Defesa de Doutorado - Bianca Gomes Fernandes

A todos vocês que vieram para avaliar a Bianca, a Bruna, o Geraldo, a Vivia, e a Raquel, muito obrigada, né? Uma honra tê-los vocês aqui conosco, né, para avaliar essa tese.

Eh, então, estamos aqui reunidos para participar da defesa de tese da aluna Bianca Gomes Fernandes, intitulada "Acurácia da biópsia líquida para a detecção de mutações em Kras, Nras e Braf em lesões colorretais: estudo comparativo com análise tecidual". A Bianca foi orientada por mim. Para ela receber o título de doutor, ela precisa de completar 25 créditos na PPG. Ela já fez isso, ser aprovada no exame de qualificação, também já foi, e ser aprovada, então, eh, nessa avaliação de hoje. Então, já, como eu já falei, a banca é composta por mim, pela Raquel, eh, Dr. Geraldo, Dra. Vívia e Dra. A Bianca vai ter então cerca de 40 minutos para fazer a sua apresentação. Depois a gente volta para a reunião. Boa apresentação, Bianca.

Obrigada. Eu vou começar a compartilhar minha tela. Vocês conseguem visualizar minha tela? Sim.

Certo. Pessoal, excelente tarde a todos. Eu sou a Bianca Gomes do Programa de Pós-Graduação em Medicina Molecular e irei eh apresentar hoje meu trabalho intitulado "A acurácia da biópsia líquida para detecção de mutações em Kras, Nras e Braf em lesões colorretais. Estudo comparativo com análise tecidual". Estudo feito sob supervisão e orientação da professora Luciana Bastos Rodrigues. Essa apresentação é composta pela introdução, referencial teórico, objetivos, métodos, resultados, discussão, conclusão, referências e informações adicionais.

A princípio, é importante entender que o câncer colorretal compreende tumores que se originam na porção do cólon ou reto e representa uma das principais morbidades e mortalidades a nível global, sendo no Brasil a terceira causa de neoplasia maligna de maior incidência. O câncer colorretal, ele surge a partir de fatores modificáveis, como alimentação inadequada, etilismo, tabagismo, obesidade e fatores não modificáveis como histórico pessoal e familiar de câncer, etnia, gênero, idade e outros. A partir desses fatores de risco, nós temos um eh um perfil celular mais favorável à ocorrência de alterações genéticas. O acúmulo dessas alterações genéticas, com a idade, podem desregular o mecanismo de divisão celular, gerando uma massa de células, uma hiperproliferação que nós identificamos a princípio como um pólipo, que corresponde a essa massa de células na mucosa intestinal. Esses pólipos, se permanentes ali os fatores de risco, nós podemos ter um acúmulo de alterações genéticas, levando essas lesões precursoras a se tornarem o adenocarcinoma. Muito importante eh observar que de lesões precursoras até a formação do adenocarcinoma, nós temos mecanismos biomoleculares de lenta evolução para malignidade. Considerando essa evolução lenta, isso nos dá abertura para a aplicação de atividades preventivas. Daí o rastreio e detecção precoce do câncer colorretal têm substancial importância.

Porém, o rastreio e o diagnóstico precoce atual, eles são circundados por limitações. A colonoscopia, embora seja o método padrão ouro, é um método invasivo de alto custo, que requer uma necessidade de preparação intensa. Outras formas de avaliar envolve sangue oculto nas fezes, que é um método complementar, mas que também apresenta limitações, apresenta uma baixa sensibilidade e especificidade para adenomas avançados e também para o câncer colorretal em estágio inicial.

Frente a essas limitações dos métodos atuais, surge a biópsia líquida, que funciona da seguinte forma. As células, ao morrerem, seja por necrose ou apoptose, elas liberam parte do seu DNA na corrente sanguínea. Um DNA muito fragmentado, por isso apresenta em torno de 70 a 200 pares de base. E esse DNA, se ele vier a partir de células tumorais, nós identificamos como DNA tumoral circulante ou também chamado de ctDNA. Vale enfatizar que essa técnica, ela permite analisar o DNA livre de células que está circulando no plasma mesmo em concentrações pequenas.

Voltando um pouco no surgimento do câncer colorretal a partir de lesões precursoras, nós temos os pólipos que podem ser classificados em não neoplásicos, também conhecidos como pólipos não adenomatosos, inclui pólipos inflamatórios, linfoides, hamartomas. E nós temos os pólipos neoplásicos, que são mais relevantes quando pensamos na progressão para formação do câncer colorretal. Esses pólipos neoplásicos, eles são subdivididos ainda em adenomatosos, também chamados de adenomas convencionais, que são classificados de acordo com o grau de displasia em baixo grau ou alto grau, de acordo também com a sua histologia, que pode ser tubular, túbulo viloso ou viloso. Viloso, se tiver mais de 75% de componentes de vilosidade. E temos esses pólipos neoplásicos também sendo classificados em pólipos serrilhados. Os pólipos serrilhados se subdividem em pólipos hiperplásicos, lesões serrilhadas sésseis e adenomas serrilhados tradicionais.

Progressão desses pólipos até a formação do adenocarcinoma envolve três vias principais. A primeira delas e mais estudada, a via adenoma-carcinoma ou instabilidade cromossômica, que surge a partir de mutações no gene APC e que progridem aqui de adenoma precoce para adenoma avançado e até chegar no câncer colorretal com mutações envolvendo genes, por exemplo, KRAS, NRAS e TP53. Outra via é a de instabilidade de microssatélites, que surge a partir de alterações de eh genes de instabilidade eh e que gera diretamente a formação do adenoma em câncer colorretal e também pode ter alterações aqui no gene APC. A outra via, a via serrilhada ou fenótipo de metilação das ilhas CpG, que vem a partir de mutações em BRAF, a partir de metilação e também pode envolver o gene TP53. Dentre todos esses perfis moleculares e genes envolvidos, são recomendadas avaliações de instabilidade em microssatélites e avaliação de mutações em KRAS, NRAS, genes esses que serão melhores abordados a seguir.

Para a via adenoma-carcinoma ou instabilidade cromossômica, aqui nós pensamos principalmente nos genes NRAS e KRAS. É a via mais estudada, surge a partir de adenomas, tem um percentual, representa ali em torno de 70 a 85% dos casos eh de câncer colorretal esporádicos e que tem uma progressão um pouco mais lenta que leva ali em torno de 10 anos ou mais. Quando a gente pensa na avaliação de KRAS, é muito relevante avaliar, uma vez que quando a gente tem uma alteração em KRAS, nós podemos ter uma proliferação celular descontrolada e um aumento da sobrevivência celular, favorecendo a progressão e o surgimento do câncer colorretal. Em termos de frequência, alterações em KRAS são vistas em torno de 40% dos cânceres colorretais. O NRAS, embora ele seja menos frequente, então aparece ali em torno de 5 a 10%, ele é muito relevante pensando no seu pior prognóstico.

Outra via é a de instabilidade de microssatélites, que surge a partir de adenomas associados à síndrome de Lynch. Envolve em torno de 10 a 15% dos casos de câncer colorretal e o tempo de evolução é um pouco mais breve. Então a gente tem de 1 a 3 anos. Bom, alterações envolvendo a instabilidade de microssatélites envolve mecanismos epigenéticos. Em 80% dos casos, nós temos metilação do gene MLH1. Mutações em APC, em BRAF também são comuns quando a gente pensa na progressão dessa via. E aqui nessa via nós temos o diagnóstico feito principalmente por cinco marcadores de microssatélites. É o famoso painel de Bethesda.

A via serrilhada ou fenótipo de metilação das ilhas CpG envolve o gene BRAF. E aqui nós temos o surgimento a partir de adenomas ou pólipos serrilhados sésseis. Acontece em menos de 5% dos casos de câncer colorretal e o tempo estimado para evolução é de um meio termo ali em torno de 5 anos. Essa via ainda, ela pode ser subclassificada em CIN alto ou CIN baixo. CIN alto se tiverem mutações em KRAS e BRAF, e CIN baixo se tiverem mutações em KRAS. Mais da metade dessas instabilidades de microssatélites surgem como resultado da metilação de MLH1. Alterações no gene BRAF envolvem em torno de 10% dos casos de câncer colorretal. E também tem um papel muito importante no início e na progressão para o surgimento do câncer.

O método padrão ouro para avaliar alterações moleculares em tecido envolve o sequenciamento de DNA. Então, primeiro, a reação de PCR, seguida de reação de sequenciamento e análise desse sequenciamento. Todavia, o sequenciamento de DNA, ele envolve limitações principalmente em termos de sensibilidade. Ele requer uma alta frequência de alelos mutados em torno de 10 a 30%. Em comparação com o sequenciamento, a técnica de PCR digital em gotas é uma técnica altamente sensível que requer uma frequência alélica de mutação muito baixa, em torno de 0,01 a 0,05% para já capturar uma detecção.

Como que funciona a técnica de PCR digital? Primeiro é preparada a reação de PCR. Essa reação, ela é distribuída em um cartucho e são geradas gotas em torno de 20.000 gotículas a partir dessa tecnologia microfluídica. E essas 20.000 gotículas são uniformes e elas podem apresentar um conteúdo intra entre a gotícula variado. Então, nós podemos ter gotículas só com eh fragmentos de DNA selvagem. Nós podemos ter gotícula só com fragmento de DNA mutado. Podemos ter gotícula que não recebeu distribuição de material genético e podemos ter gotículas mistas que contêm material genético mutado e selvagem. Em seguida, após essas gotas serem geradas, elas são transferidas para uma placa e seguem para o termociclador, para o processo de amplificação. Logo após, temos a emissão de fluorescências. Fluorescência HEX para gotículas que têm apenas material selvagem. E aqui está representado na cor verde. Temos as gotículas que emitem a fluorescência FAM, que é a fluorescência para a mutação, aqui representada na coloração azul. Aquelas gotículas que não tinham material genético, não vão emitir nenhuma fluorescência, aqui representada em cinza. E as gotículas que tinham o material genético misto vão representar as duas fluorescências. Então aqui está ilustrado na coloração laranja. Depois essa placa com as amostras amplificadas são levadas a um leitor que vai gerar gráficos com a distribuição dessas gotículas. Quadrante superior esquerdo, só as gotículas com a fluorescência FAM para mutação. Superior direito, as gotículas eh mescladas com mutação. Inferior direito, só selvagem. E inferior esquerdo, as gotículas que não apresentaram nenhuma fluorescência.

Frente a essa contextualização, o objetivo geral do nosso estudo foi avaliar a acurácia da biópsia líquida para detecção de mutações nos genes KRAS, NRAS e BRAF em lesões colorretais, utilizando como padrão de referência a análise molecular do tecido obtido por colonoscopia.

De forma mais específica, o nosso objetivo foi caracterizar a população do estudo, comparando o perfil clínico dos pacientes sem lesão, com lesão precursora e com câncer colorretal. Identificar mutações nos genes KRAS, NRAS, BRAF, no DNA dessas lesões colorretais por meio da PCR em tempo real. Averiguar a frequência de marcadores tumorais em DNA tecidual de pacientes com lesão precursora ou câncer colorretal. Detectar e quantificar variantes alélicas no cfDNA plasmático, utilizando a PCR digital em gotas, e comparar a concordância entre os achados moleculares no tecido e no cfDNA, avaliando principalmente a sensibilidade e a especificidade da biópsia líquida para detecção dessas alterações genéticas.

Para alcançar esses objetivos, traçamos o seguinte delineamento metodológico. Todas essas etapas serão abordadas com mais detalhes a seguir. Em suma, o projeto ele passou por aprovação do comitê de ética. Realizamos a seleção dos participantes, dos dados clínicos. Ah, coletamos amostras teciduais que foram avaliadas de acordo com os seus aspectos histopatológicos. Avaliamos o DNA extraído dessas lesões por PCR em tempo real. Em relação às amostras de sangue, essas amostras passaram pela separação de plasma, isolamento do cfDNA, PCR digital em gotas e, por fim, nós realizamos a análise estatística sobre cada uma delas.

A princípio, nosso projeto pelo comitê de ética do hospital e também do Para selecionar os participantes, nós vimos os seguintes critérios de inclusão. Selecionamos pacientes com idade acima de 18 anos com assinatura do TCLE que apresentavam no mínimo um dos fatores abaixo: história pessoal e ou familiar de câncer, exceto já o diagnóstico prévio de câncer colorretal; história pessoal e ou familiar de pólipos; presença de sangue nas fezes e ou anemia; sintomas sugestivos de lesão no trato gastrointestinal; exame de imagem com suspeita de lesão no trato gastrointestinal. E os critérios de exclusão envolveram pacientes menores de 18 anos, história pregressa de câncer colorretal, intercorrências ali durante a realização do exame, falha na coleta de sangue, ausência da análise da biópsia e lesões com outros diagnósticos como eh, por exemplo, retite, colite, que não se enquadravam nas lesões da progressão para o câncer colorretal.

Os pacientes foram então agrupados em um grupo que nós denominamos como controle para os pacientes que não apresentaram nenhuma lesão e em um grupo caso, que foi ainda substratificado em caso 2 para lesão precursora e 3 para câncer colorretal. Os dados clínicos eles foram obtidos por meio de entrevistas e consultas a prontuários aos prontuários eletrônicos e físicos.

Nas amostras estudadas, nós obtivemos os tecidos lesionados a partir da colonoscopia. Eles foram obtidos em bloco de parafina a partir do setor de anatomia patológica do hospital. E o sangue nós coletamos em torno de 10 ml de sangue. Essa coleta, ela foi feita antes da realização da colonoscopia em tubo Paxgene, que é um tubo especial para conservação do cfDNA. E a coleta, ela foi feita pela equipe do hospital na sala de preparo para colonoscopia.

As amostras de tecido foram então submetidas à análise histopatológica para identificação dos fragmentos com maior representatividade de alteração. Em seguida, a amostra de tecido, ela foi processada e nós obtivemos o DNA tecidual dessas lesões para fazer a avaliação dos genes KRAS, NRAS e BRAF a partir de PCR em tempo real. Vale enfatizar que essas amostras foram previamente quantificadas em Nanodrop e a diluição foi feita para 50 ng por microlitro.

Em relação à biópsia líquida, o sangue depois de coletado, ele passou por uma dupla centrifugação para separar o plasma. Essa dupla centrifugação, ela é importante para evitar contaminação com anel de leucócitos. As amostras de plasma, então, foram alicotadas em tubinhos com volume de 1 ml e armazenado a -80ºC. O isolamento do cfDNA foi feito a partir de 2 a 4 ml de plasma, 4 ml, sempre que disponível, a partir de um kit com beads magnéticas. E a PCR digital, ela foi realizada em colaboração com dois laboratórios, o laboratório Personal e a plataforma da Fiocruz, seguindo sempre todos os padrões e os controles necessários para a realização da técnica.

Estabelecemos também o limite de branco e o limite de detecção. Para realizar o limite de branco, nós obtivemos no mínimo 20 amostras de pacientes do grupo 1. Para cada marcador avaliado, nós coletamos o valor de cópias por microlitro especificados no canal FAM. Fizemos a média desses valores e também o desvio padrão. Com esses dois resultados, a gente já consegue utilizar a fórmula do LOD, que inclui a média do branco mais esse valor, que é uma constante vezes o desvio padrão. Com isso, nós obtemos o LOD, que é o maior sinal esperado na ausência ali do analito. Então, representa um pouco de ruído que a técnica pode apresentar. E o limite de detecção envolveu uma amostra sabidamente positiva. Essa amostra nós diluímos ela para 20 ng por microlitro e fizemos diluições seriadas de 10 vezes. Cada uma dessas diluições seriadas, elas foram avaliadas em triplicata e obtivemos o cálculo do desvio padrão dessas triplicatas. E também obtemos lá o valor do LOD para incluir na fórmula do LOQ. Então, o LOQ a gente consegue obter a partir do valor do LOD calculado anteriormente vezes essa mesma constante vezes o desvio padrão aqui calculado anteriormente. Com isso, a gente obtém o menor nível confiável para dizer que valores a partir daquele resultado são considerados positivos. E com isso a gente minimiza as chances de falsos positivos dentro eh dessa análise.

