean invisibles a los detectores que tratamos de ver, porque los detectores ven una determinada propiedad de cada uno de de los analitos y no todos cumplen con las mismas propiedades. Si ustedes se fijan ahí, por ejemplo, ahí tenemos una diferenciación entre cómo ve un perro y cómo ve una persona las mismas cosas. Y si bien para todos nosotros la pelota de tenis en el pasto es claramente diferenciable por el color, para el perro ya es un poco más complicada diferenciarlas. Por eso, cuando uno le tira la pelota al firulais y firulais le cuesta ir a encontrarla, es por eso. Y por eso no sabe si la tiraste o no la tiraste. Si uno se mata de la risa y se la pone en la espalda y el perro va y corre y todo eso, y estamos jugando con una persona con un animalito que es discapacitado visual, mírenlo, no puede ver nada ahí.

Entonces, ¿qué es lo que pasa? No no es solamente que los perros ven distinto que las personas, los detectores ven distintas cosas entre ellos. Entonces, es es bastante complicado el poder elegir un único detector que pueda ver todas las situaciones. Hay muchas cosas que siempre van a escapar a a cada detector. Así que es bueno tener idea de con qué estamos trabajando, en qué condiciones estamos trabajando y qué es lo que nos podemos estar perdiendo con cada uno de los detectores.

Bueno, a ver, un poco de lo que vamos a ver de los detectores de uso principal que tenemos es primero los detectores de absorción UV-Visible, que son por lejos los más utilizados, no solamente por por la la facilidad, porque muchísima cantidad de moléculas orgánicas tienen y se usan, pero muy muy fácil y son bastante bastante, como es, robustos. Después, por otro lado, vamos a tener los detectores de fluorescencia, los detectores de índice de refracción. Y ya después vamos a ir viendo algunas otras cosas más más interesantes como la dispersión de luz por evaporación o los detectores electroquímicos. Hoy en día, los espectrómetros de masa como detectores para cromatografía están cobrando una fuerza muy importante, particularmente porque son detectores que pueden detectar un rango de analitos muchísimo más grande, son muy pero muy rápidos y a su vez otorgan mucha información a partir de cada uno de esos análisis. No solamente estamos determinando que hay algo y la cantidad de ese algo, estamos sacando información estructural muy importante sobre eso. Entonces, son detectores que, si bien son bastante más caros que los otros, están cobrando muchísima fuerza por eso mismo. Eh, para los espectrómetros de masa, hoy no lo vamos a tocar porque las cosas importantes no me las dejan a mí, las cosas importantes se las queda otro, eh, no, y aparte vamos a dedicarle una una clase entera a la parte de de espectrometría de masa, una, no varias clases. Sí, y la espectrometría de masa acoplada a las diferentes tipos de cromatografía.

Bueno, esto es un cromatograma. Está. Y con eso terminamos la clase, porque ya está. Ya vieron un cromatograma, pero esto ya lo vimos en otras clases anteriores. ¿Qué más podemos ver? ¿Cómo cuantificamos un cromatograma? Esa ecuación que vemos ahí de A es igual a A * B * C, que se ve así de complicada, es una de las cosas más clásicas que ustedes han aprendido cuando hicieron las carreras, es la la ecuación de Lambert-Beer, que nos decía que cuando nosotros teníamos en un espectro y B, la forma de de calcular este, nosotros podíamos calcular la absorción de la muestra, que es A grande, era igual a la absortividad de la muestra, que es un valor intrínseco para la muestra en sí, para cada uno de los analitos, por B, que era el camino del paso óptico, por C, que era la concentración de este analito. Okay, básicamente datos muy sencillos.

¿Qué pasa? Nosotros podemos decir acá entonces, podemos reagrupar y decir que la concentración entonces va a ser dependiente de una absorción sobre la absortividad por el paso óptico. Eh, lo que sabemos acá es que la absortividad va a depender del cromóforo de cada analito y va a ser única para un analito dado. El el camino óptico que ve es el camino de la celda que estamos usando, de la celda de flujo, va a ser igual siempre cuando estamos trabajando en un mismo equipo. Entonces, a nosotros lo que, si nosotros estamos utilizando un estándar externo del cual conocemos la concentración y la absorbancia que que nos da para ese determinado componente, entonces básicamente lo único que necesitamos hallar después es la concentración de una mezcla problema. Y así es como logramos cuantificar, porque la absorbancia es el valor que nosotros vamos a obtener al integrar los picos esos del cromatograma.

Una de las cosas que que es interesante es que para nosotros poder cuantificar esto correctamente, usamos un estándar, pero siempre vamos a tener que tener una curva de calibración para este analito. O sea, tenemos distintos estándares en distintas concentraciones, podemos hallar una curva de calibración y después podemos interpolar en esa curva de calibración el valor de de la absorbancia que nosotros queremos y obtenemos el valor de concentración de nuestra muestra de problema.

