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biologia lezione 34. In questa lezione parleremo della replicazione del DNA. Cerchiamo di capire innanzitutto che cos'è.
La replicazione del DNA è un processo attraverso cui la cellula produce una copia identica del proprio patrimonio genetico. Questo processo si attua ogni qual volta la cellula debba dividersi. Ad esempio, se deve andare incontro a mitosi, la cellula produrrà una copia del DNA in modo tale che poi le cellule figlie abbiano ognuno una copia di DNA di partenza.
Entriamo adesso nel vivo della replicazione del DNA e partiamo proprio dall'inizio della replicazione. C'è un passaggio obbligato: il DNA, per essere replicato, necessita innanzitutto di essere aperto. Quindi, bisogna aprire la doppia elica DNA. Questa apertura avviene in alcuni punti ben precisi, quindi non è casuale. Questi punti sono proprio detti punti di origine della replicazione.
Questi punti hanno delle caratteristiche in comune fra di loro. La caratteristica principale è che sono regioni ricche in adenina e timina. Questo sostanzialmente perché, essendoci adenina e timina, essendo adenina e timina legati soltanto a due ponti idrogeno rispetto a tre ponti idrogeno, è più semplice avere l'apertura.
Negli eucarioti ci sono una serie di elementi ben precisi che entrano in gioco affinché il DNA si apra. Primo fra tutti l'ORC (Open Recognition Complex), cioè un complesso che va a riconoscere proprio il sito di apertura, il punto di origine. Esso richiama altre due molecole che sono CDC6 e CDT1, che a loro volta richiamano due molecole di MCM. In realtà, parlare di molecole per MCM non è propriamente corretto, in quanto ogni MCM è in realtà un complesso multisubunitario costituito da sei subunità proteiche con attività elicasi. Tutti questi elementi, nel complesso, portano all'apertura del DNA e quindi alla formazione di quella che poi chiameremo bolla di replicazione.
I punti di origine all'interno degli eucarioti sono circa 2080 e sono distanziati da varie basi fra di loro, mentre nei procarioti abbiamo un solo punto di origine. Qual è il motivo della presenza di più punti negli eucarioti? È nel numero di basi che devono essere replicate. Se ci fosse un solo punto di origine, con la velocità tipica degli enzimi della replicazione del DNA, tutto il DNA umano verrebbe replicato in 800 ore. Invece, il fatto di possedere più punti di origine permette una replicazione in parallelo di più segmenti diversi e quindi la replicazione di tutto il DNA in un minor tempo.
Dopo aver visto quindi l'inizio della replicazione, iniziamo a vedere quelli che sono i protagonisti del processo replicativo. Sicuramente uno dei protagonisti principali, che già abbiamo incontrato sotto il nome di MCM, è l'elicasi originario.
Affinché il filamento Master possa diventare substrato degli enzimi replicativi, deve avvenire la sintesi del nuovo DNA. Man mano che però la bolla replicativa si apre, dobbiamo immaginare che ci sono comunque delle basi azotate che rimangono fluttuanti e che naturalmente tenderebbero a riavvolgersi, quindi a riunirsi fra di loro e riformare la doppia elica. Per far sì che questo non avvenga subito appena l'elica si apre, la doppia elica si legano delle SSB, cioè Single Strand DNA Binding protein, cioè delle proteine che vanno a legare il DNA appunto single strand, a singolo filamento, e respingendoli fra di loro tengono il DNA aperto in modo tale appunto che la bolla rimanga aperta e possa avvenire il processo replicativo.
Ma i veri attori della replicazione del DNA sono le DNA polimerasi. Parliamo di DNA polimerasi al plurale perché sono di vari tipi, anche se hanno delle funzioni simili e delle proprietà comuni. Intervengono nel processo replicativo in momenti e con funzioni leggermente diverse. La prima DNA polimerasi che individuiamo è la DNA polimerasi Epsilon. Questa si inserisce all'interno della bolla di replicazione e man mano che la bolla di replicazione si apre, la DNA polimerasi Epsilon scorre sul filamento Master e utilizza l'informazione del filamento Master per creare il filamento neosintetizzato, quindi il nuovo filamento. Va notato che la DNA polimerasi Epsilon, e questo è una caratteristica comune della maggior parte delle DNA polimerasi, va in direzione 3' 5' rispetto al filamento Master. Questo significa che la DNA polimerasi Epsilon non può codificare a partire dal punto di rottura nella direzione opposta perché appunto questo andrebbe contro le regole della DNA polimerasi.