A análise estatística também foi feita em relação aos dados clínicos, avaliação patológica e caracterização molecular. Para isso, nós utilizamos vários testes para avaliar a normalidade dos dados, para resumir os dados estatísticos, para comparar variáveis numéricas com variáveis categóricas, para comparar variáveis categóricas umas com as outras e também para estimar medidas de efeito. Por fim, fizemos também as matrizes de contingência 2x2 para avaliar o desempenho global por lesões precursoras e por câncer colorretal da dos testes avaliados. Para isso, nós consideramos como referência a alteração genética presente no tecido no DNA e consideramos como teste índice a presença ou ausência da mutação no cfDNA plasmático. Com isso, nós conseguimos estabelecer os valores de verdadeiros positivos, falsos negativos, falsos positivos e verdadeiros negativos, que são importantes para calcular essas medidas aqui de acurácia. Então, para identificar o valor da sensibilidade, da especificidade, o valor preditivo positivo, valor preditivo negativo e também para realizar o cálculo da acurácia diagnóstica.

Aqui nós temos uma síntese do fluxograma do desenho do estudo. Dos 189 pacientes candidatos a participarem do estudo, de fato, foram incluídos 150 pacientes, que eu irei detalhar no slide a seguir. 39 desses pacientes, eles foram excluídos: 16 já no momento da entrevista, 19 a partir do resultado da colonoscopia, por apresentarem um outro diagnóstico, e quatro a partir de intercorrências, como problemas na coleta ou no processamento do exame. Dos 150 pacientes incluídos, 76 deles não apresentaram nenhuma lesão e compuseram aqui o grupo controle. 74 deles apresentaram lesão e foram subdivididos em lesão precursora ou câncer colorretal. Desses 74, 66 apresentavam lesões precursoras e oito câncer colorretal. Como nós temos aqui pacientes que apresentaram mais de uma lesão, nós tivemos um número maior de lesões do que número de pacientes. Ao todo, foram 98 lesões, tendo 90 delas lesões precursoras e oito câncer colorretal.

Em relação ao perfil clínico de todos os participantes do estudo, majoritariamente nós tivemos aqui a presença de participantes do gênero feminino. A idade mediana foi de 62 anos. A maior parte desses pacientes apresentavam pelo menos uma comorbidade. As mais comuns foram hipertensão com 46,7%, obesidade 18% e diabetes mellitus 14,7%. Nesse quesito, identificamos uma associação entre a obesidade e a presença de lesão na colonoscopia, apresentando um teste de razão das chances de 2,89, eh maior chance de um paciente obeso apresentar lesão na colonoscopia se comparado a um paciente que não tem obesidade. Dentre eles, 6% desse grupo eram tabagistas, 24,7% ex-tabagistas, 14% etilistas e 23,3% ex-etilistas.

Avaliando agora o perfil só dos pacientes com lesão, nós tivemos também uma idade mediana de 62 anos, predominância do gênero feminino, etnia aqui mais predominante a parda, seguida de branca, com maior representatividade de indivíduos eutróficos, mas também com bastante representatividade de indivíduos com obesidade e sobrepeso. Vale enfatizar que se compararmos o percentual de indivíduos com obesidade no grupo com lesão versus o grupo sem lesão, no grupo sem lesão tivemos apenas 8%, o que explica a associação identificada anteriormente. E em relação aos fatores de risco, nós observamos uma associação entre o número total de fatores de risco que o paciente apresentava e o resultado, se ele foi ou não categorizado como tendo lesão na colonoscopia. De forma mais específica, apresentou associação para histórico pessoal e ou familiar de câncer e para história pessoal e ou familiar de pólipos.

Em relação à análise patológica das lesões, nós tivemos uma predominância de adenoma tubular com displasia de baixo grau, correspondendo aqui a 54,1% dos diagnósticos, com uma predominância maior dessas lesões no cólon transverso. Pólipo hiperplásico e adenocarcinoma foram mais predominantes no reto. Em relação a adenoma túbulo-viloso, não tivemos uma predominância aqui em um local específico. Dentre os 61 adenomas que foram identificados, 25 deles nós classificamos como não avançados, 11 como adenomas avançados e 25 não puderam ser classificados porque o material da anatomia patológica ele foi avaliado em conjunto. Então, mais de um fragmento analisado ao mesmo tempo. Isso impossibilita avaliação de diâmetro e invalida a classificação como avançado ou não avançado.

Em relação agora à análise genética do tecido, das 98 lesões, 23 delas apresentavam alterações moleculares. 19 em lesões precursoras que apresentaram 10% de alterações em KRAS e em BRAF e apresentaram 1,1% de alterações em NRAS. Em relação ao câncer colorretal, 37,5% das alterações apresentavam alteração em KRAS e 12,5% em BRAF. Um detalhe importante aqui é que um paciente ele apresentou também uma alteração em KRAS e em BRAF ao mesmo tempo, na mesma lesão. E foi vista uma associação entre o diagnóstico de adenoma túbulo-viloso e a presença de alteração molecular no tecido, de forma mais específica a presença de alterações em KRAS.

Voltamos a esse gráfico, ele vai ser interessante para entendermos os resultados dos pacientes concordantes. Então, nesse quadrante superior esquerdo, nós conseguimos observar a presença de gotículas marcadas com a fluorescência FAM em azul, que indica positividade para alteração. Isso foi visto em seis análises que fizemos. São as amostras de cfDNA dos pacientes com equivalência. Aqui mostrando em A, o branco da técnica, que é uma forma de controle que temos para avaliar. Em B, um controle negativo. Observem que não tem alterações marcadas aqui em azul, não tem aquele outro quadrante. E aqui de C até H, nós temos todos os pacientes que apresentaram concordância em relação ao cfDNA e DNA.

Em relação às matrizes de contingência 2x2, de forma global, pegando todos os pacientes incluídos no estudo, os 150 participantes, tivemos uma sensibilidade de 29,4%, especificidade de 97,7%, valor preditivo positivo de 62,5%, valor preditivo negativo de 91,5% e a acurácia foi de 90%. Em relação aos pacientes com lesões precursoras, esses valores foram um pouco menores. A sensibilidade foi de 26,7%, especificidade de 94,1%, valor preditivo positivo 57,1%, VPP 81,4% e a acurácia 78,8%. Avaliando agora o câncer colorretal, a sensibilidade, os valores foram um pouquinho maiores. Então, a sensibilidade foi de 33,3%, especificidade de 100%, valor preditivo positivo 100%, preditivo negativo 71,4% e a acurácia de 75%.

Frente a isso, nós percebemos que o câncer colorretal, ele envolve altas taxas de morbidade e mortalidade que são geralmente feitas, né? Nós temos ali um diagnóstico em um momento tardio, em um momento em que a taxa de sobrevivência de 5 anos, ela é muito pequena, ela é de apenas 15 a 30% somente. E isso decorre da ausência de sintomas, é de fato uma doença de progressão silenciosa, juntamente com as limitações que nós temos hoje, abarcando o rastreio e o diagnóstico. Frente a essas limitações, nós precisamos identificar novas abordagens para a detecção inicial, onde nestas nesse contexto inicial nós temos uma taxa de sobrevivência bem alta, próxima ali de 90%. Frente a isso, estudar as bases clínicas e também as bases moleculares do câncer colorretal são fundamentais, possibilitam melhorar a compreensão desse processo de carcinogênese do câncer colorretal e inclusive identificar biomarcadores de rastreio e diagnóstico precoce, tendo um destaque aqui para a biópsia líquida, que exibe um ser uma técnica promissora para detecção e análise desse cfDNA, principalmente por PCR digital.

Outro ponto interessante é avaliar o público-alvo para triagem. Embora hoje em dia nós tenhamos muitos dados na literatura, ainda há controvérsias em relação aos fatores mais importantes, aos programas de controle mais eficazes e principalmente em diferentes populações. Não há uma padronização desses dados. As recomendações feitas muitas vezes elas pegam apenas um fator que é o fator idade e desconsideram os outros fatores individuais adicionais. No nosso estudo, nós vimos que o histórico pessoal e familiar de câncer, bem como pólipos, são fatores importantes associados ao risco. Outros estudiosos já também apresentaram resultados nessa perspectiva. Jacobson e colaboradores destacaram que a história de câncer, de pólipo e doenças inflamatórias intestinais aumentam o risco ao câncer colorretal. Isso em uma população nos Estados Unidos. No Brasil, o Ministério da Saúde, ele sugere um risco médio para pacientes que não têm o histórico pessoal ou familiar de câncer colorretal e sugere um alto risco para pacientes que têm uma história familiar ou pessoal de câncer colorretal.

Em relação aos dados clínicos, não observamos a associação envolvendo idade, gênero, etnia, tabagismo ou etilismo. Aqui nesse estudo, o que nós vimos foi uma associação envolvendo a obesidade com a presença de lesões precursoras. Indivíduos com obesidade, nós vimos que têm 2,9 vezes mais chances de apresentar uma lesão na colonoscopia em comparação com os não obesos. Outros estudos também relatam essa mesma associação e isso se deve principalmente à participação da insulina e de citocinas pró-inflamatórias como interleucina 6 na manutenção do ambiente pró-inflamatório que contribui para a progressão das células cancerosas e manutenção ali para o câncer colorretal se estabelecer.

Em relação às lesões, mais da metade das lesões identificadas eram adenomas tubulares e 8% adenomas túbulo-vilosos. Não identificamos lesões somente com padrão viloso. Isso também está de acordo com a literatura. Em estudo de Juarez, ele identificou 89,7% como adenomas tubulares e 9,5% adenomas túbulo-vilosos, e apenas 0,8% (menos de 1%) com a arquitetura viloso. Isso se deve à classificação desses adenomas em relação ao perfil histológico. Para a lesão ela ser considerada viloso, ela precisa apresentar mais de 75% de componente viloso na sua estrutura.

Dentre as 90 lesões precursoras avaliadas, 21,1% delas apresentaram pelo menos uma mutação genética. 10% em KRAS e BRAF, 1,1% em NRAS. Isso está em consonância com estudo, por exemplo, de Junca e colaboradores, que também identificou um valor bem próximo ali de em torno de 13,8% para alterações em KRAS e de 20,7% para BRAF. Lembrando que esses autores eles não avaliaram o gene NRAS e eles também avaliaram por PCR digital. E em relação à associação que identificamos entre adenoma túbulo-viloso com a presença de alteração em KRAS, essa associação também já é vista na literatura. É mostrado que a presença de vilosidades está associada à questão da alteração em KRAS. Isso pode explicar um pouco do porquê esse tipo de lesão, o adenoma túbulo-viloso, ele já tem um pior prognóstico se comparado aos vilosos.

Por exemplo, identificamos um total de 5,3% de pacientes com câncer colorretal estabelecido. Essa esse percentual também está de acordo com o visto na literatura. Em estudo de Lima e colaboradores, 3,4% dos participantes apresentaram também o câncer colorretal. Dentre os oito adenocarcinomas identificados, 37,5% apresentaram alteração em KRAS e 12,5% em BRAF. Esses percentuais também estão em acordo com a literatura que cita em torno de 40% para KRAS e 10% para BRAF. Identificamos um paciente que chamou atenção com 29 anos de idade, já apresentando o câncer colorretal. Também segue um perfil que tem sido muito observado ultimamente na literatura, mostrando que cada vez mais o câncer colorretal ele é diagnosticado em faixas etárias mais jovens. E essa nossa participante em específico, ela apresentou múltiplos fatores de risco para o câncer colorretal.

Em relação à avaliação do cfDNA, o primeiro ponto é que os estudos hoje em dia, grande parte deles avaliam pacientes com câncer versus pacientes saudáveis. São poucos proporcionalmente os estudos que incluem as lesões precursoras também. De forma abrangente, assim como no nosso estudo, o estudo de Junca, ele trouxe lesões pré-cancerosas com uma sensibilidade global de 16,9% e uma especificidade de 100%. E a sensibilidade que eles obtiveram para lesões precursoras, no caso adenomas avançados, foi de 2,6%, não identificando em adenomas não avançados. Uma limitação que nós observamos neste estudo, de Junca, muito parecido com o nosso, é que eles não descreveram no estudo deles o tubo de coleta utilizado, nem o volume de plasma utilizado para isolar o cfDNA, o que é muito significativo em termos de uma análise de um marcador em que nós temos uma concentração muito baixa inicial. Em nosso estudo, de forma diferente, nós utilizamos o tubo PAXgene, que é específico para conservação desse cfDNA. E nós isolamos o cfDNA de um maior volume de 4 ml de plasma sempre que disponível, de forma a obter uma melhor concentração possível de cfDNA. Com as nossas mudanças aqui de técnicas metodológicas, nós conseguimos obter uma sensibilidade global de 29,4%, uma especificidade de 97%, sendo uma sensibilidade um pouquinho mais elevada para o câncer colorretal, 33,3%, em comparação com as lesões precursoras, que foi 26,7%. Eh, esse perfil que nós observamos envolve um desafio em relação à sensibilidade e uma alta especificidade. Isso é muito observado na literatura. Já se tem muitos estudos que trazem esse padrão de uma sensibilidade limitada com uma alta especificidade. Isso se deve muito porque quando nós trabalhamos com lesões precursoras e trabalhamos com eh câncer colorretal em estágio inicial, nós podemos ter uma baixa concentração inferior a 0,1% nesses contextos biológicos. Frente a isso, acreditamos que novas abordagens para melhorar os valores de sensibilidade incluem a combinação de diferentes técnicas moleculares, combinar a análise de metilação, de marcadores epigenéticos, fragmentômica, avaliação de sinais clínicos, uma abordagem mais multianalítica, eh, é o que mais tem mostrado capacidade para elevar esse valor de sensibilidade. Ainda assim, são necessárias validações em amostras, em coortes maiores, com maior número amostral.

Frente a isso, dentre as limitações do nosso estudo, nós destacamos o número amostral, destacamos que o estudo foi conduzido em centro único, então ele foi realizado somente com pacientes de um único hospital e foi feita a análise isolada dessas mutações somáticas no cfDNA. Apesar disso, destacamos como pontos positivos do nosso estudo a inclusão de lesões de diferentes estágios da carcinogênese. Então, a inclusão das lesões precursoras, isso com certeza fortaleceu bastante o nosso estudo. A associação entre fatores de risco e lesões, como nós observamos para histórico pessoal e ou familiar de câncer, a associação envolvendo a obesidade e a lesão na colonoscopia. A frequência das mutações dos genes KRAS, NRAS, BRAF, frequências de mutações que são muito relatadas na literatura para o câncer colorretal e que aqui nós também trouxemos em relação às lesões precursoras. Associação entre adenomas túbulo-vilosos e alteração genética em KRAS e a detecção das variantes alélicas do cfDNA de pacientes com lesões precursoras, alcançando a sensibilidade de 26,7% e uma alta especificidade de 94,1%, o que é muito significativo como um teste que reduz falsos positivos. E alcançamos uma sensibilidade para câncer colorretal e uma especificidade de 100%.

Essas são as referências que eu utilizei para elaborar esta apresentação. Aqui eu trouxe três chamadas. Então esse projeto ele foi aprovado em três chamadas de fomento. A princípio, na chamada do CNPq em 2022, uma verba que nós utilizamos para adquirir os insumos e realizar o estudo atual. Eh, e o projeto ele foi também aprovado do ano passado na chamada da FAPEMIG. Eh, então em 2023 tivemos duas aprovações, esta da FAPEMIG e também pela rede FNDCT. Aqui eu trouxe um estudo que nós publicamos em 2024 e trouxe também aqui o estudo que nós submetemos atualmente, recentemente, a revista que é fruto desse trabalho.

Trouxe alguns registros. Ao longo dessa caminhada, eu tive a oportunidade de participar de projetos de extensão, então várias atividades de extensão, eh, escolas, domingo no campus, a feira da saúde. Tive também a oportunidade de participar de eventos científicos, onde a gente levou um pouco do nosso trabalho. Tive a oportunidade de coorientar também alguns trabalhos, participei de monitorias, fui convidada também a dar uma palestra envolvendo a oncologia e também fui principalmente aprender muito sobre a biópsia líquida. Aqui é um evento que nós fomos pro eh pro hospital de Barretos para entender mais sobre a técnica e o cálculo dos limites de branco e detecção. E trago os meus agradecimentos especiais, primeiramente a Deus, a minha família, a professora Luciana que me acompanha desde a iniciação científica, professor Luís Armando, a banca aqui hoje presente, aos membros do laboratório de medicina molecular, a a professora Carolina e a aluna dela Isadora, que também acompanharam o projeto desde o início, ao Dr. Renan, Dra. Juliana, toda a equipe do laboratório Personal Diagnóstico de Precisão da Fiocruz, equipe de coloproctologia e anatomia patológica do hospital, aos alunos de iniciação científica, todos os participantes e as redes de fomento também. O meu muito obrigada.