Una cosa importante que hay que tener en cuenta es que nosotros hablamos de la absorbancia de los distintos analitos que nosotros tenemos, pero todos los disolventes que nosotros usamos tienen una cierta absorbancia también, ya sea a una longitud de onda más alta o más baja. Tengan en cuenta que cuanto más abajo nos vamos en las longitudes de onda, hablamos de mayores energías y si hablamos de mayores energías, hablamos de que hay mayor cantidad de cosas que absorben. Okay, si ustedes se van a 400 nanómetros, 500 nanómetros, ya en el visible, tenemos, necesitamos sistemas sumamente conjugados para que puedan absorber esa energía, porque son de baja energía. Necesitamos que esos electrones estén muy muy fugaces para que puedan absorber esa energía. Pero si nos vamos a longitudes de onda cercanas a a la parte más baja, digamos, a yo que sé, a 170 nanómetros, ya estamos hablando de fuentes muy energéticas y ya es fácil de absorber esa energía. Sí.

En este caso acá lo que tenemos es el cutoff de diferentes solventes. ¿Qué es el cutoff? El cutoff es el valor en el cual el disolvente empieza a absorber una unidad de absorbancia. Eso significa que por debajo de estos valores que nosotros tenemos acá de cutoff, sí, ya es muy difícil trabajar con estos disolventes, porque el disolvente está absorbiendo la mayor parte de la radiación y no es la muestra la que no está absorbiendo. Fíjense que para los que están marcados acá en en azul, son disolventes que se llegan a usar con frecuencia en en fase reversa, bastante usados en HPLC. Y acá están marcados los tres en rojo, los que son más usados: el agua, el metanol y el acetonitrilo. Entre todos esos, el agua y el metanol son los que tienen el cutoff más, perdón, el agua y el acetonitrilo son los que tienen el cutoff más alto y son los que nos permiten trabajar a longitudes de onda más bajas. Ya el metanol tiene un poco más de absorbancia y absorbe ya 205 nanómetros, ya no podemos trabajar, deberíamos trabajar en condiciones por encima de cutoff, ya por encima de 205 nanómetros, sí, como lo marca acá, más o menos. Por debajo del cutoff estamos trabajando en una zona oscura en la cual el disolvente está absorbiendo casi toda la radiación y por encima del cutoff es cuando podemos empezar a trabajar. Cuanto más alto sea el cutoff del disolvente, menos útil es ese disolvente para poder utilizarlo en cromatografía. Miren, en el caso de la acetona, no, 330 nanómetros. Eso significa que nosotros tendríamos que estar trabajando por encima de 330 nanómetros de medida y hay pocos analitos que absorban por arriba de 330 nanómetros.

Bien, ¿cómo funciona un detector UV en una celda de flujo? Todos más o menos tiene que acordarse cómo funcionaba este un espectrofotómetro UV, ¿no? O sea, tenemos una una fuente de de luz, si esa fuente de luz pasa a través de una celda, okay, y lo que pasa es que en esta celda parte de esa luz queda absorbida y eso llega hasta un detector. El detector va a registrar cuánto es el cero. A medida que empieza a pasar un analito a través de esta celda de flujo, no se olviden que esto está teniendo un flujo constante de fase móvil con analito, sí, a medida que empieza a pasar este analito, la intensidad de esta luz que va pasando va decreciendo, ¿por qué? Porque parte de esta luz es absorbida por este analito que está pasando. Entonces, el detector detecta que hay una menor cantidad de luz que está llegando y por consiguiente empieza a detectar que hay algo que está absorbiendo y empieza a generar un pico cromatográfico. Cuando deja de pasar analito, el pico empieza a decrecer y cuando ya no hay más analito pasando, volvemos a la línea de base otra vez y tenemos el pico formado. Muy sencillo. Sí.

Este, bueno, ahora los detectores de UV-Visible los podemos separar en tres tipos principales: detectores de lambda fija, que detectan una única longitud de onda; detectores de lambda variable, en los cuales podemos determinar qué longitud de onda queremos, pero estamos midiendo en uno solo; y detectores de arreglos de diodos, que detectan todo un rango de longitudes de onda en una forma simultánea. Y vamos a a ver un poquito de cada uno específicamente.

Esto es un detector UV de lambda fija. Están bastante en desuso últimamente, porque antes, bueno, solían ser bastante más baratos, ahora bajaron mucho los precios de otros, entonces es una cosa que está cayendo en desuso. Generalmente lo que tenía una lámpara de mercurio, sí, fija y un, eh, un filtro que permite pasar una, una longitud de onda. Esa única longitud de onda pasa a través de de la celda de flujo y tenemos un fotodiodo que registra la señal y le pasa un amplificador. Muy sencillo. Teníamos distintos tipos de filtros para elegir las longitudes de onda, entonces modificando este filtro lo podíamos mover y elegir otra longitud de onda distinta. Okay, pero solamente podíamos determinar una única longitud de onda o las que podíamos tener en este tipo de filtros, muy muy acotado. Esto ya está pasando.

La segunda opción era el detector UV de lambda variable. ¿Cómo funcionaban estos? Bueno, lo que nosotros tenemos en este detector es un juego de dos lámparas. Generalmente lo que tenemos es una lámpara de deuterio y una lámpara de tungsteno. La lámpara de deuterio es una lámpara que emite en el UV alrededor de 190 a 380 nanómetros, y después tenemos una lámpara de tungsteno que va más o menos de 380 hasta 900, dentro del rango del visible. Por consiguiente, nosotros podíamos estar trabajando en el UV, en el visible o los dos simultáneos. Sí.