Per questo, oltre alla DNA polimerasi Epsilon, entra in gioco un'altra DNA polimerasi che è la DNA polimerasi Delta. La DNA polimerasi Delta cosa fa? Va ad attaccarsi a monte e quando diciamo a monte intendiamo al 3' del punto in cui è iniziata la replicazione della DNA polimerasi Epsilon e sintetizza un piccolo frammento, solitamente di 100-200 nucleotidi. Dopodiché si stacca e si va ad attaccare ancora più a 3' e sintetizza un altro frammento. Il risultato qual è? È che avremo per ogni lato, quindi per ogni filamento Master, due tipi di filamenti neosintetizzati: un filamento continuo che è il filamento leading, che viene sintetizzato senza interruzioni perché comunque si trova sulla linea della DNA polimerasi Epsilon e quindi in direzione 3' 5'; l'altro filamento invece è il filamento lagging, cioè un filamento che viene sintetizzato in tanti frammenti che sono detti i frammenti di Okazaki, che poi vedremo verranno uniti assieme in un secondo momento.
Da notare la specularità, cioè se sul filamento Master 3' 5' abbiamo il filamento lagging, è ovvio che sul filamento Master opposto, che è una direzione opposta, lì avremo il filamento leading e lo stesso discorso vale al contrario per l'altro versante. Ma dove si lega a livello proprio chimico la DNA polimerasi? La DNA polimerasi, sia Epsilon che Delta, va a legarsi a livello del 3' OH libero ed ecco perché poi la direzione è 3' 5' rispetto al filamento Master e da qui poi può iniziare il suo lavoro di sintesi e quindi di formazione dei nuovi nucleotidi.
Quanto detto quindi fa sorgere un problema: se la DNA polimerasi, sia essa Epsilon o Delta, ha bisogno di legarsi a un 3' OH libero, come fa a iniziare il processo replicativo dato che comunque non c'è un nuovo filamento? Dovrebbe iniziare dal nulla e questo non è possibile. Il problema viene risolto da un'altra DNA polimerasi che è la DNA polimerasi Alfa, anche detta primasi. Questa DNA polimerasi ha delle caratteristiche leggermente diverse rispetto alle altre due, in quanto è capace di sintetizzare un nuovo filamento, o almeno un frammento di un nuovo filamento, partendo dal nulla, quindi senza aver bisogno del 3' OH libero. Questa DNA polimerasi quindi va a sintetizzare un corto filamento sia di RNA che di DNA che è proprio l'innesco e viene quindi chiamato primer. In realtà solo 7-10 nucleotidi sono di RNA, gli altri invece sono principalmente a DNA. Questo però è molto importante perché a questo punto le DNA polimerasi, sia Epsilon che Delta, avranno un punto di inizio, un 3' OH libero, quindi potranno legarsi e iniziare il processo replicativo.
C'è una piccola differenza però fra l'Epsilon e la Delta: l'Epsilon ha bisogno di un solo primer perché si lega una sola volta al DNA e poi sintetizza in maniera continua. La DNA polimerasi Delta invece avrà bisogno di un primer per ogni volta che si va a legare al filamento master. Quindi questo significa che noi avremo tanti inneschi. Però in realtà ne vedremo soltanto uno al 3' o meglio, vedremo la parte RNA dell'innesco soltanto all'estremità 3'. Questo perché? Perché man mano che le DNA polimerasi Delta si legano, vanno a sostituire l'RNA del primer al 5' con DNA e quindi quello che otteniamo sono sì tanti frammenti, ma tutti a DNA e solo all'estremità 3' c'è una parte RNA.
Dopo che quindi il processo replicativo della DNA polimerasi è stato attuato, entra in gioco un altro enzima che è la ligasi. Come già il nome dice, la ligasi ha il compito di andare a unire tutti le interruzioni che ci sono nel filamento lagging e unire poi il filamento lagging al filamento leading. Quello che quindi otteniamo ad ambo i lati è un unico filamento tutto a DNA, fatta eccezione per l'estremità 3' rispetto al filamento Master che ancora a RNA.
Ed è proprio questa estremità a rappresentare un altro aspetto particolare del processo duplica. Abbiamo visto che le parti RNA degli altri inneschi venivano sostituite dalla DNA polimerasi Delta che man mano sostituiva RNA a DNA. Abbiamo però anche detto che la DNA polimerasi Delta non si può legare al DNA in maniera casuale, ma ha sempre bisogno di un'estremità 3' OH libera. Dato che l'estremità 3' rappresenta la fine del filamento, al 3' non ci sarà più niente, non ci sarà il nuovo DNA, non c'è quindi un punto di ancoraggio per la DNA polimerasi Delta e quindi quel frammento RNA non può essere sostituito. Dato che poi l'RNA ha un'emivita minore del DNA, quel frammento verrà perso.