Obrigada, Bianca, pela apresentação. Eh, vamos dar início então à discussão, né? Eu vou começar por você, Vivia. Pode ser?

Sim, pode ser. Eh, bom, primeiramente, não, eh, deixa eu só falar rapidinho, né, que os outros possam te conhecer. Eh, a professora Vivia, ela é professora associada da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, né? E atualmente ela trabalha no SickKids de Toronto, né? Vivia, possa contribuir aí com o trabalho da Bianca, porque ela tem uma vasta experiência em oncologia e principalmente oncologia de câncer colorretal. Então, Vivia, muito obrigada, tá?

Bom, obrigada pelo convite, por lembrar da minha existência. Quando a gente vai para fora do país, às vezes a gente pensa, será que as pessoas vão lembrar da gente, né? Eh, eu tô eh em Toronto, Canadá. Eh, então tô com afastamento por motivos pessoais, mas eu vim primeiro para cá eh para fazer o meu sabático. E depois desse sabático, eu tive a oportunidade de continuar fazendo pesquisa, eh, aqui e então eu continuo por aqui, mas no momento eu não tenho vínculo, então acho que no no documento ficou a instituição que eu estou vinculada realmente que é o CIDS, para só para esclarecer para os colegas. Bom, eh, e Bianca, eh, Bianca e, e professora Luciana, primeiramente, parabéns pelo trabalho, um trabalho muito bonito. Eh, você observa que realmente, eh, deve ter tido muito trabalho para obter essas amostras, para poder fazer eh o acompanhamento, para poder todos os dados desses pacientes, eh buscar os resultados da biópsia, eh tabelar tudo isso, eh, pegar os dados clínicos do paciente. Sei o quanto é complicado e vi que você coletou a amostra de 2022, né? Eh, a gente já não estava mais na pandemia, mas ainda as coisas estavam retornando, né? Então, estava já começando a normalizar a situação. Mas eu sei que não não deve ter sido fácil, porque trabalhar com paciente tem muitos desafios, né? Então, assim, você vê que é um trabalho que foi feito bem feito, assim, que realmente se buscou eh ter um cuidado com essas amostras. Vocês coletaram a amostra com Paxgene. Paxgene é caro. Eh, então assim, eu imagino que o projeto é bem caro de ter sido de ter sido realizado. E então assim, primeiramente, realmente parabéns. Eu vi que vocês colocaram o estadiamento, eh, todo isso é muito bem descrito. Você vê que é uma uma coorte bem feita, né? Então isso primeiro eu quero assim, primeiramente quero parabenizar por isso, porque a gente pega às vezes umas teses que parece que a pessoa foi lá no hospital, pegou e nem e nem teve o cuidado de documentar bem, né? E você tem uma amostra bem caracterizada, já é meio caminho andado, né? Porque eh não adianta nada você ter uma coorte de pacientes com câncer se ela não está bem caracterizada. Que você vê que foi muito bem caracterizado. Então, parabéns eh por isso. Mas ao mesmo tempo a gente tem explorar essas informações é difícil, é porque é muito dado, né? Quando você pensa estagiar, fazer o estagiamento do do tumor colorretal, são muitos detalhes que a gente tem. Depois a gente tenta classificar, né, 2, 3, né? Mas ao mesmo tempo assim, tem tantos detalhes que se a gente fosse pensar de associar o tamanho do tumor ou se eh se teve eh quantos linfonodos que são que foram que estavam presentes eh né se metastáticos, não metastáticos, a classificação 2 e 3, ela acaba juntando tudo isso, mas no fundo, se a gente for se olhar individualmente esses detalhes, eh, a gente pode até explorar mais dados ainda que você tem. Eh, eu me atentei muito, eu li o seu trabalho, mas eu atentei bastante foi o artigo, porque imagina que o artigo é a parte que você vai, é o seu produto final, né? Quando a tese, óbvio, ela é muito importante, ela vai ser um documento que as pessoas vão vão acessar. Eh, na tese, eu acho que a única coisa que eu falaria assim, ah, se eu tivesse que te dar uma sugestão de acrescentar alguma coisa na sua tese, talvez eu colocaria eh uma explicação mais assim forte do que que é sensibilidade, do que que é especificidade, o que que é valor preditivo negativo. Eh, porque no final foi assim, é o resultado seu que é muito importante isso. Nem sempre as pessoas entendem o que que é um falso positivo, um falso negativo, sabe? O que que é sensibilidade e especificidade? Isso é uma coisa que geralmente as pessoas têm dificuldade de entender. E aí eu entro na primeira pergunta que eu queria fazer para você com relação a essa primeira essa essa definição. Quando você pega o seu trabalho, né, e você fala assim que a sensibilidade dele foi baixa, né, da biópsia líquida, né, a sensibilidade foi baixa, mas aí tem um valor preditivo negativo alto. Parece oposto, mas eu sei que não é oposto. Mas como você conseguiria, que eu é uma doutora agora, né? Como você conseguiria explicar para um médico que não sabe nada sobre sensibilidade e especificidade ou mesmo para um estudante de, sei lá, do curso de farmácia, eh, que que ou de biomedicina que, né, ou biólogos que estão numa área de análises clínicas, como você explicaria de uma linguagem fácil o que significa isso?

Tá? Sensibilidade, eu diria que é a capacidade de você detectar ali os participantes. Então, por exemplo, vamos pensar que eu tenho 100 amostrinhas que foram positivas, que são positivas no tecido. E aí a sensibilidade ela me diz dentro desse conjunto quantos eu consigo detectar de fato como positivo. Então ela pega eh assim, até pensando ali no denominador, né, que a gente tem os pacientes com a presença da mutação, quantos eu consegui identificar a partir do teste índice? Então, basicamente, eu diria de forma bem resumida assim, que é a capacidade de detecção do teste. Eu conseguir detectar aquela alteração usando o meu teste índice, o meu um outra ferramenta que eu queira testar, que nesse caso é a PCR digital, frente ao total de de positivos que existem.

De verdade. Então, ela mede os verdadeiros positivos frente a todos que têm alteração. E o valor preditivo negativo, esses valores, eh, quando a gente pensa em valor preditivo, a gente usa um outro denominador diferente. Então, por exemplo, quando eu falo de de valor preditivo positivo, eu vou pegar na linha ali daquela tabela, então, dentre os pacientes que tem o teste como positivo, meu teste índice, quantos verdadeiramente têm aquela alteração? Então, o que muda ali, na verdade, é o denominador, né? Dentro do que eh eu considero como como positivo, eu vou observar isso em relação ao total de mutações no tecido. Ou eu vou observar isso em relação ao total de alterações identificados no meu teste índice.

Uhum. É um cálculo diferente.

Isso.

Mas assim, se o médico ele fosse solicitar esse exame e o resultado desse negativo pelo pelo resultado do valor preditivo negativo, que é 90%, ele ia falar assim: "Tem 90% de chance desse paciente ser realmente negativo." Ele interpretaria isso. Hã, eh, o que acontece, é importante a gente conceituar falso positivo e falso negativo também quando a gente pensa nisso. Então, quando a gente pensa em sensibilidade, eu posso ter falsos negativos. Por exemplo, na minha sensibilidade foi 27%. Então, eu tenho um valor baixinho, eu tenho uma maior tendência a ter resultados que são positivos no tecido, mas eu não consegui identificar no cfDNA. Então, são os falsos eh falsos negativos, porque eles são positivos, mas apresentaram como negativos. Eh, diferente de quando a gente pensa na questão do falso negativo, né? Então, por exemplo, a biópsia líquida, o que a gente viu é que ela é melhor para identificar os falsos. Eh, ela é melhor para comprovar que de fato quem deu positivo realmente tem a mutação.

Positivo. Uhum. Porque se eu tenho um resultado ali, né, de um paciente que deu positivo, eu tenho poucos falsos positivos no meu teste, que no, por exemplo, no meu trabalho foram três pacientes falsos positivos.

Então, se deu positivo, a chance daquele paciente de fato ter alteração é alta. Agora, se der negativo, a chance do paciente ter alteração, aí já é a nossa grande limitação e desafio.

Porque eu não consigo garantir que realmente não há por conta dessa baixa sensibilidade, dessa baixa capacidade de detecção.

Perfeito. Bem, então você mostra que você sabe. Eu acho que só essa parte na tese e mesmo também no artigo que eu acho que tinha que ser um pouco mais trabalhado porque é uma é uma questão de certa forma matemática porque né é um cálculo, né, sensibilidade, especificidade, mas é bem difícil. E e como você tem esses dois dados, um que é baixo valor preditivo negativo e especificidade alta, é difícil, né? É difícil discutir isso, não é fácil. Então, e pensar em uma linguagem que seja fácil para para ser aplicada é difícil mesmo, mas você sabe o assunto, né? Só tem que só acho que só teria como realmente pôr esse pulo do gato de explicação melhor. Talvez um item, né? Quando você coloca da na estatística, talvez um item explicando sensibilidade, tal, o que que é cada eh cada coisa.

Eh, isso da isso do seu do seu documento de tese, tá? Eh, que eu queria comentar com você. Eh, aí no seu slide 35 que você apresentou da sua apresentação.

Aqui, eh, eu achei que ele tá muito legal, muito melhor porque tá todo juntinho. Você colocou todos eles juntos, a essa questão de cidade, picidade, eh, você colocou tudo junto e na tese você foi colocando ele ele separado, sabe? Eh, eu acho que ele todo junto talvez também teria colocar no seu artigo. Eu achei que ficou ficou bem mais fácil de concluir, né? Qual foi as conclusões suas em relação a isso?

Na >> você fala do resultado, Vívia? >> É o o no slide dela, o número, acho que era slide 35 a 35 que o número do slide >> é onde que eu deixo as três tabelas de contingência. >> Exatamente. >> Uhum. >> É que são as três tabelas dos resultados. e valor preditivo negativo que ela coloca todos eles juntos. >> Uhum. Isso seria interessante pro artigo. >> É, eu achei que você na sua apresentação ficou muito legal que você colocou todos juntos. >> Uhum. Achei que fo acho que valeu, valeu a pena.

E na sua tese, a maior coisa só que eu tive dificuldade é que nas suas tabelas você não colocou o p valor nas tabelas. E normalmente a ideia da das tabela e figura é que você olha a tabela e olha a figura, você já consegue enxergar estatística e, né, enxergar o que você deu significativo. Então, por exemplo, a tabela que eu marquei, uma tabela 15, por exemplo, que você coloca toda a estatística dele lá no na sua tese, tá? Você coloca toda, você fala da estatística dele no texto, mas você não não coloca na tabela, entendeu? >> Uhum. >> Cadê? Deixa eu achar aqui a tabela de novo. Só para ter cermo é a 15. Quando você fala assim, perfil clínico dos pacientes com lesão, aí colocar na na depois da do total, aí você coloca o p valor ou prevalor ou frequência, o que for que o que você comentar da estatística que você coloca no texto, coloca também na tabela que aí fica fácil de de acompanhar, sabe? Só foi eh esse detalhe >> aí.

Eh, no artigo, eu vou te mandar depois os meus comentários do artigo para você, tá bom? Que foi onde eu mais fiz, tipo, parei para escrever comentários. Eh, o que que eu gostaria de de comentar com você? Eh, deixa eu pegar aqui, entrar. Tô no meu computador, gente. Tô falando que você no celular e tô no computador. Então, só um momentinho.

Eh, de método, eu achei assim que foi super legal, que eu vi que você fez 185 pacientes, só que no artigo você foi só pro 150. Foi 150, era 150, né? >> É, >> eu acho que é legal você colocar no seu artigo que você teve 6 180 85, porque é super normal e é super esperado realmente que você tenha perdas. você tem justificar, porque mostra o quanto você foi cuidadosa. Você ter excluído seus pacientes também é relevante, sabe? Também é é é importante. Mostra que você teve um cuidado. Então, geralmente você pode colocar refluxo que você fez eh na tese, colocar num artigo, falamos que tinha 185, excluiu lá eh 35 os motivos que excluiu e aí depois você ficou com 176, foram, né, os controles e tudo mais. Eu acho que esse fluxo, uma figura desse fluxo extremamente válida, tá? E não tenha medo de falar: "Ai, mostra meu e na verdade só 150". Não, você tinha 180 80 e pouco. Então, acho que isso era método. Acho que é importante você colocar.

Eh, eu acho assim que que na metodologia vai depender, lógico, da revista, né, que você que você vai publicar. Então, eu vi que você já submeteu, né? Eu até aqui te falar do artigo, você vai publicar também. Você submeteu. Teve algum já feedback aqui da revista? Ainda não, ainda não tive. >> Então pode, pode mesmo comentar então sobre o artigo, né? >> Claro, claro. >> Eh, tá. Então, ótimo.

Eh, eu sei que depende muito da revista, eh, mas talvez algumas coisas da detalhe do detalhe da metodologia você pode deixar como suplementar. Quando você fala, por exemplo, que você vai na metodologia lá, você comenta, eh, onde que foi o item que coloquei? que quando você vai falar sobre a frequência das mutações, eh, não, isso até tá até resumido, mas eu sei, eu falei que eu acho que eu queria que você é o contrário, que você detalhasse melhor a metodologia não suplementar, né? Isso. Mas você teve um momento que você colocou aqui, por exemplo, você colocou na biópsia líquida, você colocou que a centrifugação, tempo de centrifugação, eh você colocou o volume, o volume de plasma. Então, por um lado, a metodologia ela tá bem enxuta. Pro outro lado tem outras coisas que ela não tá tão enxuta assim. Então acho que tem que ter um um equilíbrio melhor. Ou você vai detalhar tudo e aí você coloca depende isso no suplementar ou você deixa eh deixar resumido tudo. Principalmente quando você você destaca bastante na na biópica líquida, mas você não fala tanto da eh da PC convencional. >> Uhum. >> Entendeu? Então se você >> talvez trazer um pouco das limitações ou das diferenças dos outros métodos versus biópsia líquida e PCR digital. >> Eu não falo nem falando das diferenças, eu tô falando da metodologia. Quando você escreve a metodologia mesmo, você fala assim, ah, que você pegou o material e a saí se você fugou e você usou o max e mag free e o kit que você utilizou, você colocou essas informações do kit e tudo mais, só que quando você vai falar do >> eh >> da PCR em tempo real, >> da PCR em tempo real, se não me engano, você não falou >> detalhar um pouco mais a PCR em tempo real na parte de mos >> é ou você ou você detalha as duas duas iguais, entendeu? Tem tem que padronizar. Se você vai detalhar é a biopsía, detalha também para ser tempo real. >> Uhum. OK. >> Só deixar deixar igual mesmo, >> certo? >> Tá.

Eh, então isso foi da metodologia da introdução. Fiz só pequenos comentários. um comentário que eu vou fazer, que eu sei que vai ser duro, mas eu acho isso mesmo assim, depois depois de algumas vivências que eu não vejo necessidade nenhuma você destacar na primeira frase da sua introdução o Brasil, porque o seu trabalho não é um trabalho assim, você não tá fazendo trabalho de frequência da mutação na população brasileira, não é um trabalho epidemiológico. Então assim, você não precisa destacar Brasil logo de cara. Eu acho que só pela frase que é que é uma causa de mortalidade, alta mortalidade, morbidade no mundo, já é o suficiente. Então eu não acho que você precisa destacar Brasil logo de cara. Infelizmente quando a gente sai para fora, a gente fala assim: "Não, mas ninguém não tá nem aí pro Brasil, não tem valor a população brasileira", que também depende muito de pesquisadores, mas assim, não, para não correr esse risco, ah, é um trabalho lá do Brasil, não, nem coloca, sabe? Se quiser saber qual de população, vai ver lá na metodologia de onde é a população. Mas não precisa ser lá a introdução na primeira frase da introdução, sabe? Eh, OK.