Bien, estas lámparas lo que hacen es envían esta luz a través de un espejo y ese espejo llega a una celda de, perdón, a una grilla de difracción. En la grilla de difracción lo que hacemos es dispersar el haz de luz en todos sus haces componentes. Entonces, lo dispersamos en todas las longitudes de onda componentes. Esto lo que hace es hacerlo pasar este a partir de esta celda de difracción, perdón, lo que hacemos es seleccionar la longitud de onda que nosotros queremos y esa la enfocamos hacia la celda de flujo. Okay, entonces nosotros seleccionamos una longitud de onda y la hacemos pasar por esa celda de flujo. Ese haz de luz va pasando, un haz de luz monocromático pasa por la celda de flujo y llega hasta el detector, el fotodiodo que recibe manda una señal y ahí obtenemos los valores de absorbancia.

Hoy en día se está cambiando un poco este sistema. Ya los de lambda variable, ahora hay unos que se llaman lambda multivariable y se lo voy a explicar en un segundito cómo es que funciona. Pero antes vamos a hablar de el detector de arreglo de diodos. El detector de arreglo de diodos funciona de una manera distinta. Esto acá lo que hacemos es, tenemos las mismas dos lámparas, pero esta vez no tenemos la la grilla de difracción antes de la celda, sino que hacemos pasar todo el haz de luz completo a través de la celda y dejamos que la muestra absorba la longitud de onda que tenga ganas de absorber, cualquiera de ellas. Entonces, lo que vamos a pasar es un haz de luz completo va a perder intensidad en algunas longitudes de onda particulares y después de eso, ese haz de luz completo va a seguir hasta la grilla de difracción. En la grilla de difracción vamos a difractar el haz de luz y el haz de luz, este, ahora difractado con cada una de las longitudes monocromáticas, van a incidir sobre un un arreglo de fotodiodos de 1024 diodos. O sea, que ahora en vez de tener un solo fotodiodo registrando un haz de luz monocromático, tenemos un arreglo de 1024 diodos detectando todos los haces de luces a la vez, en simultáneo.

Sí, ¿qué es lo que la diferencia que tenemos grande entre el arreglo de diodos y el lambda variable que teníamos antes? Antes nosotros para cada analito, nosotros estábamos detectando, digamos, para cada unidad de tiempo que estábamos midiendo, detectamos una concentración. Ahora, para cada unidad de tiempo, nosotros detectamos un espectro UV completo, porque nosotros tenemos todos los haces de luz. Nosotros tenemos un haz de luz completo. Sí, eso es muy importante.

¿Y cuál es la diferencia entre lo que vemos? Bueno, pasamos de ver el cromatograma plano que teníamos siempre, en el cual veíamos una línea de base y picos, a ver este tipo de cosas. Esto no es lo que ven en la pantalla, la pantalla siguen viendo la cosa plana esa con un montón de picos, pero esto es una de las cosas que podemos llegar a ver. En el eje vertical tenemos la absorbancia, sí, o sea, tenemos la intensidad de la absorbancia para cada uno de los componentes. En este otro eje acá, nosotros tenemos una longitud de onda, porque no se olviden que nosotros estamos midiendo todas las longitudes de onda a la vez. Como es de esperar, las longitudes de onda más bajas, cercanas a 200, tienen muchas más cosas que están absorbiendo y las longitudes de onda más altas, acá en este caso, cercanas a 400, hay poca cosa que está absorbiendo. Y en esta otra eje que tenemos acá, en el eje Z, tenemos el time, que es el tiempo. Nosotros tenemos el tiempo en minutos que lo estamos poniendo de este lado. Si ustedes cortan en cualquier longitud de onda de estas que tenemos en este eje de acá y lo cortamos en este sentido, lo que vamos a tener es un cromatograma a una determinada longitud de onda. O sea, que acá lo que tenemos son un montón de cromatogramas en todas las longitudes de onda posibles. Sí, o sea, estamos teniendo una cantidad infinita de cromatogramas, bueno, no infinita, pero sí una cantidad muy pero muy grande de cromatogramas.

Una forma más clara a veces de verlo eso es con los diagramas de contorno. Sí, esto que tenemos acá es, imagínense lo que acabamos de ver ahora, lo anterior, esto, pero lo cortamos desde el eje de la absorbancia. O sea, que lo cortamos por acá. Si uno lo corta en este sentido, lo que va a ver, tenemos una vista superior, vamos a ver montañas de distintas alturas. Es como un mapa geográfico. Sí, si nosotros nos paramos en cualquier punto de acá, este, de este mapa, lo que vamos a tener es en este sentido, en una longitud de onda que seleccionamos, vamos a tener un cromatograma en el tiempo, que es lo que estamos viendo acá abajo, un cromatograma a una determinada longitud de onda, que en este caso son 275 nm, y vamos a tener en el otro eje, en este de acá, el espectro UV a los 26,92 minutos, como dice acá. Sí.