Vediamo adesso più nel dettaglio. Le parti terminali delle molecole di DNA sono formate da regioni altamente ripetitive che sono dette appunto telomeri, perché si trovano alla fine della molecola di DNA. Questi telomeri non portano informazione genetica, ma sono importanti come orologio cellulare perché, dato che ogni processo replicativo vengono persi, significa che man mano che la cellula si divide più volte, perderà sempre più telomeri. Una volta però persi tutti i telomeri, inizierà a perdere informazione genetica all'estremità e questo rappresenta un problema per la cellula, in quanto andrà incontro a un caos genetico e quindi porterà inevitabilmente alla morte cellulare. Ecco perché la lunghezza dei telomeri può essere definita come l'orologio biologico della cellula: più si accorciano e più la cellula sta invecchiando.
Non tutte le cellule però presentano questo problema dell'accorciamento. L'RNA ha una sequenza complementare alla sequenza dei telomeri. Dato che sono regioni ripetitive, la sequenza è complementare a queste ripetizioni, quindi la telomerasi può catalizzare l'allungamento del filamento Master. Una volta che il filamento Master è più lungo, quello che succede è che adesso la DNA polimerasi Alfa si può legare e quindi sintetizzare il primer, e poi si può legare la polimerasi Delta e quindi sintetizzare un pezzo di telomero. A livello 3' avremo sempre un innesco RNA che va perso perché comunque il primer avrà sempre quei 7-10 nucleotidi RNA. Però se andiamo a fare il confronto con il telomero senza l'intervento della telomerasi, vediamo che pur avendo perso quella parte RNA, comunque il filamento è più lungo di come sarebbe se non ci fosse stata la DNA polimerasi. Quindi, in sostanza, la telomerasi permette ai telomeri di rimanere non solo lunghi quanto prima, ma addirittura più lunghi di prima.
Quanto detto per le DNA polimerasi Delta ed Epsilon è leggermente più complesso se lo immaginiamo ad agire in contemporanea. Infatti, esiste un sistema detto sistema clamp-clamp loader, che serve a tenere unite le due DNA polimerasi. In particolare, i due clamp si associano alle due DNA polimerasi e poi il clamp loader tiene unito i due clamp e obbliga le due DNA polimerasi a muoversi nella stessa direzione. Questo, se ben ci pensiamo, è un problema perché una delle due DNA polimerasi, in particolare la DNA polimerasi Delta, non potrà muoversi nella direzione imposta dal clamp loader perché è una direzione 5' 3' rispetto al filamento Master e questo va contro le regole delle DNA polimerasi. Questo obbliga il DNA, il filamento Master, ad assumere un aspetto a forcella di replicazione, cioè è costretto a ripiegarsi formando appunto una forcella, in modo tale che le due DNA polimerasi possano viaggiare nella stessa direzione ma senza andare contro le regole delle due DNA polimerasi.
La forcella ha un meccanismo di funzionamento molto particolare, in quanto man mano che viene sintetizzato il nuovo filamento, essa si ripiega ulteriormente, quindi scorrendo, lasciando nuovamente spazio alle DNA polimerasi Alfa e Delta per sintetizzare il nuovo filamento, il nuovo frammento del filamento lagging.
Un'ultima classe di enzimi importanti nel processo replicativo è rappresentata dalle topoisomerasi. Perché c'è bisogno delle topoisomerasi? Immaginiamo il processo replicativo: man mano che la bolla replicativa si apre, il DNA sia a valle che a monte diventa iperavvolto su se stesso, con il pericolo di sviluppare delle anse secondarie. Questo problema viene risolto proprio dalle topoisomerasi, il cui ruolo è evitare la formazione di questi superavvolgimenti. Entrambe operano formando delle intaccature nel DNA, in modo che lo stress da iperavvolgimento venga meno, e poi ricucendo il DNA in modo che appunto, dopo che questo si è svolto. In realtà, però, il meccanismo è leggermente diverso, in quanto la topoisomerasi 1 va a operare un solo intacco sul filamento del DNA, quindi avviene questa rottura, il filamento scorre e poi va a essere richiuso, mentre la topoisomerasi 2 va a operare due rotture e solo successiva, quindi su tutti e due i filamenti, e poi li va a riformare, a richiudere, quindi formando di nuovo l'elica del DNA distesa.
Dopo aver visto quindi nello specifico come avviene la replicazione del DNA, vediamo a livello generale quindi cosa possiamo ottenere da quanto detto. Innanzitutto, un processo bidirezionale, e quindi l'abbiamo visto con le due polimerasi diverse. È un processo semiconservativo, perché ogni molecola di DNA figlia avrà una molecola di un filamento di DNA Master e un filamento di DNA neosintetizzato. È un processo estremamente preciso, perché le DNA polimerasi sono dotate di un sistema di proofreading, cioè vanno a controllare i nucleotidi che vengono inseriti e nel caso in cui ci sia un nucleotide anomalo, questo nucleotide viene sostituito. E poi è un processo che avviene molto velocemente. Questo l'abbiamo detto quando abbiamo parlato dei punti di replicazione che sono molti, appunto, nel DNA eucariotico e questo permette alla replicazione di avvenire in tempi molto rapidi.