Eu acho que quando você eh quando você vira e fala também no seu final do seu objetivo, quando você tá compa que você vai comparar as metodologias, eu acho que é legal você falar que você comparar trazendo a questão da sensibilidade, especificidade, valor produtivo, negativo, assim nesse detalhamento, não só uma comparação. Eh, ah, vou comparar, mas vou comparar com quê, né? Vou comparar, é, vou a capacidade de detecção. Então, já que a capacidade de detecção eh é você entrar dentro aqui na falar isso, idade, especificidade, você colocar na sua introdução, >> explicar como eu vou comparar, né? >> Exatamente isso aí, Bianca. Como você vai fazer, como você vai fazer isso? É essa a ideia.

Eh, as suas tabelas de dado clínico traz pro seu artigo, super traz pro seu artigo, sabe? aquela as tabela dos dados clínicos, nem que seja um dado suplementário, você tem que trazer ela, você tem que mostrar que você fez o seu trabalho muito bem feito. Enriquece, enriquecer, eu colocaria inclusive o resultado da biópsia que você teve, que você colocou na sua tese, coloca no seu artigo, entendeu? Não tem porque você não colocar. Então você mostra sua cor está muito bem caracterizada, principalmente que eu v que você tentou você tá aplicando pro jornal, que é um jornal um jornal específico de de cân de coloretal, não é? >> Uhum. Então os médicos que vão, né, os cientistas que vão ler isso, eles vão querer o dado clínico fal assim: "Olha, ela tem aqui alguma corrute muito bem caracterizada, sabe? Então coloca aquela tabela dado clínico aqui no seu artigo, >> tá? >> Eh, é até uma pergunta porque eu vi perguntar para você porque não colocou na verdade falei: "Nossa, tinha que colocar tão bonita". OK.

Aí eu acho que, por exemplo, a sua figura eh, qual o nome da a figura um, eh, ficou muito pequenininha. Se tem muitos gráficos, né, do A até o H. Então, ficou tão pequenininho que eu não conseguia nem eu não consigo nem ler o que tá escrito. Eu vi que tinha os pontinhos pretos, os pontinhos verdes, mas eu não consegui entender ela. Ô, Vivia, você acha que realmente é necessário essa figura? >> Eu vou querer concentrar. Na verdade, eu não consigo nem interpretar ela, porque como eu não consegui ler ela, que ela ficou muito pequenininha, eu não consigo entender se ela era relevante ou não, mas eu também não sou assim, eu não tenho expertise em em PCR, eh, né, PCR digital, né, PCR digital de, né, o que ela o que ela tá fazendo, biopsia líquida. Eu não tenho essa expertia, tem expertise em PC em tempo real, mas não esse resultado. >> Figura um ou a figura seis, >> como no >> a figura um mesmo do artigo. Figura um do artigo? >> Ah, figura um. Você ficou muito pequenininha porque ela colocou de A até H. >> Sim. >> É porque assim, eu acho que é uma figura desnecessária, talvez suplementar, >> talvez como suplementar porque mostra que tem o resultado, né? Que ela fez o resultado >> aí.

Eh, calma aí. Eh, aqui um cuidado que eu queria falar com você que na discussão, tanto na tese quanto aqui no artigo, você repete os resultados, os resultados. Se você volta de novo colocar os mesmos pores, os mesmos dados, eh, isso não, isso não pega bem. É melhor você tirar da discussão. Você já discut, você já colocou e principalmente se não for assim, não é seu foco tanto, né? Então, quando você coloca aqui que você eh até mesmo histórico familiar, pólvoo, presença de eh obesidade, isso não é o seu foco principal, isso é uma caracterização da sua corrorte, que é importante, tá dentro objetivos específicos, né? Mas pro artigo isso é só para você caracterizar sua corrorte. Então eu não discutiria isso no seu artigo, sabe? Se você quer fazer um comentário, faz um comentário lá nos resultados. como esperado e até coloco uma referência ali, tipo assim, como esperado, é que foi todo foi como esperado mesmo nessa parte, mas foca direto no foco no na sua comparação, né, no biópsia da biópsa líquida.

Eh, >> aí uma coisa que eu queria perguntar para você agora pergunta mesmo, tá bom? No final da sua da sua discussão, você colocou assim, eh, que que como se fosse dentro da limitações, apesar que tá um parágrafo antes da limitação que você coloca, mas limitações, neverlness, eh, é que do aspecto metodológico que para fazer biópsia líquida você precisa você precisa do packin e você precisa de um lar plasma volume que você precisa de um volume largo grande de plasma, só que você cortou 10 ml. Eu queria entender assim, você acha que vocês não cortaram volume suficiente ou você acha que 10 ml não é é é muito? Então, eh, comparado com outros estudos, eh, foi, a gente tentou deixar isso mostrando como um ponto, de certa forma positivo em relação ao volume que a gente utilizou, que foi um volume um pouco maior, porque tem estudos com microlitros, com eh 1 ml e nós conseguimos utilizar em torno de 4 ml de plasma, né, ali dos 10 ml de sangue coletados. Depois da separação, a gente usou em torno de 4 ml para isolar o CF DNA. >> Então, seria para destacar que nós, >> com esse ajuste na metodologia que fizemos, eh, supostamente nós conseguimos obter uma concentração um pouco maior, porque conseguimos isolar o CFD DNA de um volume um pouquinho maior também de plasma, >> tá?

Aí, então eu queria fazer fazer outras, tenho duas perguntas para te fazer, aí eu termino. Não sei nem quanto é o meu tempo aqui. Eh, primeira pergunta, você acha que, por exemplo, se a gente coletasse assim uma bolsa de sangue desses pacientes, a gente teria mais chance de encontrar um resultado positivo sem, tipo, detectar, aumentar a sensibilidade do teste? Bom, com maior volume de sangue, você tem mais TFDNA que você consegue utilizar em técnicas variadas, porque eu acho que para aumentar a sensibilidade, o ponto chave é combinar mais de uma técnica molecular. Então assim, eu vou coletar mais sangue, mas eu vou só avaliar alterações hotspot ddpcr, não vai aumentar sensibilidade. Talvez se você conseguir incluir mais genes, como a gente viu na literatura, talvez você eleve um pouquinho a sensibilidade, mas para conseguir elevar uma sensibilidade para um pantamar de futuramente aplicar como teste de rastreio diagnóstico, acredito que a chave ela está em combinar análises diferentes. Então, mas a sensibilidade do da biópsa líquida, mesmo se aumentasse o volume, não iria mudar. melhora, melhora, mas não a ponto de conseguir, por exemplo, uma sensibilidade superior a 80% e aplicar na prática, por exemplo. >> Tá legal?

Aí a minha vem minha segunda pergunta. Então isso na verdade tem a ver com a característica do tumor, porque se o tumor não tem a as mutações, mesmo que você tenha uma técnica super robusta, não vai detectar porque você tá focando só naqueles naquelas mutações. >> É, eu diria que é uma via de mão dupla, >> entende? ao mesmo tempo que envolve a liberação, porque a gente tem vários fatores que abarcam essa liberação. Então, desde a localização do tumor, o percentual de frequência de mutações ali existente o a própria heterogeneidade do tecido, né? se a gente tem mais células alteradas ou não, porque isso é tudo muito heterogêneo. Eh, isso influencia eh então o perfil em si do tumor, ele vai influenciar na liberação do CFDNA, a dinâmica corporal dessa pessoa vai influenciar, porque a gente tem o o esse CFDNA, ao mesmo tempo ele vai sendo processado e metabolizado o corpo também. E ao mesmo tempo a quantidade que você consegue obter de sangue desse paciente, você consegue melhorar um pouquinho essa sensibilidade, que eu acho que foi o que a gente viu, né, comparado com um outra artigo do Jun, que ele obteve um percentual bem baixinho para lesão precursora, a gente teve uma sensibilidade um pouco melhor. Teve um outro estudo que avaliou mais genes e conseguiu melhorar um pouquinho essa sensibilidade também. Então eu acho que são vários fatores, eh, tudo muito dinâmico influenciando nessa sensibilidade. >> Entendi. >> Principalmente quando você combina, né, eh, avaliações diferentes, tipo assim, epigenético, genético, né, então, metilação, >> examente metilação fragmentômica, mutação hotspot, quanto mais variável for, eu acho que melhor a gente consegue elevar essa sensibilidade.

E a última assim ainda dentro dessa dessa questão tipo que a característica do tumor também influencia, né? Eh, o a o resultado pensando só na biópsia líquida. Eu entendi que se colocar outros outros exames vai, lógico, vai melhorar. Mas só pensando na biópsa líquida, que é o foco do artigo, eu fiquei pensando assim que se o título ele estaria adequado e se e se o tá representando o realmente o que vocês fizeram, porque na verdade a o grande lance do trabalho de vocês foi que vocês pegaram eh não eram pacientes com seja com metástase, né? Assim, não eram pacientes com condições já muito avançadas, eram condições precursoras, era condições iniciais. Muitos pacientes nem tiveram, né, eh, só oito que tiveram diagnóstico de câncer mesmo. Então, você estão, na verdade, tentando fazer um diagnóstico precoce, né? Eh, a ideia de vocês é tentar tentar diagnóstico >> seria até ideia de tentar substituir a a a colonoscopiaoscopia, >> não é? >> É um exame complementar ali. Isso, >> um exame complementar. Mas se a gente pensasse, poxa, né, endoscopia não é um exame, fazer coloscopia não é um exame agradável, né, assim, não é um exame agradável, os pacientes não gostam de fazer coloscopia. Aqueles pacientes que tiver que 76 não foi que deram normal, eles não sa nem ter passado por esse procedimento. >> Eh, a ideia, >> a colonoscopia, ela tem um ponto muito importante que é a remoção das lesões. Então eu diria que talvez aqueles pacientes que não deram nada, né, na na colonoscopia, eh, a ideia assim do teste seria como se fosse um rastreio mesmo de uma filtragem assim dentre os pacientes. Se a gente tivesse uma sensibilidade muito boa, eh, a gente conseguiria identificar os pacientes que não precisariam passar pela colonoscopia e os que precisam passar pela colonoscopia. >> Aham. Então, será que de repente o título ele não seria interessante você colocar no título que você tem pacientes de forma precoce? >> Você fala >> porque você colocou assim, clinical validation é é o nome do seu trabalho, do seu título, né? Clínica validation. >> Mas eu acho que era muito legal eh você colocou a prospectiva create study, né? como se fosse alguma ainda prospectivo, mas você não você não fez um estudo prospectivo, né? >> Então, o prospectivo foi mais no sentido de a gente não sabia o diagnóstico de ninguém inicialmente >> e aí depois do resultado daoscopia é que a gente >> conseguiu. >> Sim. É, não é um estudo prospectiva clássico que você imagina que é o acompanhamento desse resultado. Você, na verdade, você colocou ele antes e você sabe o desfecho, >> né? Você tem você tem o desfecho do diagnóstico. É, pode ser. Mas eu não sei, eu fiquei pensando que acho que o valor mais interessante do seu trabalho é mostrar que você fez esses pacientes de forma precoce, sabe? São pacientes que vão para coloscopia, que não seamente a maioria não teve câncer, né? Então a assim a tentativa, né, de usar biófisa líquida para avaliar esse antipo de corrute, porque eu acho que biópia líquida tá sendo muito muito abordado para acompanhamento de metástase, não é? Também >> também as pessoas biopsíquica, ela tá muito sensibilidade depois que o paciente já tem o diagnóstico, é uma sensibilidade maior, eh o grande desafio nosso é o rastreio e diagnóstico, né? Melhorar a sensibilidade ali. Acaba que os estudos atuais eles abordam mais a biópsia líquida para recidiva, para tratamento depois do do diagnóstico estabelecido, né? >> E o nosso estudo ele vem >> trazendo uma outra abordagem. nesse sentido. >> É porque até mesmo assim, se a gente pensar, faria mais sentido a gente pensar em biósfalíta também, porque você pensa assim, o paciente que tá com metástase, é que realmente esse tumor já tá grande, ele já tá entrando na no nifonodos e já tá indo pra circulação, porque você vai pensar, você tem o o tumor, ele tá no intestino, certo? No colcetal para ele sair pra circulação. É porque ele saiu pra circulação é porque realmente o tumor dele já tá >> invadindo, né? já tá, já tá realmente atingindo a circulação. >> É, no caso do paciente metastático, a chance de ter de detectar o CFDNA é muito maior, porque quando a gente pensa em uma lesão que tá secretando aquele CFDNA em uma baixa quantidade, é por isso o grande desafio da sensibilidade que nós temos. >> É porque seente, se o tumor aí tá, ele é muito pequeno, por que estaria sendo liberado na circulação? Essa é a minha pergunta, né? >> É. pela renovação natural das células, né? Essas células quando elas morrem ali por necrose, apoptose, elas acabam liberando parte do seu DNA. Então, >> mas aí ela não sairia nas feesas. >> Por que ela entraria na circulação? A pergunta >> porque há uma auto irrigação ali a nível intestinal. >> Ah, boa resposta. Ok, entendi. Perfeito, entendi. OK. Então acho que é legal colocar isso também em algum lugar, seja a tese, falar isso que existe uma rutovação celular e o local é muito vascularizado. Então você acredita que as células já estariam independentes da independente se tem metástas ou não, ela já estaria na circulação. >> Isso >> é isso, né? Ah, Bianca, é super legal isso. Acho que isso isso também é uma coisa muito importante. >> Agora, talvez mudar o título um pouquinho para eh enfatizar mais as lesões precursoras, né? É, é bom.

Eh, agora, agora me deix por satisfeita. Você respondeu todas as minhas perguntas e achei excelente. Eh, demonstra que você tem um super domínio o projeto que você realmente executou. Então, quero realmente parabenizar e ai eu espero que eu consiga. A gente tem um, a gente tem uma corroste, não sei sea, se a se a professora Luciana comentou com você que a gente tem uma corrost de pacientes com canto escola e tal lá no Rio Grande do Norte. Eal. Então eu acho assim, tudo bem, a gente não coletou amostra no no packin. O pack jein é muito caro, mas a gente coletou soro com asma e guardamos imediatamente, menos de em menos de uma hora a gente já centrifugava e guardava no -80. Então eu acredito que como é DNA, teoricamente é para tá estável, né? É para tá lá. Eh, então eu nem sei assim, tipo, se realmente é obrigatório ter ter a mosca no paquisin para você fazer biopsalíta, mas a gente tem soro, plasma >> congelado 80 e temos também resultado de de biópsia, né, desses pacientes, acompanhamento e tal. Então assim, né, se vocês tiverem como, né, mandar eh assim pagar para receber essas amostras, eh essas amostras elas estão lá guardadinhas e e assim, a princípio não tenho tanta tanta intenção de voltar pro Brasil nos primeiros nos próximos três anos ainda, porque pedi mais três anos de afastamento. Então eu não posso orientar mais aluno porque eu tô fora do país. Eu só nem terminar de ordenar os alunos que eu tenho, não posso pegar novos alunos por não ter mais vículo com frn. Agora tô pegando aluno daqui do Canadá, mas da WPN mesmo não posso. Então essas amas precisa combinar, né, gente? Pegar essas amostras. >> Hã, >> a gente precisa de combinar, né, de pegar essas amostras. >> É, então as amostras são preciosas também, assim como você e aluna se dedicou, pegou, foi lá várias vezes, pegou um prontuário dos pacientes, a gente tem a folinar desses pacientes também, sabe, com com tempo. Então, realmente é muito muito são muito bem caracterizadas. Agrade considerações. Agradeço muito pelas suas brilhantes considerações. Eh, com certeza a gente vai acatar todas as suas sugestões. Eh, a ideia também das amostras, com certeza acho que vai dar uma parceria muito bacana. Não precisa ser só o Paxdgin. Paxdgin ele ele ajuda a manter conservado ali por uma semana até o processo de separação, né, do plasma. Mas se você coletou, por exemplo, em tubo de EDTA, isso já ajuda demais, porque o EDTA ele é ótimo para conservar também o CRDNA. >> Perfeito. Tá bom. >> Vivia, agora a gente nem tá mais fazendo no Pax G porque >> realmente ficouável, né? É cerca de R$ 50 um tubo de coleta. Então assim, tá bem salgadinho. Então o que a gente tá fazendo agora é coletar mesmo EDTA e centrifugar rapidamente. >> Ô Vivia, mas obrigada, viu, mais uma vez, né? Agradeço pelas considerações. Bianca com certeza vai corrigir, né, Bianca? Tese. >> Com certeza. >> Com certeza. >> Vou passar então pro Geraldo. O Geraldo ele é oncologista clínico, né? né? Fez doutorado aqui pela UFMG. Ele é um oncologista clínico eh do Hospital Semper e também da CETOS oncologia, né? E ele é coordenador então da equipe de oncologia desses dessas duas unidades, né? E membro titular da Sociedade Brasileira de Oncologia Clínica e também da minha sociedade para Oncologia Médica, Internacional. Então, Geraldo, obrigada por estar aqui, né? E passo a palavra para você.