La diferencia grande de esto con el arreglo de diodos es la, perdón, con el lambda variable, es la cantidad de información que nosotros estamos obteniendo. Tenemos muchísima información acá. Nosotros podemos obtener la información que un lambda variable y y esa cosa la podemos repetir un montón de veces. Okay, si ustedes se fijan, tenemos un espectro para cada, el espectro UV para cada tiempo y un cromatograma para cada longitud de onda. Yo les decía que había una cosa muy parecida al lambda variable ahora que que estaban algunos, este, empresas comercializando, que es lo que se llama lambda multivariable, que es como un lambda variable, pero nos permite a nosotros medir hasta ocho longitudes de onda simultáneamente. ¿Cómo hacen eso? Bueno, en realidad lo que hacen es te venden un detector de arreglo de diodos, que últimamente han bajado de precio, pero para seguir este poniéndole un precio más alto al arreglo de diodos, lo restringen por simplemente por el software. Entonces, el software no te permite utilizar el arreglo de diodos como arreglo de diodos, sino medir únicamente ocho longitudes de onda a la vez. Son cosas que pasan.

Bien, ahora en un detector UV-Visible, ¿cómo medimos la relación señal-ruido en los detectores estos? Bien, una de las opciones básicas que tenemos es

Trabajar sobre la señal y elegir la longitud de onda máxima. Sí, si nosotros miramos, por ejemplo, este espectro que tenemos acá para uno de los componentes, si miramos este espectro UV, nosotros podemos ver claramente que en esta, en esta longitud de onda acá, que será cerca de 225, 230 nanómetros, la absorción de nuestro compuesto, la absortividad de nuestro compuesto es máxima. Si nosotros medimos acá, aumentamos mucho la sensibilidad de este componente, sin contar de que las variaciones van a ser mucho más bajas. Si nosotros medimos en este otro pico que está cercano a 275, la absortividad va a ser bastante más baja.

Otra opción es aumentar la concentración de nuestra muestra o el volumen de la inyección. Eso habíamos visto que podía aumentar la relación señal-ruido. Y la, la otra cosa es aumentar el paso o el diseño de la celda. Ustedes tengan en cuenta que cuanto más larga es la celda de flujo, los analitos tienden a dar señales más altas. Eso ya involucra el cambio de una celda en un detector UV, eso ya es un tema bastante más complejo y es una cosa que requiere otro tipo de inversión.

De repente, la otra opción era trabajar sobre el ruido. Podemos trabajar a longitud, cambiar la longitud de onda, perdón. Nosotros hablábamos de que las distintas longitudes de onda pueden tener distinta cantidad de ruido, porque justamente por el hecho de que los disolventes pueden absorber más. Ustedes se acuerdan de lo del cutoff de los disolventes. Cuanto más cerca del, del valor ese de cutoff estamos midiendo, es mayor es la absorción de, de nuestro disolvente. A medida que nosotros vamos a longitudes de onda más altas, hay menos cosas que absorben. Sí, entonces este, cuando vamos a longitudes de onda más bajas, el ruido incrementa mucho. Pienselo de esta manera: yo les decía que acá teníamos un máximo cerca de 230 y acá tenemos un máximo cerca de 275. Si bien el máximo de 275 es mucho más pequeño, seguramente a 275 nanómetros el ruido va a ser mucho más bajo también.

Otras cosas que en las que pueden afectar el ruido: la energía de la lámpara. Eso no lo habíamos mencionado hoy, pero es importante. Las lámparas tienen una, unas, digamos, una cierta cantidad de horas de vida útil y a medida que van decayendo, pierden energía y empiezan a generar mucho más ruido, particularmente a longitudes de onda bajas. La otra razón importante que pueden tener son las pulsaciones de flujo, las pulsaciones mismas de la bomba. Eso lo habíamos visto en otras clases que las pulsaciones de la bomba se pueden llegar a ver a veces en la línea de base. Hay muchas situaciones en las cuales se puede ajustar la compresibilidad de los disolventes para que mejore un poco las pulsaciones de la bomba. Sí.

Otra opción es la, la electrónica mismo, por la fuente de corriente. Si ustedes tienen una forma de estabilizar la corriente, sea con una unidad UPS, alguna otra cosa, o tener una fuente no más más estable de corriente, eso mejora el ruido electrónico. Y la otra es la composición de la fase móvil. Si ustedes tienen sistemas de, de agua ultrapura y con solventes este muy muy puros, probablemente el ruido sea menor que si se utiliza un buffer, que usamos una sal cualquiera para disolver, o disolventes que no son de la calidad adecuada.