Então, eu que agradeço o convite, viu, Luciano Bianca? É um prazer poder tá contribuindo aqui, tá? Com uma visão mais eh nem não de pesquisador, mas de oncologista, né? prática do >> do dia a dia aqui.

Eh, bom, primeiro eu queria parabenizá-las porque a escrita tá muito cuidadosa. A gente realmente não vê ou vê pouquíssimo erro de escrita, de qualquer coisa, que é que é algo que é raro hoje em dia da gente não ver, né, gente? Eh, tá ilustrado com ilustrações originais, né? Isso aí também é muito legal. Fluxogramas próprios. seu resumo tá muito objetivo. Eh, a metodologia tá bem clara, né? Tá bem bem explícita. Eh, e eu acho que é uma tese gost boa de ler, tanto para quem é da área clínica quanto para quem é da área eh de bancada, né? Ou seja, eh, você não você não deu nenhum fora em relação a à parte clínica ali, quando você explicou a a a questão clínica do câncer coloural, tá tudo direitinho, mas para uma pessoa que não entende tão bem de PCR digital, que não entende tão bem de PCR tecidual, etc., também consegui explicar bem eh pro pro profissional que é mais leigo nesses assuntos aí também ele está e com uma compreensão muito boa ao ler sua tese de tudo, né?

Eu concordo com a professora Vivian também que explicar um pouquinho mais de sensibilidade especificidade de valores preditivo é importante, é parece muito óbvio, né? Era para ser uma coisa de domínio público, não só para profissional da área de saúde, né? Mas em outras áreas da vida, mas não é e causa confusão, né? Eh, eu a minha o a minha tese foi sobre teste diagnóstico, então eu dormia pensando em sensibilidade especiidade de valor preditivo, né? Meu jeito mais fácil de pensar sobre isso é assim, sensibilidade são específicos do teste, são intrínsecos, inerentes ao teste, né? E o valor preditivo varia com a prevalência daquela condição na população também, né? E quando eu penso em sensibilidade, especificidade, eu penso na eu penso no doente. E qual que é a chance que eu tenho de achar o doente? No caso, se o doente seu aqui é >> o mutado no tecido. >> Mutado no tecido, né? Ou seja, se tá mutado no tecido, qual que é a chance >> de eu detectar esse mutado no tecido? E nós vemos que foi mais ou menos >> 29%, não é isso? >> Isso mesmo. >> E sendo que foi um pouquinho mais para quem tinha câncer e um pouquinho menos para quem tinha lesão precursora. >> Isso é a parte que eu acho mais original do seu trabalho, assim, uma contribuição mais interessante, porque realmente você pegou eh a gente viu que a PC digital performou bem, né? Né, Luciana? Quase igual. E vamos dizer, independente se era a lesão precursora, seá lesão avançada e independente do volume de doença, né, que a gente imagina que a lesão precursora, ela tem um volume de doença bem pequeno e a lesão eh eh do câncer tem um volume de doença muito grande e mas mesmo assim a diferença foi muito pequena da sensibilidade dos nas duas populações, né? E aí entrou outra coisa interessante que a sua população não é uma população típica de screening. População típica de screening você detecta é população na faixa de 50 anos, assintomático, com pouco fator de risco nenhum e que você vai ter uma chance de detectar um câncer de 03 a 1%. Tá, na sua população, você detectou câncer em 5%. Então ela não é uma população habitual de discren, é uma população de risco. Você vê pelos o que levou os pacientes a fazer a colonoscopia foi eh a presença de de alguns fatores, história familiar, história de polipatoquesia, né? Ou seja, sintomatologia. Isso isso não é screen mais, isso é pesquisa de sintoma, né? eh eh pesquisar uma doença para quem já tá tendo um sintoma em vários desses pacientes, provavelmente, né? E quando a gente pega os casos de câncer que foram diagnosticados na sua casuística, são todos cânceres avançados, viu? Eh, Vivian, assim, não metastáticos, mas não tinha nenhum câncer que era menos do que um T3N0. E você tinha vários tumores que eram T4 ou N positivo já, né? Então, na verdade, não é não é a fase que a gente quer diagnosticar o câncer mais, né, com screen. A gente quer diagnosticar um câncer mais no início ainda, né? Então, como eu tô te falando dessas questões clínicas, eu acho que essa parte podia ser um pouquinho mais elaborada na questão da discussão, sabe? como tanto como vantagens quanto como eh eventualmente determinadas limitações, né, que você chegou a discutir um pouco, você teve pouco número de de câncer, né, >> de câncer corretal. Isso, >> mas você pegou cânceres avançados ali, você teve desde pólipos pequenininhos e aí tinha adenoma, adenoma sererrilhado, tinha tinha adenoma túbuloviloso, que já é um um tumor de alto risco, né, até caso de câncer avançado já. e a sensibilidade não mudou muito de um de um tipo dentro desse espectro, né, de doença. Tá bom?

Eh, seus objetivos foram bem claros, foram, na minha visão, integralmente cumpridos. Eh, eh, a originalidade principal, eu acho que é a questão da alta sensibilidade analítica do do DDPCR, eh, principalmente elões pré-malignas, né? eh, onde a gente esperaria uma baixa fração de denatoral circulante, né? No entanto, você conseguir identificar, né? Eh, pelo menos é 1/ç deles, né? Eh, e a questão aqui que eu que eu coloco para você, que são discussões também que são válidas pra gente fazer lá na frente, um dado que eu achei interessante, você achou dois pacientes comutados, berrafica carraça, né? Foram dois, é isso, >> isso. Um com pólipo, eh, do blu viloso e o outro foi um caso de câncer corretal. >> Pois é, isso é raro, viu, da gente ver na prática a frequência disso é menor que 1%. Então, assim, eu acho que vale uma discussão, vale uma discussão. >> Acrescentar tanto nos resultados mais detalhadamente também na discussão, né, eu acho que a gente começa buscar, >> ex, tá? Porque o que que acontece? São duas mutações na mesma via de ativação, né, da MAP que é RK. Então assim, elas elas são eventos drivers assim do câncer, mas são redundantes. Uma não, você ter as duas não aumenta a a chance da célula tumoral sobreviver, né? Você tendo uma delas, você já promove a carcinogênese através de uma delas apenas. Então, na prática clínica do dia a dia, é muito, muito raro a gente ver eh um paciente ter uma comutação, um carrasco com noo, um carrasco com com berraf ou um berraf com nass, tá? >> Sim. >> Mesmo sendo relativamente comuns do ponto de vista isolado, né? Isoladamente falando, a gente tem 40% de carras, 5% de nasa e e 10% de berraf, né? Isso que é o é o padrão nosso no câncer. >> Exato. >> Tá? Eh, nas lesões precursoras já muda com o tipo de lesão precursora, né? Você você colocou isso bem explicado lá no seu trabalho, tá?

Eh, uma coisa que eu acho importante também da gente colocar no no trabalho é que assim, a biópsia líquida, que o objetivo nesse trabalho seu não é não é que ela seja um screening para câncer colorretal, né? ela não tá substituindo uma ou ela não pretende substituir uma colonoscopia. E por que não? Porque apesar dela ser muito dela ser até sensível para essas para essas mutações que você pesquisou, essas mutações são relativamente pouco prevalentes. Nós estamos falando de mutações que acontecem, cara, eh, juntando as três, você vai ter no máximo 50% dos cânceres estabelecidos vão ter uma das três mutações, né? Então, para você utilizar o o eh para screen, você teria que ver outras, né? Você teria que fazer um NGS, um painel mais amplo, você teria que fazer um umação, >> né? >> É, sim. Eh, alguma coisa termetilação do step, eh, da septina no que é uma que parece que é o mais sensível paraa identificação de câncer, porque é um evento quase que o bico logo no início da gênese do câncer coloretal tá apresente 70 90% dos casos. Eh, então assim, essa essa sim daria um estudo para você tentar comparar com um método de screening, né? Sim.

Então, assim, dentro disso que eu que eu te falei, o que eu te perguntaria como que você utiliza esse conhecimento que você tá adquirindo aqui na na sua prática? O que que você acha que isso aí pode melhorar? se isso pode melhorar alguma coisa paraa prática atual, clínica, se isso e e se não em que isso melhora como uma etapa mais paraa formação de conhecimento aí para novas paraa evolução aí dos estudos moleculares no câncer colorretal, né? Porque screen, a gente sabe que isso aí não vai servir, né? Eh, a gente já utiliza os marcadores na prática do dia a dia. Eu peço isso no consultório, o berraf e o carras em pacientes metastáticos quando eu não tenho acesso ao tumor inicial, tá, Luciana? A gente usa isso já para para para diagnosticar as mutações, porque essas mutações t um valor preditivo em terapêutica, tá? A gente sabe que paciente com mutação de Kras ou NRAS não responde bem a determinadas drogas, tá? São inibidores a gente sabe que pacientes com mutação de berraf são tumores mais agressivos, com menos responsividade a este tipo de droga também. Ou seja, mesmo que seja um carraço selvagem, mas tiver mutação de berraf, são pacientes que respondem pouco aos inibidores de AGFR. Então, a gente usa muito essas essas essas essas informações quando, por exemplo, acontece de às vezes se perder o material da biópsia, do material autorizar e não ter o material suficiente para para fazer o teste no próprio material, a gente faz isso no sangue e é relativamente comum consegui achar, tá? >> Geralmente por NGS, >> geralmente você pede painel. Uhum. por NGS, tá? Eh, então eu queria saber do que que vocês que que vocês que que vocês pensam assim em relação a esse conhecimento original que você adquiriu aí, que é realmente uma alta sensibilidade >> nas lesões precursoras, né, do do do DDPCR em relação agora paraa frente, assim, >> certo?

Eh, de fato, aplicar como screening hoje, realmente só com a avaliação dessas mutações pontuais, nós temos um desafio, né, uma limitação, não é o mais adequado. A seguida, né, depois que a gente conseguir por implementar outras formas de testes juntamente com a análise hotspot, então análise de fragmentônica, que eu vejo que tem uma uma capacidade muito boa de elevar essa sensibilidade, avaliação de eh de metilação também. Eu acredito que a biópsia líquida ela pode caminhar mais pro rastrinho, com o que nós temos hoje. Eu destacaria a essa frequência das alterações vistas em lesões precursoras, que eu acho que a abordagem das lesões precursoras, ela é ainda um pouco eh subexplorada na literatura. Então eu destacaria esses percentuais, essas frequências, por exemplo, de quanto tem de cada lesão. Eu acho que isso ajuda muito até no nosso laboratório, quando a gente for dar continuidade no estudo e for eh pensar, por exemplo, em aplicar biópsia líquida, utilizando outros marcadores, a gente já tem vários dados que vão nos ajudar, porque agora a gente já sabe a frequência esperada de cada tipo de alteração, a eh a frequência esperada de cada tipo de lesão, de quando a gente pensa emocarcinoma. eh adenoma viloso, túbulo viloso, eh a gente já consegue estimar, isso vai ajudar a gente até a definir outros números amostrais num próximo estudo, pensando já nessa estatística que a gente trouxe. Então acho que isso vai ajudar. Uma coisa que eu achei interessante também que pode complementar talvez a relação do carras com o túbulo viloso, que eu acho que também é interessante e como você mesmo citou, tubo viloso já é uma lesão bem mais agressiva que compromete mais. Então acho que seja algo interessante também para para ajudar mesmo nos estudos futuros. Então acho que o nosso estudo ele trouxe uma base muito boa para outros estudos, inclusive no nosso laboratório mesmo. Então para entender melhor essas frequências, as alterações esperadas, estimar os próximos casos de cada tipo de lesão, de cada quantidade de alteração, eu acho que ajuda muito nisso. Eh, e também ajuda em relação às frequências que trouxemos das quantidades de de alterações vistas, que eu acho, principalmente para lesões precursoras, eu acho que que eh amplia essa área mais subexplorada, >> essa estratificação de risco, né, pelo por essas lesões >> também. >> É, eu concordo com vocês, né? Quando a gente pede um screen, o que que a gente quer descobrir? A gente quer achar sobretudo lesões precursoras avançadas ou ou com alto potencial de se transformar em lesões malignas. Lógico, a gente quer achar o câncer inicial, a gente quer não achar nada, de preferência. Mas se tem uma lesão que faz diferença, você achar, por exemplo, uma lesão serrilhada, que ela evolui rapidamente para câncer, nem poucos anos, até mais rápido do que os adenomas. E ela é muito rica geralmente em berraf, né? O berraf tá presente essas lesões em até 80% delas, né? >> Eh, a gente quer achar um um tumor, um um túbulo viloso ou um viloso, né? que a gente não viu nenhum porque é mais ráo, mas é uma sequência lógica, né, de adenoma, adenoma tubular, túbulo viloso, viloso, que são >> os que tem um potencial de evoluir paraa malignidade mais rápido e e com mais chance de evoluir paraa malignização. E eles têm até 60% deles, ou mais do que isso, tem tem carraç, né, mutado. Ou seja, eh, se a gente >> é um marcador importante, >> é um marcador importante tanto berrafo quanto carras de lesões precursoras que são mais agressivas, né, >> e que estão presentes até com mais frequência nessas lesões do que às vezes no próprio câncer, tá? >> Sim. >> No próprio câncer em geral, né? quando você pega o câncer em geral, porque o câncer em geral e como ele vem de várias linhas de de de oncogênese, você você acaba diluindo, né, o papel de cada um desses marcadores. Então assim, eu acho que é um é uma informação importante, ela não tá pronta para ser usada na prática, mas é uma informação que >> de repente alguém que vai escrever um um estudo mais na frente lá, assim, vou eu tô fazendo um teste aqui, um um em uma biópsia líquida para poder eh tentar detectar não só câncer, mas lesões avançadas. De repente pode citar seu estudo lá no futuro. Aqui, ó, a Bianca já viu que a sensibilidade foi X para lesões avançadas, né? >> Sim, >> isso é importante. Agora para screen não tá pronto, não são esses os marcadores, né? Se você pegar que 50% dos cânceres vão ter no tumor e que 30% você detecta no sangue, aí é 30%, 50%, não é isso? A conta, exatamente, >> mais ou menos. Então assim, a chance de você pegar essa sensibilidade vai ser muito baixa e para ser screen, a sensibilidade é que tem que ser alta, não especificidade, né? >> Exatamente. Exatamente. >> Mas então eu acho que essas questões práticas elas podem ser um pouco mais às vezes discutidas na na discussão, colocar melhor na como a como a Luciana falou aí na hora da do dos resultados também, né, Luciana? colocar mais explícito em que caso que teve a cor, a presença lá da cor, a comutação, né? As duas mutações juntas. Eh, sim. >> E e essas perspectivas também de onde que você entra aí na contribuição para o que eu vou fazer no futuro, né? Paraa prática que nós vamos fazer no futuro, >> tá? >> Deixar isso bem claro na discussão, sabe, Bianca? >> Sim. Eh, eu acho que é basicamente é isso que eu

Queria falar para você, tá? Eh, eu eu li uma coisa também que eu fiquei assim incomodado porque você que escreveu lá na página 36 que em comparação com o padrão ouro, a biópsia líquida apresenta menor custo. Como eu não trabalho com bancada, eu não sei se é mais barato, viu? Pode ser que seja, pode ser que fazendo muito seja, né? A Viv falou aqui que o paciente não gosta de fazer colon, não gosta mesmo, viu? Mas isso >> a gente, >> eu acho que envolve os cursos da internação também, todo esse como assim, >> é uma coluna aí deve custar a casa de uns R$ 3.000, vamos dizer assim, até varia de dois para as 2 a 10, dependendo do local, tá? Só para dar uma noção para vocês. Então, acho que é mais barato, a Bielbio, acho que vai ser mais barato, né? Fica mais barato, imagina. >> Mas é interessante colocar os valores, a questão de custo aí. Lembrando que um teste de screen, ele vai gerar outro teste, né? Quer dizer, se ele vier positivo e se ele tiver alta sensibilidade, ele vai gerar um tanto de colonoscopia também que não vai dar em nada, não é verdade? E a gente tem que mensurar isso pelo tanto que ela conseguiu, que ele conseguiu evitar, né? O tanto de colonoscopia que ele que ele conseguiu evitar por outro lado, né? Sim, sim. >> Então tá certo. Mas é isso que eu queria colocar para vocês, tá gente? Geraldo, muito obrigada, tá, pelas suas considerações. Eh, com certeza também a gente vai explorar um pouco mais essa aplicação na prática clínica. Vamos destrinchar melhor essas ideias na discussão principalmente e eu te agradeço muito, muito mesmo por todas as contribuições. >> Obrigada, Geraldo. Geraldo acompanhou a Bianca, né? Esteve presente na qualificação, >> né, Geral. E essa visão de clínico é bem diferente na nossa visão aqui de pesquisador. Então, assim, eh, as contribuições realmente são muito válidas, tá, Geraldo? Muito obrigada.