Bueno, ahora vamos a comparar un poquito estos dos detectores: el de lambda variable y el de arreglo de diodos. Una de las ventajas que tienen los detectores de lambda variable, no así el tema lambda multivariable que yo les mencionaba, es que tiene una mejor relación señal-ruido. Sí, eh, tiene menos ruido intrínsecamente porque estamos trabajando con un único haz de luz. Es, este es un haz monocromático. Es mejor para un análisis cuantitativo cuando se trabaja bajas concentraciones y en general son más económicos que los arreglos de diodos. Pero el arreglo de diodos tiene otra serie de ventajas, como que podemos obtener mucha más cantidad de datos en un análisis, se pueden hacer análisis simultáneos de muchos analitos y son ideales para el desarrollo de métodos, particularmente para cuando se trabaja con componentes de los cuales no se sabe los máximos de de absorbancia. Si nosotros no sabemos en qué punto está absorbiendo un compuesto porque desconocemos el espectro UV de ese compuesto, tener un detector de arreglo de diodos nos permite obtener todos esos datos de una. Tiene más cantidad de aplicaciones y, y requiere una contraindicación es que requiere sistemas de proceso de datos que sean bastante más veloces. Eso me olvidé, pero deberías haberlo sacado porque en realidad la velocidad a la que crece la, la tecnología informática es muchísimo más rápida que la de que se viene generando detectores nuevos. Esto era un problema hace unos años atrás. Hoy en día la velocidad de las computadoras no es la limitante de ninguna manera para, para trabajar con un detector de este estilo. Los datos que generan un arreglo de diodos de ninguna manera pueden superar la velocidad a la que trabaja hoy en día una computadora. Ah, bueno, ahí tenemos la, la tensión con los, los multivariables que yo les mencionaba hoy.

Bien, ahora vamos a hablar del detector de fluorescencia. El detector de fluorescencia, en realidad, es bastante similar al detector de UV o de diodos. Nosotros en este caso tenemos una lámpara de xenón que va sobre una, una, una grilla de difracción. Tenemos y seleccionamos una longitud de onda que vamos a hacer pasar por la celda. Sí, pero esta vez nosotros no vamos a monitorear esa longitud de onda que pasa a través de la celda. ¿Qué es lo que pasa? Nosotros, las muestras van a tener que fluorescer a partir de eso. Sí, ahora lo vamos a revisar cómo era el mecanismo de la, de la fluorescencia, pero esa muestra va a tener que fluorescer y al fluorescer, esa muestra va a emitir en una longitud de onda distinta. Esa longitud de onda distinta es lo que nosotros vamos a medir. Esta longitud de onda que sale a través de la muestra, gracias a la excitación que tenemos por la longitud de onda que nosotros seleccionamos, esa la vamos a, a enfocar y vamos a, a detectarla. Sí, lo que estamos hablando acá es que necesitamos dos longitudes de onda: una longitud de onda de excitación que tenemos que seleccionar y una longitud de onda de fluorescencia que también vamos a tener que detectar después.

Bueno, ¿cómo era que funcionaba la fluorescencia? Es un fenómeno bastante interesante. La fluorescencia es cuando nosotros tenemos a través de, eh, una estimulación por energía lumínica, nosotros tenemos un decaimiento de energía por una capa distinta. Entonces, ¿qué es lo que sucede? Ese decaimiento de energía genera una emisión de luz y esa emisión de luz no va por los mismos mecanismos por los cuales excitó. Entonces, esa emisión de luz sale en un espectro distinto. Si ustedes se fijan acá, esta es la quinina. La quinina tiene un espectro de excitación como el que vemos acá. Sí, esta es la absorción UV de la quinina. Cuando la quinina absorbe radiación UV, emite un espectro de fluorescencia que se ve así, como este. En general, cuando uno tiene una emisión por fluorescencia, el espectro que se genera en esa emisión por fluorescencia, eh, va a longitudes de onda más altas que el espectro de absorción. Entonces, si nosotros acá seleccionamos una longitud para, para excitar la molécula alrededor de 250 nanómetros, vamos a tener que después recibir la, la nueva emisión lumínica alrededor de 450 nanómetros. Fácil, ¿sí?

¿Cuáles son las ventajas de trabajar con fluorescencia y cuáles son las desventajas? Una de las ventajas más lindas que tiene trabajar con fluorescencia es la sensibilidad. Primero, la emisión es, es, este, generalmente a longitudes de onda bastante altas, los cuales habíamos dicho que habían pocas cosas que estaban, este, absorbiendo ahí. O sea, que no, no hay mucha radiación parásita en ese nivel, no hay nada que nos moleste. Eh, esa es una de las cosas buenas. La, la otra cosa que tiene interesante es que como estamos trabajando en una longitud de onda prácticamente aislada, la sensibilidad de nuestro método se vuelve súper buena. Si ustedes se fijan acá, para los distintos compuestos que tenemos ahí dibujados, el pindolol, el metoprolol y el propranolol, los tres compuestos que son fluorescentes, si ustedes miran la relación señal-ruido, este, para un detector UV de arreglo de diodos, que es la que tenemos acá, para el pindolol es 354, para el 9.4 y para el propranolol 72. Pero la relación señal-ruido en las mismas concentraciones para un detector de fluorescencia suben de 35 a 135, de 9.4 a 3300 y de 72 a 19000. O sea, que la sensibilidad que nosotros tenemos en este tipo de compuestos es ya casi que abusiva.

¿Cuál es el problema más grande que tenemos con, con este tipo de detectores? Es que prácticamente ningún compuesto es fluorescente. Entonces, la cantidad de compuesto que nosotros realmente podemos tratar de evaluar por este tipo de detectores es muy, pero muy baja. La ventaja, cuando podemos tratar de medir algo, lo podemos medir en cantidades cuasi que homeopáticas. O, sí, este, la gente inclusive que trabajaba con detectores de fluorescencia con propranolol tenía problemas de que no había forma de limpiar el material de vidrio como para poder seguir trabajando después, porque siempre daba residuos, no importa cuánto lo lavaras.

Bueno, ahora lo que vamos a ver es el, el detector de índice de refracción. Otro detector que ha sido bastante interesante por unas simples razones, que es un detector que los, que se llama de tipo universal. ¿Qué es un detector universal? Un detector universal es un detector que puede medir cualquier tipo de analito y se diferencian de los detectores específicos, que son detectores que miden una determinada propiedad en determinados, eh, este, en determinados analitos. Un detector de fluorescencia es un detector sumamente específico. Un detector de índice de refracción es un detector universal. ¿Cómo funciona? Bueno, el detector de índice de refracción lo que mide es la refracción de la luz cuando pasa de un medio a un medio distinto. ¿Cómo funciona? Nosotros tenemos acá una lámpara que está emitiendo luz. Sí, y acá lo que tenemos es una celda doble. En uno de los lados tenemos la fase móvil únicamente y en el otro de los dos lados, esto está separado por un cristal en el medio, y en la otra parte de la celda tenemos la fase móvil que está circulando desde la columna. Y acá lo que tenemos es un fotomultiplicador que recibe la señal. ¿Qué es lo que pasa? Cuando nosotros empezamos a pasar un eluyente con una muestra a través de, de la segunda cámara, que es la que está corriendo, lo que va a pasar es que la luz esa va a venir y se va a encontrar pasando por un medio, luego va a llegar a un medio de una composición distinta y eso lo que va a producir es una, una refracción de la luz. Esa refracción va a generar un ángulo en el cual esa luz se va a torcer y, por consiguiente, la luz que llega al fotomultiplicador va a ser, va a ser menor. Okay, básicamente, si uno lo mira así en todo un, un esquema, nosotros tenemos un esquema doble de circulación de la fase móvil en el cual uno de los dos esquemas pasa y circula la fase móvil a través de, de la media celda. Sí, y cuando tenemos este un analito, el analito va a girar y va a circular por el otro lado de la muestra. Okay.

Bien, ¿cuáles son las ventajas de esto? Bueno, primero que tiene una respuesta universal, o sea, no nos importa el tipo de analito que estamos trabajando, no tiene porque tener un cromóforo como en el caso de los detectores UV y no requiere derivatización, porque muchas a veces cuando uno quiere medir un compuesto que no es UV activo en un detector UV, necesitamos hacer una derivatización para agregarle el cromóforo. Pero tiene sus desventajas también. Una de ellas es que requiere una muy alta homogeneidad de la temperatura. Pequeños cambios en la temperatura pueden dar que el índice de refracción cambie bastante, porque cambia la refracción del, del mismo disolvente, pero estamos hablando de pequeños cambios de tipo de 0.1 grados de temperatura. La celda tiene que estar sumamente estable en temperatura.

La segunda desventaja es que no permite utilizar gradientes de flujo ni de temperatura. La temperatura no la podemos modificar y el flujo, perdón, la composición, no la podemos cambiar. No podemos cambiar la composición de la fase móvil porque si vamos cambiando la composición de la fase móvil, vamos a tener modificaciones dentro de esta celda que estamos moviendo con respecto a la celda anterior. Va a estar cambiando la fase móvil que está pasando. Y la otra desventaja, para mí entender, la más importante de todas, es que en realidad tiene una baja sensibilidad. Si bien son universales, requerimos tener una muestra bastante concentrada para poder generar un índice de refracción lo suficientemente visible para el detector. Ve, cualquier cosa, pero tiene que estar bastante cantidad para poder verlo.

Uno de los detectores que, que vino a, digamos, hacer una, una modificación en este sentido de los detectores universales es el detector de dispersión de luz por evaporación. El detector de dispersión de luz por evaporación, básicamente lo que hace es formar una niebla o un aerosol con un analito que viene en una fase móvil. Sí, lo que nosotros tenemos es una entrada de lo que viene el eluyente que entra por este lado y una entrada de gas por este sector. Esto va a formar un aerosol con eso. Que el aerosol se va a ir secando y va a generar pequeñas partículas de analito que van a viniendo a esta zona y esas partículas de analito lo que van a hacer es van a dispersar un haz de luz que viene en sentido perpendicular y nosotros vamos a medir esa dispersión de la luz para determinar la presencia de un analito cualquiera sea. Lo bueno que tiene es que es un detector universal. Cualquier cosa que pase a través de ahí va a generar una pequeña partícula que va a dispersar la luz. Pero una desventaja que tienen es que solamente funciona con analitos que no sean volátiles. Cosas que sean muy volátiles se pueden llegar a ir junto con el disolvente que se está yendo, se está secando de ahí. Es bastante más sensible que el índice de refracción, lo cual lo hace bastante bueno para eso, pero en general necesitamos que sus analitos tengan un peso molecular de medio a alto. Sí, como les decía, tiene una respuesta universal, no requiere cromóforos en el analito, no requiere la derivatización, lo mismo que en el índice de refracción. Es compatible con los gradientes porque en este caso no nos importa a nosotros que estar modificando la fase móvil. La fase móvil se va a evaporar, este, a posterior y tienen una gran estabilidad en la línea de base porque la mayor parte del solvente se está yendo, o sea, que la línea de base tiende a ser mucho más estable.