Passar então pra Bruna, >> eh, a Bruna ela é residente >> pós-doutoral, né? Tá no departamento de Patologia aqui da universidade da UFMG. Eh, professora voluntária, não é isso, Bruna? Eh, no departamento da Mente Patologia geral >> e ela é uma fofa tá aqui hoje para contribuir com o trabalho da da Bianca, né? Obrigada, viu, Bruna, por ter aceito o nosso convite. >> Boa tarde, pessoal. Então, eu que agradeço, professora Bianca, por ter me convidado. É uma honra ler e avaliar mais um trabalho, né, dessa desse grupo de pesquisa de vocês. Eh, eu rapidamente, né, eu fui convidada que eu para ser suplente de um outro trabalho do grupo de de pesquisa e eu fiz questão de ir na apresentação porque eu acho muito interessante, é um grupo que traz trabalhos muito interessantes, robustos, bem fechados e até me perguntaram, mas como que procede, né, a pessoa suplente aqui sobe na mesa suplente nunca vai. Faço questão porque eu a lei fica curiosa e eu quero saber. Então, assim é pesquisador também, né? Além de profor. Então eu sou da área eh eh associada ao Departamento de Patologia, mas minha área de atuação é patologia molecular, né? Eu fiz mestrado na medicina molecular, então para mim é brilha meus olhos de ver esses trabalhos. Vocês excelente. A gente consegue evidenciado pelos trabal pelos editais, né, que a Bianca mostrou no final que é bem importante. Três editais nesse trabalho. Então, assim, uau. E o trabalho excelente escrita com muita clareza, os objetivos, tudo muito bem escrito. Apresentação também sensacional, mostrando muita calma, muita maturidade eh científica profissional. Então, excelentes. Eh, como professor geral sou pouquíssimas coisas também que eu posso te mostrar depois, muito detalhadamente. E eu comecei ali e falei: "Meu Deus, que que eu vou ter para contribuir para esse trabalho?" porque tá muito bem fechado, trabalho muito robusto e muito bem fechado. Mas vamos lá. Eh, sobre a questão do carras, né, da da questão de do carras nesses eh nesse subpo, né? Eu não sou médica, mas uma das questões que eu iria perguntar, mas que já foi discutida e perguntada aqui, foi essa, o que você diria dessa associação eh do carrasco com esse, deixa eu só pegar aqui na anotação, com esse tipo tubular viloso, né? Túbulo viloso. Isso. >> Túbulo viloso. E você já comentou a respeito, né, dessa questão dele ser mais eh ter características mais agressivas e tudo mais. E a sugestão de talvez ser um trabalho, fazer essa análise depois, né, da socição do Carras com esse eh subtítulo. E é curioso porque o carcinoma ele é ele faz parte da tríade do coloal, ele faz parte do que a gente chama de tríade eh dos cânceres associados ao carraça, né, que é o caral do colo retal, pancreático e eh pulmonar. E são cânceres extremamente agressivos. E por outro lado, a gente vê também a mutação carras em tumores benignos. O carras ele é uma mutação que que é uma eh está associada ao tumor odotogênicumatoide, por exemplo, que é um tumor indolente, encapsulado, não tem recorrência. Então, como que é esse furioso? E a gente vê também alguns casos presentes em até tecido normal, endométrio, já foi visto endométrio, já foi visto em esôfago, talvez, não sei, por ser alguma algum tecido que tem contato com agentes externos, talvez pela taxa de proliferação ao celular. Não sabemos, né? >> Eh, >> e aí uma dúvida. >> Oi, pode falar. Eu pode, acho que pode fazer sua pergunta, depois eu complemento. >> E aí, vocês usaram os controles para padronizar os testes, correto? Os os que não tem, é porque tem os controles os pacientes negativos, no caso, que deram negativos. Então eles foram importantes principalmente no cálculo do lobby, que a gente precisa de amostras que não têm positividade para aquela mutação. Então ajudaram sim muito para calcular o lobby. >> Que eu ia comentar. >> Você falou que foram uns 20 mais ou menos, né, que vocês vocês fizeram? >> Isso para fazer o lobby. No mínimo 20 desse grupo um sem alteração genética. Entendi. E você já viu se tem na literatura esse estudo de mutação berraf? Eu sei que não tem. Eu não vi ainda na literatura, pelo menos caso de mutação da RAF em células normais, em tecido normal, em tumor benigno tem, mas tecido normal não. Mas tem na literatura alguma coisa a respeito de tecido normal com eh dessa dessa área, né, com o carras ou então o que acontece com o carras pensando que ele é um marcador típico da sequência denoma carcinoma e o carras a gente escolheu muito ele porque ele muta bem lá no início, então ele tá ali na transição quando a gente pensa. Travou para vocês? >> A Bruna que travou. >> Ah, ela Bruna. Você tá escutando? >> Tá travada. >> Ó. Ela caiu. Espera só um pouquinho, Bianca. Deixa eu pedir para ele colocar, >> tá? Jú >> Fred. Eh, como eu tava falando assim, o carras ele é interessante porque ele muta bem no início da sequência. Então ele tá na sequência denoma carcinoma, que é a via mais estudada, e ele multa ali do início da lesão, quando a gente tem, por exemplo, um adenoma não avançado para um adenoma avançado. Então, e ele está assim em lesões que precursoras e às vezes até benignas por conta do momento pontual da mutação dele nessa sequência. Então, diferente, por exemplo, de TP53, que geralmente eh aparece a mutação quando a gente já tem um estágio bem mais comprometedor, muitas vezes associado ali à questão da metástase, o carras ele vem mais no início, eh ele não é frequentemente multado em, no caso, quando a gente pensa em tecido normal, né, a gente também eh não averiguou isso em relação às nossas amostras. Mas ele pode sim aparecer em lesões precursoras, em lesões benignas, por conta desse dessa mutação mais inicial que é característico do K ras, do NRAS e até do bras. Por isso até a escolha assim desses genes pra gente estudar, né? Como a gente pensou mais em mapear essas mutações importantes eh e que não fossem estágios tão avançados, o Carras ele foi um forte candidato por isso. >> Não, sem sombra de dúvidas, é um grande diferencial mesmo essas lesões precursoras estarem sendo estudadas, sem sombra de dúvidas. Eh, quanto à questão da dos pacientes com foram dois, né, comotação. >> Sim. >> Você, deixa eu só a você, você conseguiu acompanhar a evolução clínica uma coisa assim paciente? >> Então, desses pacientes a gente não chegou a fazer nenhum tipo de acompanhamento assim longitudinal. O que a gente tem é o resultado da colonoscopia, então que, né, foi aqueles desfechos que eu escrevi, mas assim de conseguir acompanhar temporalmente evoluções, isso nós não temos. Achei muito curioso, né, essa questão de de ter dado essa ocorrência, como o professor comentou, por se tratar de uma mesma via, né, acaba tendo uma redundância oncongica. Eu acho muito legal colocar isso, escrever, eh, não detalhar, mas discutir um pouco mais mesmo na tese e e no artigo, eh, que muitas vezes os estudos envolvendo, eles sugerem inclusive que pode levar a ser essência, né, quando esses dois genes eles estão comutados. Então, é um achado interessante, né, para para se discutir e entender. Por isso que eu tava curiosa para saber se tem o dopo desses pacientes, se tá relacionado a maior agressividade no depois ou não. >> Eh, a gente levou muito pro lado da heterogeneidade. Então, assim, da mesma forma que nós vimos pacientes que às vezes apresentaram duas lesões distintas, né? Uma mutada para Carrasa, outra para Berraf. Talvez isso possa acontecer também ali dentro de uma mesma progressão, eh, em função dessa heterogeneidade que que pode ser vista, né, e que é presente quando a gente pensa no andocarcinoma. É tudo muito heterogêneo. Então, o perfil molecular ali também não é, também tem essa heterogeneidade, não é homogêneo. Então, a gente pensou mais nessa nessa nesse ponto assim. Em relação a às comutações, >> mas apesar de ser só dois pacientes, né, Bruno, eu acho que assim fica difícil da gente falar qualquer coisa, mas eu acho que você pode eh avaliar, né, olhar no prontuário do paciente para ver se teve alguma alguma semelhança, >> tá? Depois você faz isso. >> Sim, eu posso posso resgatar os dados desse paciente. Sim. E foi detectado pela o BAC 61 foi detectado pelas duas técnicas e o BAC 1 107 foi só uma técnica, foi isso ou eu entendi? >> Eh, o B61 ele apresentou KH e berfos positivos no tecido e positivos também no CFDNA dos dois. Então também teve concordância. Agora o B 107, eu acho que ele foi positivo somente no tecido. Deixa eu só confirmar. >> E o 61 foi o que você tinha de cópias, não era isso? Foi o maior número de cópias para carrar. É, eu eu olhei aqui mesmo. É isso mesmo. E esse QPCR, eh, também retomando a fala da da professora, você na hora de descrever, eu acho interessante mesmo escrever pelo eh um pouquinho mais, às vezes não tão detalhada, porque a técnica principal que vocês querem chamar a atenção é o DDPC, mas talvez detalhar um pouco mais realmente vocês utilizaram qual que foi a metodologia o agente fluorescente foi sonda por aqui. Parece que foi sonda, né? Mas não >> foi sonda. >> Não sei se eu não consegui pescar direito. Não sei. >> Foi. >> Pelo que eu vi no artigo, vocês colocam isso? Não sei se achenta, >> mas foi por discriminação alérrica com sonda. Sim, >> discriminação alérrica com a sonda. >> É uma sonda screening, né, que detecta múltiplos >> Aham. Marcadores. >> Perfeito. E eu achei curioso também que aqui no no texto você colocou a sensibil, falando novamente em sensibilidade, né? A sensibilidade de 1% do QPCR. O DDPCR ele tem uma sensibilidade muito maior que o PCR, com certeza que o QPCR, mas a do QPCR ela pode chegar a 0,1% também, dependendo, né? Por isso que eu perguntei como que eh como que foi feito, qual que foi a metodologia. Porque pode chegar dependendo a 0,1, ou seja, você consegue pegar um ael mutado em um background, né, de 1000 referência o meu sem ser mutado. Mas seria isso às vezes escrever um um pouquinho mais a respeito, não ser tão detalhado, mas >> ponto com isso. >> Certo. >> Deixa eu ver que mais. Tem uma pergunta, mas eu vou deixar pro final porque é muito curiosidade mesmo. >> Mas eu vou tentar ser rápida aqui. É, quanto a figura do DDPCR, que vocês também conversaram no artigo, eu eu assim, né, eu adoro pegar esses artigos e ver essas figuras de resultado. Eu acho que enriquece bastante. Então, assim, talvez se puder dar minha opinião, mas talvez eh editar. Eh, eu vi que uma de uma figura para outra tem um espaço muito grande. Às vezes dá para editar, diminuir o espaço entre uma e outra para poder conseguir aumentar elas, eh, fazer uma figura maior também editando. Às vezes dá até Outra coisa que eu fiquei pensando que talvez deixar os controles e uma só talvez representativa de um paciente concordante, porque aí consegue deixar a figura maior, né? Ã, >> sim. Não sei. >> Você também. Bom, mas assim, eh, só conversando a respeito da figura que foi conversado mais cedo, que eu acho bem bem interessante. Eu gosto de pegar e ver, mas e é de cada um, né? De de cada um também. Hum. Eu também ia perguntar a respeito dos do da quantidade de sangue, né, do e fiquei pensando também além da questão da da padronização e tal, também tem questão de tem essa questão da padronização, né, que talvez se pegar mais sangue teria que padronizar de novo por conta de um background, de uma contaminação de glóbulos brancos, alguma coisa assim, né? Não sei se se aumentaria essa sensibilidade. >> Eu acredito que não preciso padronizar de novo. Eh, imagino assim, talvez ajustar uma questão ou outra em relação à centrifugação. Eh, mas em relação à sensibilidade, mais volume, melhora um pouquinho a sensibilidade, de fato, mas o que realmente a gente acredita que possa ampliar mais essa sensibilidade é a avaliação combinada com outras técnicas mesmo. E aí para fazer uma avaliação combinada com outras técnicas, a gente precisa de um maior volume. Por quê? Desses 4 ml, por exemplo, que a gente pega de plasma, a gente isola o CFDNA e chega em 15 microl de CF DNA ao final. Dos 15 microl, a gente utiliza ali em torno de 3 microl paraa reação de DDPCR. São três marcadores, já gastam 9 microl. Se precisa repetir uma coisa ou outra, já quase consome todos os os microlitros que a gente obteve ali do isolamento do CFDNA. Então é um cuidado que tem que ter se a gente amplia outras técnicas, porque a imetilação requer um maior volume de CFDNA também. Então são pontos que que também a gente precisa ter uma atenção eh em relação ao volume, pensando na sensibilidade, porque se eu vou trabalhar com mais técnicas, eu preciso de maior volume também para atender essas outras técnicas. E ainda mais pensando nesse contexto de lesões precursoras mesmo, né, levando em consideração a biologia, como foi conversado aqui, talvez tenha uma menor quantidade, né, desse CF para ser analisado pela própria questão biológica mesmo. Isso que, como alguns estudos citam, eh, pode chegar a menos de 0,1, que é a detecção ali da DPCR, quando a gente pensa em uma lesão precursora ou em uma um adenocarcinoma eh inicial, né, um estágio mais inicial. Então, realmente assim, a quantidade de CFDNA encontrado para essas lesões eh é uma quantidade menor se comparado a lesões mais avançadas. Quando eu tava lendo o o seu trabalho, eu tava pensando a respeito da dessa associação, né, de obesidade, câncer coletal e vocês consegui mais eh qualitativo, né, positivo negativo no DDPCR, mas acaba que a gente consegue ver por uma eh questão de quantidade a gente consegue cons ver, por mais que foi avaliado, sim ou não, consegue ver. Teve alguma diferença ou vocês não olharam isso? >> Eh, >> em paciência com essa obesidade, alguma coisa assim, ou vocês não chegam, >> você fala tipo em relação ao IMC, IMC maior, IMC menor, seria isso? Sim, essa quantidade, essa frequência, esse >> hum quantitativo a gente não percebeu. Foi mais uma análise eh qualitativa mesmo entre duas categóricas, tem ou não obesidade e tem ou não a lesão. Isso é mais questão e que eu falei que ia deixar para depois, que era mais uma curiosidade, porque eu tava lendo a respeito esses dias e quando eu tava lendo também o seu trabalho, que pensando se talvez a obesidade não tivesse associada não só ao desenvolvimento do câncer em si, mas também na detecção algumas vezes de algumas técnicas. Por exemplo, quando você tem essa esse contexto de uma eh inflamação crônica, a gente pode ter mais morte celular e tudo mais, será que tem mais CF sendo liberado ou não? Mas era só uma dúvida mesmo, uma curiosidade de pesquisadora mesmo. >> Eu achei muito interessante assim a linha de raciocínio. Eh, realmente eu não cheguei a ler algo assim diretamente, né, que fale. Quando eu li as questões da obesidade, foi mais a questão de manter ali um ambiente mais próinflamatório e favorecer essa divisão desordenada. Eh, mas é um ponto interessante que você colocou. Com certeza. >> Bom, eh, as minhas dúvidas foram prtic que não foram muitas, foram praticamente sanadas na apresentação e nas discussões anteriores, né? Assim, pouquíssima coisa para acrescentar. Posso te enviar depois uma coisa ou outra que eu escrevi. E é isso. Muito obrigada novamente pelo convite. É um prazer estar aqui nessa conversa, não só na leitura que foi leve e gostosa, mas também nessa conversa que foi nessa tarde. Muito obrigada. Nós te agradecemos também demais pelo aceite, pelas considerações. Com certeza vamos também acatar as suas ideias, vamos pensar mais eh nessa questão da obesidade também e te agradeço muito. >> Obrigada, Bruna, todas as considerações. E aca vai acatar a todas. Eh, vou passar então para Raquel, Dra. Raquel, ela fez doutorado no programa de medicina molecular, né? Ela desenvolveu projetos em farmacogenômica, risco genômico de câncer e tem uma ampla experiência em bioinformática. Eh, a Raquel hoje faz doutorado novamente em um novo curso. Então, ela eh tá aí, né, sempre pesquisando. Eh, daqui a pouco vai ser doutora duas vezes. Então, Raquel, muito obrigada, tá, por ter aceito o nosso convite. Passo a palavra para você. >> Imagina. É sempre um prazer estar com vocês. Eh, eu peguei a parte mais fácil porque todo mundo já falou. Todas as coisas que a gente tinha visto, né? Então vou começar, Bianca, te parabenizando mesmo pela escrita, pela organização das ideias e pelo seu esforço mesmo a mostrar, né, que já foi até levantado aqui. A gente sabe que pesquisa clínica não é bolinho, a coisa do N é difícil. Às vezes até, eu vi que você teve uma um trabalho ali de sala de de preparo, né, de sala de espera, às vezes a pessoa tem medo, já tá ali numa situação eh sensibilizada, né, por toda a situação, pela possibilidade de diagnóstico. E aí mais uma coisa, mais um furo, mais um tubo de sangue. >> Então a gente sabe que é desafiador. >> Então parabéns aí desde esse comecinho, né, da coleta. O tratamento. Eh, eu tenho algumas sugestões assim, poucas também no texto, mas como a gente é de casa também posso passar para vocês depois, tá? Eh, vou vou ir passando aqui nas minhas anotações, na tese e a gente vai conversando. Pode ser? >> Combinado? Eh, primeiro me chamou atenção na sua apresentação, é uma coisa que não tá na no documento da tese, eh, acho que tá na lá no finalzinho, na verdade, aquele primeiro artigo que você publicou que era de Carraz e associação com álcool, né? E aí a gente vê que na sua tese você não viu isso. >> Isso. >> Como é que, de onde que surgiu esse grupos diferentes? Eh, aquele artigo que a gente publicou foi um grupo com 42 pacientes, todos com câncer colretal, já diagnosticados. Então, foi assim um outro delineamento. Eh, e aqui na tese, muitas lesões precursoras, eh, foram só oito pacientes com câncer colretal em si. Então, talvez esse essa mudança de perfil dos dois grupos avaliados, né, aquele aquele artigo foram de dados de pacientes do meu projeto de mestrado, que também eram pacientes com câncer de intestino, só que em um outro contexto assim de já diagnóstico, eh, e todos com câncer lá para aquele artigo da associação com álcool não tinha nenhuma lesão precursora. Então, talvez seja pelo perfil mesmo do dos grupos avaliados. >> Sim, são duas cortes diferentes, então, né? >> Isso. Isso. >> Eh, uma coisa que o Geraldo trouxe que eu também fiquei o tempo inteiro enquanto eu tava lendo, é a questão dos custos, dos preços, porque você sempre fala: "Ah, é mais barato, mas quanto quanto que é uma colunoscopia? Quanto