La desventaja es que se pueden perder los analitos volátiles porque al volatilizar con esta nebulización de gas, eh, podemos perder los, los analitos que son más volátiles. Necesitamos algo más o menos pesado para que se quede. Y requiere una gran cantidad de gases secos para estar generando este, este aerosol de del, de analitos y, por consiguiente, requiere un escape para todo este gas que va cargado de disolventes. A su vez, necesitamos tener una forma de extraerlo. Sí.

Bueno, acá tenemos, eh, un ejemplo en el cual mostramos un detector UV y un detector de dispersión de luz por evaporación para dos analitos convencionales que son aspirina y fenacetina. Ahí está las condiciones cromatográficas aquí arriba. Sí, una de las cosas que podemos ver interesantes es que nosotros tenemos acá el frente del disolvente en el detector UV, el pico de, de la aspirina y posterior el pico de la fenacetina y un pico de algo más que aparece ahí abajo, pues un ruido, no sé lo que es exactamente, alguna impureza. Al compararlo con el pico de, del, perdón, con el cromatograma del detector de dispersión de luz por evaporación, una cosa clara que se ve es lo limpia de la línea de base. Ya desaparece prácticamente en su totalidad al frente del disolvente, ya no hay más disolvente y la otra cosa es que los dos picos tienen un tamaño similar. La respuesta del detector ya no depende del cromóforo, depende simplemente de la cantidad de ese analito y nada más.

Pero yo les decía que había un problema grande que podíamos tener con los analitos que fueran volátiles. Sí, bueno, hay una situación de lo que se puede solucionar un poco eso. Acá tenemos un ejemplo del control de la temperatura de la vaporización ante la pérdida de analitos volátiles. Tenemos cuatro analitos: la acetanilida, indapamida, ibuprofeno y dibutilftalato, este, y todos estos analitos tratados en el mismo detector, mismas condiciones, cambiando la temperatura de la nebulización. Trabajando a una temperatura de 50 grados, que es el cromatograma superior, básicamente tres de los cuatro analitos se ven muy poco porque se están perdiendo por volatilización. Si lo miran también, el ibuprofeno, el dibutilftalato, la acetanilida, tampoco es que sean tan volátiles, pero se pueden llegar a perder. Es una temperatura bastante alta. Ya bajando una temperatura de 35 grados, empezamos a mejorar mucho la situación para estos picos, empiezan a aparecer bastante más. Y trabajando una nebulización ambiente, si bien ya la línea de base ya no es tan limpia como era anteriormente, se logra obtener en mucho mejor cantidad todos los analitos como para poder cuantificarlos e inclusive se puede llegar a trabajar a temperaturas inferiores al ambiente y obtener mejores resultados para analitos volátiles. O sea, que es un detector bastante, bastante práctico en este sentido. Sí.

Acá lo que tenemos es trabajando a temperaturas más bajas del ambiente. Acá tenemos las estructuras de los cuatro compuestos. Sí, si se fijan acá, trabajando ya a 15 grados de temperatura, se obtienen unas señales bastante buenas. Sí, para todos los, los analitos.

Bueno, el último detector que íbamos a ver este hoy era el detector electroquímico. El detector electroquímico, eh, se basa básicamente en las capacidades redox de nuestros analitos. Lo que hacemos es verificamos la oxidación o reducción de analitos, porque la oxidación y la reducción de estos analitos va a generar una corriente eléctrica y esa corriente eléctrica la nosotros la vamos a tratar de medir con una serie de electrodos. Sí. Lo interesante que tiene esto, primero, es que las corrientes eléctricas esas se pueden medir a veces en cantidades bastante pequeñas. Sí, pero tiene sus contraindicaciones. Se puede solamente aplicar para fases móviles que sean conductivas. Nosotros podemos trabajar, este, podemos medir en realidad esa corriente eléctrica que se está formando por la oxidación o la reducción de analitos solamente si nuestra fase móvil puede llegar a conducirlo. Y eso está casi que restringido a lo que es el modo reverso, trabajar con soluciones acuosas con un modificador orgánico. Esto no se puede aplicar de repente en el modo normal, trabajando con hexano, isopropanol como fase móvil, porque no es una fase móvil conductiva. Sí, y la selectividad para los determinados analitos se puede ajustar dependiendo del potencial que se aplica entre los dos electrodos: electrodo de trabajo y el electrodo auxiliar. Sí.

Ventajas: detecta este cantidades muy, pero muy, pero muy bajas de compuestos que se oxidan o que se reducen. Sí, pero necesitamos que se oxiden, sean factibles de que se puedan oxidar o que se puedan reducir. Son muy selectivos, porque si bien es una, este, es una técnica que es específica, se vuelve muy selectiva por eso mismo. Por donde es una ventaja, es una desventaja también. Es muy selectivo porque solamente compuestos que se oxiden o se reduzcan pueden ser afectados por esto. Tiene un rango lineal bastante grande, que eso es una ventaja buena. Y las desventajas es que la performance depende mucho del analito, depende de las capacidades, las cualidades redox de ese analito. También, que el modo de reducción se puede afectar por el oxígeno disuelto, porque el oxígeno puede pasar a reducirse. Entonces, este, es complicado, hay que desgastar correctamente las fases móviles y eliminar bien el oxígeno antes de trabajar. Y, claro, detecta pocos analitos. Es muy selectivo, bárbaro, pero detectamos pocas cosas. Entre los, los compuestos que se pueden llegar a tratar de de analizar, bueno, en la parte de oxidación tenemos fenoles que se oxidan a quinonas, aminas que se oxidan a nitrosaminas o o n-óxidos, quinol. Y si no, la parte de reducciones: tenemos azocompuestos, nitrocompuestos o tioles.