que é esse exame?" pensando assim, desde o tubo de R$ 50 até o kit de extração, que também não é barato, e as bids magnéticas e tal, e o kit lá do DDPCR, que a gente sabe também que tem uns que a gente até assusta, né? Então, você chegou a fazer essa clicação, acho que era interessante colocar em termos eh brutos mesmo pra gente ver que custo é esse em termos financeiros, né? E é claro que tem também os custos emocionais, a pessoa que não quer fazer a colunoscopia. Então, talvez fazer um parágrafo assim só falando da realidade desses custos, sabe? Não sei se você já sabe. >> A gente chegou a estimar um pouco, eh, principalmente lá no início, quando a gente viu que o o tubo Paxin vinha em dólar, né? A gente tinha que comprar em dólar e sai em torno de R$ 50 por paciente. Então a gente gerou assim, fizemos uma estimativa, nada muito formalizado. É, mas com certeza eu acho que é algo que daria para para aprofundar um pouco mais de tentar fazer as contas assim de considerando todo o percurso ali de análise, desde o tubo até as bids, eh as sondas, o material, acho que dá para estimar algo aproximado. Eh, outra coisa, Bianca, você chegou a pensar nesse tempo, porque a gente tá pensando assim, enquanto você tá fazendo sua tese, é um tempo alargado, né, que você tem para fazer essa análise. Eh, pensando em trazer isso paraa prática, além do custo, como é que é o tempo? Você sabe, você tem contato assim com alguém que faça na prática? Eh, você fala o tempo para realizar de DPCR ou tempo desde, por exemplo, do delineamento do paciente assim, ah, peguei o paciente, esse percurso seria o delineamento em si, >> é o percurso que você fez e o que que você acha que disso aí para trazer numa prática clínica, por exemplo, seria factível, não seria? >> Ah, sim. Eh, o nosso trabalho ele caminhou junto com a colonoscopia, então o tempo eh envolveu um pouco também dos resultados da colonoscopia pra gente conseguir analisar os tecidos, identificar as alterações, mas em termos de só pensando na linha da biópsia líquida, coletou o sangue. Posteriormente a gente separou o plasma. Plasma separado, a gente já consegue isolar o CFDNA. E aí o isolamento do CF DNA é o que eu diria que é um pouquinho mais demorado, então leva ali em torno de de separar um dia para isolar esse CF DNA, porque o processo é um pouquinho mais longo, né, do kit que a gente utiliza. Eh, depois mais depois de isolado CPNA, a gente já pode fazer a DDPCR também que leva um dia. Então assim, para já ter o resultado da biópsia líquida, acredito que dentro de 3s dias a gente já tem, já sabe que aquele se aquele CFDNA ali vindo do plasma, se ele tem alguma alteração ou não. >> Ótimo. Então, super factível, né, dentro aí da >> aplicável quando a gente pensa que sai mais rápido do que o resultado econômico. >> É interessante. Eu falei que eu ia começar dando uma varredura na tese, tô fazendo ao contrário. Tô pegando todas as coisas que eu fui pensando durante a vontade. >> Eh, >> como você >> Eu fiquei me perguntando por agora um pouco mais de técnica, o porquê das duas centrifugações, mas depois você falou que é para evitar contaminação com o anel de leucócito, né? >> Você acha que isso é realmente necessário durante aí a sua pesquisa? Você achou que fez diferença? Você chegou a fazer algum teste? Com uma centrifugação só ou aumentando o tempo, >> eles são imediatamente eh na sequência você centrifuga, tira, centrifuga de novo e tira. É isso. >> Isso. Eh, por que que a gente adotou fazer duas centrifugações? Pelos estudos anteriores que trabalham com biópsia líquida. Então a gente não chegou a fazer um teste porque de certa forma já é bem consolidado de que vale a pena fazer as duas centrifugações e ocorre de forma imediata. Então você pega o tubo de sangue, programa centrifuga, depois você vai pegar o o sobrenadante, que é o plasma, vai transferir para um microtubo menorzinho, perdófil ali de 1,5, eh, e depois você vai centrifugar de novo. Então, é etapas sequenciadas ali, né? Não tem um um uma pausa, alguma coisa desse tipo. É logo em sequência. Eh, >> e aí nessa segunda fazendo na prática >> Oi, >> acho que você ia falar justamente o que eu ia perguntar, se nessa segunda centrifugação você vi um pellet, você acha que realmente >> é isso que eu ia falar mesmo? Sim, porque a gente visualiza o pellet na segunda que vem desse anel de leucostas, então a gente ainda pipeta ali com bastante cuidado para não levar esse esse anelzinho, né? Resquício de leucosto que fica ali no fundo. Então, visualmente a gente consegue perceber que faz diferença assim as duas centrifugações. >> Entendi. Eh, uma outra coisa que eu fiquei pensando, né, durante a nossa conversa aqui, eh, pensando em volumes maiores e na sensibilidade, eh, e pensando que você tá usando um kit para, eh, separar esse CF DNA, você acha que tem um momento que as bids magnéticas ali elas vão estar saturadas e aí você tá colocando mais volume à toa ou faria realmente sentido você investir num volume maior inicial, porque essas bids ainda dão conta de de captar. >> Então, e o kit em si, ele traz isso. Então, por exemplo, o existe um kit para menores volumes, que é quando você trabalha com menos de 1 ml, e existe um kit para maiores volumes, para mais que 1 ml, só que ele também tem um limite, então ele só vai até 6 ml, por exemplo, né, que é o nosso que a gente tem, ele só vai até 6 ml. Eh, então existe um limite e os próprios fornecedores eles já trazem isso no kit. Então, ah, eu preciso isolar de volumes maiores, mais que 6 ml. Aí tem que buscar um kit que seja apropriado para esse maior volume. >> Uhum. Entendi. E pensando, Bianca, nessa robustez que uma análise multimodal poderia trazer, eh, e pensando que você usa dessa amostra apenas o plasma, você pensou em alguma outra análise que você pudesse fazer com esse refugo, entre aspas, né, com a sobra do seu plasma, ou seja, com DNA genômico, por exemplo, eh, snips, que a gente conhece que estão relacionadas ao risco genômico do câncer colretal, que será que isso seria interessante? Porque aí já é mais uma informação, né, >> de risco de enorme. Não é não é algo que vem da lesão, porque a lesão é de novo, né? Masim, >> eu fico fico pensando, Raquel, se trabalhar com o DNA genômico, talvez não tenda a câncer colgal familiar, porque o nosso foco foi o câncer colorretal esporádico, que envolvem mais alterações somáticas. E aí alterações somáticas, aí não enquadra tanto DNA genômico. Então, talvez em um estudo que além do câncer colretal esporádico, fosse abordar o câncer colretal como um todo e pegando também essa abordagem familiar, talvez eu acho que seria interessante. >> Mas dentro da sua amostra, você teve pacientes que tinham histórico familiar? Não teve? Sim, tinha um histórico, alguns tinham um histórico familiar, >> então não necessariamente foi focado mesmo no esporádico, né? É, o foco foi no estoradio, só que acho que a gente não teve exatamente também assim um um assim um diagnóstico específico falando: "Olha, esse câncer colorretal aqui é familiar, esse aqui é esporádico." O que a gente tentou fazer para evitar o familiar foi evitar coletar pacientes que tinham, por exemplo, síndrome de LINT, que tinham algumas doenças mais eh inflamatórias, eh Crom, por exemplo, que estão mais ligados ao familiar. >> É como se fosse as sindrômicas, né, entre aspas. Isso, perfeito. >> Mas o que a gente vê, esses sfs que eu tô falando, que estão relacionados ao risco genômico, eles não necessariamente estão ligados a síndromes ou a quadros específicos, mas são coisas que a gente já viu nos dewas, por exemplo, né, nos estudos de associação. >> Por isso que eu achei que interessante, né? Mas enfim, só como >> eu acho que é é válido assim, seria legal, interessante poder aproveitar essas outras eh amostras, né? Inclusive o DNA que a gente extrai ali, DNA genômico, ele é ótimo para muito boa. Mais eh talvez buscar outros eh entender essas alterações que esses estudos trazem e verificar se elas são específicas pro familiar ou se são aplicáveis também ao esporádico e pensar assim no >> na linha de estudo, né, a ser seguida se faz sentido ou não incluir essas análises. >> Uhum. Claro. Só quis trazer mais essa aí para para multimodalidade, que a gente pensa muito em coisas, né, diferentes ali de metilação e tal, >> genética, mas a genética ela tá ali também, né? >> A gente >> é bom lembrar, inclusive, me lembra, por favor, como é que foi a distribuição eh a entre as etnias das lesões? Eu eu sei que tá no seu trabalho, eu só não tô lembrando assim >> das etnias. Eh, o que a gente fez foi aquele quadrinho comparativo. Então, a gente tem a mostrando, ver, deixa eu até >> mostrar, qual que é ele na tese. >> Achei aqui. Você viu alguma coisa muito gritante? Acho que não. >> Só que nós não identificamos nenhuma associação em relação à etnia. >> Tô colhendo aqui se eu vejo. >> É, tá bem distribuído. Temos brancos, pardos, um pouquinho menos em negro, poólico, adenoma e câncer colretal. E aí tá na tabela química. >> Isso. >> E aí ela mostra essa distribuição de acordo com a etnia. Mas estatisticamente nós não vimos associação >> entre a cor, né? >> Exato. Entre etnia e o tipo de lesão, por exemplo, ou alteração genética. >> Uhum. Bom, é claro que eu já tô aqui pensando em milhões de coisas de ancestralidade, mas deixamos para o próximo capítulo, né? Eh, Bianca, falando em próximo capítulo, se você fosse assim pegar uma principal conclusão do seu trabalho nesses 4 anos, que que você me diria? >> Tá? Eh, eu diria que a biópsia líquida ela é muito promissora, ela assim, a gente ter detectado em lesão precursora, embora a sensibilidade ela foi baixa, né? Ali a sensibilidade geral de 29% tem potencial, tem potencial e eu acredito muito nessa combinação de análise multivariada. Então, combinando outras técnicas, a análise de fragmentômica eu acho incrível, porque a gente vê que o DNA ele é fragmentado, então o DNA ele é menorzinho, a gente tem ali em torno de 100 pares de base o fragmentozinho desse CR DNA. E muito legal assim que os artigos eles trazem que esse DNA ele é fragmentado, mas não é uma uma fragmentação aleatória. Tem enzimas que clivam esse CF DNA em locais específicos. Dependendo do tamanho dele ou das características, né, analisando a genética ali desse desse fragmento, a gente consegue ver, por exemplo, que os os eh os as bases terminais ou iniciais, elas têm um padrão muito característico que talvez poderia associar até ao tipo de local. Então, por exemplo, dependendo do tamanho do fragmento, do perfil dessa dessa sequência, a gente poderia estimar se trata, por exemplo, de um CFDNA liberado no fígado ou no intestino. Isso traria uma condução melhor pro diagnóstico precoce a partir da biópsia líquida. Então, eu acho que a fragmentômica eh é muito eh tem um potencial imenso para complementar e acredito que a metilação também. Então, eh, é um trabalho que tem muito potencial. Eu fiquei muito feliz assim com os resultados, embora a gente sempre quer que obtenha uma sensibilidade maravilhosa e que isso seja eh acima, mas é um um padrão que a gente vem observando na literatura e com certeza em eh implementando outras formas de análise, eu tenho certeza que que é uma técnica muito boa e que tem muito potencial para melhorar o rastreio e o diagnóstico precoce do câncer colretal futuramente. >> Uhum. E aí você já deu uma respondidinha na minha próxima pergunta que era: "Se você fosse fazer um pósdoc agora com esse tema, né, quais seriam os seus próximos passos?" Com certeza seria pensar quais são os genes interessantes para avaliar aqui na metilação. Eh, Geraldo inclusive citou o Sept, né, que é muito citado nos estudos. E assim, eu iria olhar outros genes relevantes ou eh paraa metilação. Eh, iria sondar também um pouco da fragmentômica. Eu já vi que é por NGS, então teria que que aprofundar, entender como que faz também a fragmentômica e seria combinar outras análises, tentar montar um painel com vários marcadores, várias alterações, várias eh técnicas moleculares agrupadas em um painel. Eu tenho certeza que vai elevar muito essa sensibilidade. >> Interessante. Seria muito legal se a gente tivesse um protocolo mesmo, né? Então, por exemplo, pensar desde que o paciente chega, qual que é histórico familiar? A partir desse histórico, qual que é o próximo passo? A partir disso aí, qual o próximo passo? É uma coisa muito interessante de fazer. E também eh deixo aqui uma provocação, né, de como que isso pode ser. Ou não pode ser implementado nas políticas públicas, né? Que a gente sabe que tem tem dificultadores assim de custo, né, de absorção da tecnologia mesmo. Então, assim, como que a gente pode ajudar esse fluxo do SUS? Se a gente consegue pensar em coisas aí, né, para direcionar esse paciente para pra gente pegar ele o mais precocemente possível, seria ótimo. >> Com certeza, porque se tem >> se tem um diagnóstico precoce e, por exemplo, eu consigo detectar aquele indivíduo antes da evolução progredir para um um adenocarcinoma nível três, nível quatro. E eu consigo já descobrir desde uma lesão precursora e removo essa lesão precursora, eu evito todos os custos que o SUS seria com aquele paciente adenocarcinoma nível três, nível 4. >> Então é é a eu li até um artigo muito interessante que fala sobre a interceptação do câncer. >> Isso. >> Seria interceptar, seria >> impedir essa progressão fazendo esse diagnóstico precoce. E com certeza isso pro SUS é muito relevante porque reduziria em muitos custos cirúrgicos de internação. Tem falar nos custos que a gente pensa da qualidade de vida para esse paciente, né, de interceptar o câncer aqui em uma lesão precursora ou em um câncer em estágio inicial >> versus um ad um adenocarcinoma avançado. >> Uhum. Agora, eh, pegando esse gancho aí do adeno carcinoma avançado, a gente viu na sua amostra, né, que teve alguns eh cânceres muito avançados com metástase, que, se eu não me engano, foram negativos no CFDNA. Você viu algum? Um caso, >> algum padrão assim que eu esperaria que quanto maior, mais avançado, mais metastático, mais fácil de achar no sangue. Mas tô entendendo que não foi exatamente isso que a gente viu, né? É, não é algo linear assim. Eh, com certeza o paciente em um estágio mais avançado, tudo contribui para que ele libere mais DNA na circulação, ainda mais quando a gente pensa em um paciente metastático. Porém, isso não é uma regra geral. Assim, não tem como universalizar que se o paciente ele já está em um estádio muito avançado, com certeza ele vai liberar. E a gente pensa em muitas coisas, assim, teve um paciente do do meu grupo de de amostras que era eh um paciente nível avançado, que tinha alteração no DNA residual e que não detectamos no CFDNA. E aí envolve assim muitas possibilidades. Eu penso em pré eh fases pré-analíticas, fase analítica e penso na própria biologia em si. Então esse paciente que não detectamos, será que o CFDNA ele foi metabolizado de forma mais rápida? Será que houve eh esse DNA, esse CF DNA, ele degradou em algum momento do processo? Será que eh biologicamente pela heterogeneidade eh a as células ali da metástases não eram as que carregavam essa mutação? E não, >> será que tava mais encapsulado, menos encapsulado, mais perto de >> Isso porque tudo influencia o sítio onde está, onde o tamanho, onde está. São muitos fatores que influenciam isso. Quando >> você não chegou a fazer, né? Pensou: "Olha que estranho, vamos ver como é que tava essa lesão. Essa lesão era dentro, era fora, ela tava poliposa para fora, tava mais encapsulada. Onde que tava essa metástase? Tava em linfonodo ou tava no fígado?" >> É, mais a fundo, não. O que a gente tem é são os dados da biópsia. Eh, então o que veio ali no laudo do da anatomia patológica que a gente colocou na tabela, temos aquelas informações, mais detalhes assim, seria ótimo se tivéssemos, mas realmente não temos. >> A gente fica curiosa, né? >> Sim, sim. Eh, mas é algo que não é a primeira vez que acontece, né? Até citei lá no meu trabalho outros estudos que também mostraram pacientes com nível avançado e que não tinham certo DNA detectado. >> Uhum. Eh, uma coisa que eu fiquei enfocada, Bianca, aí queria te perguntar para você me esclarecer mesmo, tá? Eh, aqui no artigo, eu acho que na tese também, na página cinco do artigo, se eu não me engano, você fala que teve concordância completa entre as amostras da biópsia de tecido e espécimens cirúrgicos. Ah, perfeito. >> Teve duas fontes de tecido. Eu acho que isso, se for isso, acho que podia tá mais claro no texto, porque a gente tá seguindo. Ah, tá. Aí veio parafina, aí fez a coleta, extração >> e de repente, >> como assim? >> Concordância completa com outro tecido. De onde vem esse tecido? Ninguém me contou. Entendi. Eh, a gente na colunoscopia, né, a gente obteve o bloco de parafina da biópsia da colunoscopia, só que depois quando o paciente ele foi, internou, fez a cirurgia, a gente pegou também o bloco da cirurgia. E aí, >> ótimo. Então, >> só para ser um padrão mesmo de >> Sim. De escrever lá, >> sabe? Porque aí, por exemplo, ah, será que na hora de tirar o tecido lá que você colocou aqui que foi eh concordância completa, eu tô entendendo que isso é uma coisa importante, né? Quer dizer que não teve contaminação na hora de tirar do do bloco de parafina. Tem várias questões aí, só que eu acho que a gente tem que saber de onde v esse tecido antes, tá? Aí eu puder talvez eu não tenha >> tanto. Vou vou me atentar. >> Faltou mesmo, viu Bian? >> Os métodos. É, eu coloquei nos resultados, né? Até naquela tabela dos pacientes com câncer tem o o resultado da descrição da colonoscopia e da peça cirúrgica, mas realmente nos métodos eu preciso detalhar melhor. >> Eh, bom, vou passar rapidamente numas coisas da do texto, tá? >> Se você quiser ir acompanhando aí, na página 50 a gente tem a tabela 16. Aí eu tô falando do texto da tese, >> OK? >> Eh, eu acho que só para favorecer a gente que tá lendo, você podia colocar em cima dessa C D T E SR, tá vendo que é a localização, né? >> Sim, sim, sim. >> O N tá na mesma linha, você viu? É o seu N, número de amostras. >> Uhum. Mas como tá tudo junto com a mesma cara, eu acho que se você colocar em cima localização, né, com uma chavinha assim, acho que facilita para quem tá lendo, tá? >> Ah, ok. Eu achei muito legal aqui na página 52 que você

Colocou a representação histopatológica das lesões. Achei muito legal porque a gente que é curioso, a gente quer saber qual que é a diferença. Mas sabe o que que eu acho que seria muito rico você colocar uma histologia sem alteração pra gente comparar, porque aqui você tem todas as alterações, mas eu não sei como é que é o tecido normal. Eu que não sou patologista. Fiquei curiosa para ver como é que é uma lâmina normal.

>> OK. Eh, na página seguinte, no seu parágrafo da análise das lesões, deixa eu ver. Eh, você fala primeiro de B-Raf, mas a primeira tabela é de KRAS. Aí eu tive que ir lá na outra página para ver de B-Raf, depois voltar para ver de ficou por último a de B-Raf, você fala dela primeiro, mas ela vai estar lá na 55, duas páginas para frente. De repente é legal colocar na mesma ordem pra gente ir acompanhando.

>> Ah, certo. Você está falando no tópico 5.3, Raquel, na página 32, eu acho.

>> 5.3.1.

>> Isso. 5.3.1.

>> Primeiro eu cito todas as mutações, que eu falo que as mutações foram detectadas em KRAS, NF.

>> Uhum. Eh, e aí eu tentei manter nessa ordem, não sei se se ficou muito claro isso. Aqui na 56 tem uma tabela de percentual de mutação, né?

>> Isso.

>> Só que aqui a gente ainda não viu os resultados do plasma. Talvez se essa tabela tiver depois vai ficar mais interessante.

>> Mas aqui é mutação só no DNA tecidual.

>> Mas aqui está falando ddPCR no título da tabela. Ah.

>> Equivale tecido e plasma. Tá vendo?

>> É, é isso sim.

>> Então,

>> eh, percentual de mutação do gDNA. É só que aí lá na última coluna você tem equivalência de tecido e plasma. E aí a gente não falou, não viu o plasma ainda, ainda está na no suspense.

>> Sim. Aqui é porque eu peguei as as amostras de tecido e fiz uma PCR digital de todos os positivos.

>> Uhum. Para ter esse resultado da frequência de mutação, que na PCR em tempo real, ele não me dá esse esse valor de cópias por microlitro.

>> Uhum.

>> Então eu não conseguiria calcular esta frequência de mutação.

>> Tem isso, né?

>> Então são todos dados de tecido mesmo. Aí por isso eu deixei antes da outra parte.

>> Entendi. Antes de

>> colocar aí colocar uma frase sobre isso, porque senão a gente fica achando que já é o plasma.

>> Perfeito. Sim.

>> Agora é curiosidade, tá? Sobre o processo de calcular o LoB e o LoD. Eh, esse processo ele é ensaio específico. Toda vez que você vai fazer um ensaio, você tem que fazer esse cálculo. Ou quando que você faz esse cálculo? É só a primeira vez que você vai fazer?

>> É a primeira vez que você for fazer, você já faz o cálculo. Eh, você faz um por marcador. Então, por exemplo, para KRAS você faz um específico para B-Raf, mas não precisa fazer, por exemplo, todas as vezes que for fazer uma placa de análise, ter avaliar o LoB daquele eh processo em si. Ele é feito uma vez só.

>> Entendi. Mesmo se mudar de kit, comprei outro kit do mesmo marcador. Não precisa.

>> Outro kit igual. A mesma sonda, tudo igual. Ou outro kit estou testando uma coisa nova. Não.

>> A mesma sonda. Outro lote. Precisa fazer de novo.

>> Mesma sonda. Outro lote.

>> Outro lote.

>> Ah, outro lote. OK. Se é a mesma sonda, os mesmos fatores, imagino que não seja necessária essa repetição.

>> Tá bem?

>> A não ser que queira ter um um

>> uma outra,

>> sei, talvez comparar assim, deixe, vamos averiguar se o LoB e o LoD eles variam com a mudança de um lote de uma sonda, sabe? Se quiser aprofundar mais para testar, mas acredito que não tenha um resultado,

>> eh, uma mudança tão significante assim, só por mudar o lote.

>> Uhum. Achei muito legal essa associação que que você viu, né, com a obesidade, eh, com o histórico familiar, a gente já imaginava. E aí, não sei se você fez a análise também para ver de onde que estava vindo essa história familiar, se era uma coisa de síndrome de Lynch, se era uma coisa, né, genômica mesmo. Mas achei interessante também eh sobre essa figura, né, essa Ah, não vai dar para ver

>> qual que é.

>> Aquela do ddPCR, né? Está no artigo.

>> Uhum.

>> Eh, só tem um de KRAS. O resto é tudo B-Raf ou branco e controle negativo, né?

>> Sim.

>> Então, de repente realmente deixar uma de cada mais o branco e o controle. E de repente você pode deixar até, por exemplo, a mesma amostra, né? Você tem uma amostra aqui, CRC1. Isso.

>> Que ela tem B-Raf e KRAS. De repente pode ser interessante deixar ela, né?

>> Ótima ideia.

>> Dá para aumentar bastante para todo mundo ver as bolinhas, né?

>> Eu achei uma ótima ideia. E aí, não sei, você vai aumentar um pouco, falar um pouco desses casos, né, que são concomitantes, mas se for também já fica aí uma figura ilustrativa para ele. Tá bem.

>> Perfeito. Perfeito.

>> Mata duas coisas numa só.

>> É uma caixa d'água só. Eh, e

>> ideia. Esse CRC1 é o mesmo que era jovem com muitos fatores de risco ou não?

>> É o

>> Não, é o BAC 61. É adenocarcinoma. Não é o mesmo paciente, não.

>> É outro caso.

>> Bianca, é isso. Parabéns para você. Achei muito legal. Agradeço terem me convidado. Eh, foi muito legal aprofundar um pouco no seu estudo e a gente sempre aprende muito, né, lendo trabalhos. Então, te agradeço e te desejo todo sucesso aí nos próximos passos. Depois você conta pra gente quais serão os próximos passos. Não sei se você tem vontade de trabalhar com oncologia daí para frente. Que que você está pensando?

>> É uma possibilidade boa. Agora que eu estou na medicina, com certeza a área da oncologia é de ter um cantinho especial assim no coração, né?

>> Pois é, já entra com as.

>> Sim. Eh, Raquel, te agradeço demais pelas considerações, por todo o apoio também. Eh, tenho um carinho enorme por você e muito obrigada. Com certeza vou acatar sugestões. Adorei a ideia da figura de colocar o paciente bem estratégico ali, que já consegue abraçar mais de uma ideia. Eh, e só tenho te agradecer.

>> Obrigada, Raquel. Muito obrigada.

>> Mais um. Eh, depois você pode passar a parte escrita para ela, já que você colocou.

>> Posso, tá, está toda rabiscada, gente, porque eu vou lendo e botando várias cores, puxando cores.

>> Tá ótimo.

>> Então, agora, Bianca, a gente vai pedir licença a você, né, que você saia um pouquinho pra gente deliberar aqui.

>> Tá bom. Er

>> Então, Bianca, eh, após aqui a deliberação, né, da banca, você foi considerada aprovada, né, no doutorado. Parabéns.

>> Desejo muito sucesso, Bianca, nessa nova vida, né, de começar tudo de novo. Sei que não é fácil. A Bianca teve vários desafios nessa na condução da tese, principalmente que vocês falaram, né, em relação à coleta. Eh, ela passou por muitos desafios no hospital a ponto de ter que realmente interromper a coleta, porque a a equipe da enfermagem achava que era eh, como que eu digo, que estava tendo desvio de função ao coletar ali um tubo a mais. Então assim,

>> né? Ficou foi o quê, Bianca? Foi quase um ano, né, que as coletas pararam.

>> Foi bastante tempo parado, foi quase um ano.

>> E a Bianca conseguiu, né, assim, super, tem super autonomia, então ela se desenrolou sozinha com essa ddPCR, que era uma técnica que a gente não tinha desenvolvido aqui ainda no no laboratório, né? Então assim, parabéns, Bianca e desejo muito sucesso na sua carreira, tá?

>> Obrigada, gente. Eu agradeço demais todos vocês aqui, eh, pelas considerações, pela presença, pela atenção em ler a tese, em contribuir. E eu só tenho agradecer, gente, muita gratidão e com certeza foram muitos aprendizados ao longo dessa caminhada da pesquisa.

>> Parabéns, viu? Parabéns. Obrigado. É ótimo.

>> Obrigada. Tudo de bom.

>> Gente. Muito obrigada mais uma vez, viu?

>> Bruna, Vivian, Geraldo, Raquel. Vivia, eu preciso dessas amostras.

>> Sim. Ah, estão lá paradinhas para você. Nem que que eu tenho que ir lá visitar a praia para buscá-las, tá?

>> É,

>> vai ser um sacrifício, né, Lu? Eu te ajudo, viu? Precisar de de duas pessoas para buscar, eu acho.

>> Vai lá também.

>> É, é bom que você já assim nesse ano, eh, porque eu ainda tenho, a Catiúcia ainda está lá, ela está para defender o doutorado e tenho mais um aluno, Eric, né? Eu tenho dois alunos que ainda estão no sob a minha, né, sob a minha supervisão, então eles ainda têm acesso, mas depois que acabarem o doutorado deles, se eu não retornar pro Brasil,

>> realmente essas amostras vão ficar perdidas. Então realmente importante é que a gente

>> faça isso. Cati se ficou de fazer um levantamento para mim e assim que ela terminasse esse levantamento, ela ficou de entrar em contato.

>> Ah, então vou cobrar ela, tá bom? Então

>> então aí eu estou nessa nessa fase.

>> Tá bom. Tá bom.

>> Eu falo com ela então. Tá bom, obrigada. Tchau, gente. Parabéns.

>> Então, vou encerrar, né?

>> Encerro aqui então a defesa de tese da Bianca. E bom dia para vocês, gente. Até mais. Tchau.

>> Tchau, gente. Muito obrigada. Pera aí, deixa eu só tirar