Bien, ¿cómo funciona básicamente esto? Bueno, nosotros tenemos este un ingreso de nuestros componentes, sí, en la fase móvil y nuestros componentes se van a ir acercando al electrodo de trabajo. Okay, y hay una diferencia de potencial que está determinada entre el electrodo de trabajo y el electrodo auxiliar. En el electrodo de trabajo, nuestro compuesto, en este caso, que es un, es un catecol, el catecol va a oxidarse formando una ortoquinona.

...ruido y si nosotros lo disminuimos para mejorar el ruido, disminuimos la intensidad de la señal porque estamos generando menos reacciones electroquímicas. Sí.

Bueno, eh, lo que les decía, son muy sensibles, son muy específicos y cuando hablamos de sensibilidad, tratemos de ver acá, por ejemplo, la comparativa entre un detector UV visible. Acá vemos, este, cómo es nuestro, nuestro de componente. Okay, es, sí, y acá lo tenemos con el detector electroquímico. Okay. Y podemos ver la variación de las señales. Acá tenemos el, el gluta, claramente marcado, y acá tenemos el aumento de la señal del gluta ya reducido en este tamaño. Sí, si ustedes se fijan, el límite de detección en picogramos para un detector UV a 280 nanómetros, lo tenemos acá en esta, en esta gráfica, es de 100 picogramos, mientras que para un detector de fluorescencia es de 20 picogramos. Estamos hablando de la cantidad mínima que podemos medir y estamos hablando de picogramos, es una cantidad muy baja. Y un detector electroquímico, estamos hablando de un picogramo, o sea, son 15 veces menos que en un detector UV la cantidad que se puede detectar. Eso es mucho. Una cosa importante es no confundir con el detector ECD, porque electroquímico en HPLC no es lo mismo que el ECD en GC, son cosas distintas.

Bien, y ahora vamos a hacerlo medio rapidito así, una comparativa de los detectores. Bien, acá en esta tabla, básicamente podemos determinar para cada uno de los detectores el rango lineal en el cual, en general, se se tiende a trabajar, los rangos de concentraciones en gramos por mililitro, sensibilidad de cada uno de los detectores y la selectividad. El UV visible, como podemos ver, tiene una sensibilidad en el orden de 0.05 partes por millón y es, es selectivo, sí, porque en realidad necesitamos tener cromóforos en la muestra. El, el arreglo de diodos tiene, tiene una sensibilidad un poquito más alta que el UV visible, este, estamos hablando un lambda variable cuando hablamos de este sentido. También es selectivo porque en realidad la forma de detección es igual que el UV visible. El de fluorescencia tiene ya un nivel de detección de una parte por billón, pero la selectividad es que es muy selectivo porque hay muy pocas cosas que realmente florecen. El detector de índice de refracción tiene un límite de detección ya para una parte por millón. Si ustedes se fijan, es, este, es 10 veces menos sensible que un detector de arreglo de diodos, pero tiene la ventaja de ser universal. El detector de, de, como es, de dispersión de luz, tiene una sensibilidad de 0.2 partes por millón, es un poquito menos sensible que un arreglo de diodos, pero también es universal. Y ya después pasando al electroquímico, que habíamos como habíamos dicho, es una sensibilidad eh, ridículamente baja y es bastante selectivo al momento de trabajarlo, porque hay una serie de compuestos bastante, bastante acotada de la cual se puede llegar a medir. Sí.

Y bueno, eh, esto es simplemente un, un sistema para que lo, lo piensen, eh, de cuáles les parecen a ustedes que se pueden llegar a, a poner en, en los sistemas, cuáles podríamos acoplar en serie y cuáles deberíamos acoplar en paralelo. La idea de acá también es tener una idea de estos detectores, porque los detectores, algunos de ellos, si bien hablamos los separamos por selectivos y no selectivos, también se pueden clasificar por destructivos y no destructivos. En base a lo que nosotros vimos hoy, algunos de estos detectores ustedes van a poder ver que las muestras las pasan tal cual, las analizan y las devuelven tal cual, y algunos de estos las muestras las destruyen en el proceso. Entonces, piensen un poco pensando en si la muestra puede seguir de largo entre un detector y otro, si se pueden acoplar en serie o en paralelo utilizando estos detectores que tenemos acá abajo. Bueno, esperen que no, esto que tenemos acá abajo. Sí. Y cómo los acomodarían ustedes en el caso de tener que hacerlo.

Y bueno, eso es todo. Eh, no se olviden de participar en los foros si tienen dudas y tratar de hacer las las preguntas de de autoevaluación. Bueno, muchas gracias y será hasta el próximo video.