Danno da radicali

Patologia cellulare. In questo video concludiamo il discorso sul danno cellulare, andando a parlare della sua forma più complessa: il danno da radicali. Faremo, inoltre, un escursus sulle forme di danno che derivano dalla combinazione di quelli che abbiamo visto finora.

Il danno radicalico è, come dice il nome stesso, il danno causato dai radicali liberi dell'ossigeno e di altre specie chimiche, tra cui l'azoto. I radicali sono molecole con un elettrone spaiato nell'orbitale più esterno e che, quindi, sono estremamente reattive. Tra i radicali più comuni nel corpo umano abbiamo: lo ione ossidrile, che possiede un ossigeno con un elettrone spaiato; lo ione superossido, che però presenta un elettrone in più delocalizzato su entrambi gli atomi; lo ione ipoclorito, uno dei radicali più potenti, che è formato da un legame tra ossigeno e cloro con una carica negativa sull'ossigeno. Questo radicale è estremamente usato dal sistema immunitario per distruggere i patogeni. Poi abbiamo lo ione perossinitrito, che è formato da una complessa molecola che comprende anche l'azoto. Poi abbiamo lo ione perossido, che è un perossido al quale è stato tolto un idrogeno. Abbiamo l'ossigeno singoletto, una forma di risonanza molto particolare della molecola dell'ossigeno. E infine, abbiamo il perossido di idrogeno, che, pur non essendo un radicale, tende a decadere spontaneamente in due ossidrili in condizioni quasi fisiologiche.

I radicali si formano in diversi punti della cellula, ma, senza dubbio, una fonte principale della produzione di radicali è rappresentata dalla catena di respirazione a livello mitocondriale. Ricordiamo che la catena di respirazione a livello mitocondriale porta alla produzione di grandi quantità di ATP, il tutto a partire da NADH e FADH2. L'idrogeno contenuto nel NADH e i suoi due elettroni vengono separati all'inizio della catena e sul complesso 1 vengono passati due elettroni, mentre il protone viene rilasciato nella matrice mitocondriale. Attraverso il complesso 1, i due elettroni vengono caricati sull'ubichinone, che è un trasportatore, formando un atomo completo, unendosi con i protoni presenti nella matrice. L'energia che viene liberata da questo fenomeno è sufficiente per pompare nello spazio intermembrana quattro protoni. In sintesi, questa è la reazione catalizzata dal primo complesso: NADH ubiquinone ossido reduttasi. L'ubichinone 1 trasporta questi due atomi di idrogeno a livello del terzo complesso, dove un elettrone viene ceduto al citocromo C. Un altro elettrone, invece, rimane a livello del complesso terzo. L'energia liberata da questo processo è sufficiente per pompare quattro protoni nello spazio intermembrana. L'elettrone che si appoggia temporaneamente sul terzo complesso viene scaricato su un altro ubiquinone, che però, legando un solo elettrone, diventa esso stesso un radicale: radicale semichinonico. Tuttavia, quello che accade normalmente è che rapidamente il complesso terzo viene raggiunto da un altro ubiquinone carico e dà il via a un nuovo ciclo che pompa fuori quattro protoni, passa un elettrone sul citocromo C e un altro nel complesso terzo. L'elettrone nel complesso terzo lega subito il radicale semichinonico, convertendolo in un ubiquinone capace di trasportare due atomi di idrogeno carico. In sintesi, questa è la reazione del terzo complesso. Il quarto complesso, poi, si carica degli elettroni dal citocromo C e li passa su un atomo d'ossigeno, andando a creare quindi una molecola d'acqua e pompando all'esterno due protoni attraverso l'energia rilasciata dal fenomeno. Per questo si dice che l'ossigeno rappresenta l'accettore definitivo della catena di trasporto. In sintesi, questa è la reazione catalizzata dal quarto complesso.

In tutto questo, abbiamo saltato il secondo complesso, il quale funziona in maniera abbastanza autonoma ed è un enzima del ciclo di Krebs. Sfruttando il FADH2 prodotto a questo livello, sposta due elettroni provenienti dai due atomi di idrogeno del FAD su un ubiquinone scarico, ovviamente sempre legandoli a protoni e legandoli all'ubichinone, quindi sotto forma di idrogeno. Questo fenomeno non catalizza il passaggio di protoni nello spazio intermembrana. L'ubichinone, poi, andrà a legarsi al complesso terzo, esattamente come abbiamo visto prima. Questo riepilogo della respirazione cellulare è necessario perché è a questo livello, come ho anticipato prima, che comincia la formazione dei radicali. Nello specifico, a livello del terzo complesso, nel momento in cui si forma il radicale semichinonico, esso è una molecola altamente instabile e, se il flusso di ubiquinone attraverso la membrana non è sufficientemente veloce, l'elettrone sul radicale semichinonico viene ceduto al primo accettore disponibile, che normalmente è l'ossigeno molecolare che si trova nella matrice mitocondriale. L'ossigeno molecolare, accettando un elettrone, va in forma di risonanza, diventando anione superossido, ed è questo il punto in cui la respirazione cellulare forma essa stessa i radicali. Il flusso di ubiquinone attraverso la membrana normalmente è sufficientemente veloce da garantire che questo processo sia minimo, poiché il radicale semichinonico viene subito caricato di un altro elettrone dall'ubichinone carico che raggiunge il complesso terzo dai complessi precedenti. Tuttavia, quando la cellula è in situazione di danno e quindi tende a produrre meno equivalenti riducenti, il flusso di ubiquinone attraverso la membrana è sufficientemente lento da garantire il processo che abbiamo appena visto.

Il superossido rappresenta, quindi, la forma base dei radicali cellulari, poiché tutti gli altri, in un certo senso, derivano da esso. Abbiamo visto come venga prodotto a livello della fosforilazione ossidativa mitocondriale, ma bisogna sapere che il radicale superossido può essere prodotto spontaneamente dai leucociti, i quali, attraverso le loro ossidasi, sono capaci di formarlo come arma di offesa. Il superossido viene convertito in perossido dagli enzimi contenuti nei perossisomi o dalla superossido dismutasi. Il perossido, a sua volta, può essere prodotto anche da un'altra fonte: la xantina ossidasi, enzima che si occupa dello smaltimento dei prodotti di rifiuto del catabolismo delle purine. Per catalizzare la formazione di acido urico, ha bisogno di una molecola d'acqua e di un ossigeno e, nel processo, si può formare il perossido di idrogeno e, raramente, anche il superossido. Il perossido di idrogeno decade quasi spontaneamente in ossidrile. Questo fenomeno è favorito moltissimo dalle radiazioni. Altro fenomeno che favorisce il decadimento del perossido in ossidrile è la reazione di Haber-Weiss. Normalmente, in presenza di ferro allo stato d'ossidazione ferrico, l'anione superossido può essere convertito in una semplice molecola d'ossigeno con riduzione del ferro a ferro ferroso. Il ferro ferroso, però, reagendo con il perossido di idrogeno, può ossidarsi e portare alla formazione di due radicali ossidrilici. Fondamentalmente, quindi, possiamo semplificare queste due reazioni e creare, appunto, la reazione di Haber-Weiss, in cui, a partire da una molecola di superossido e una di perossido di idrogeno, si ottiene una molecola d'ossigeno e due ossidrili, e questo attraverso prima una riduzione del ferro e poi una sua riossidazione. In questa reazione, quindi, il ferro non si consuma; anzi, al termine di una reazione di questo tipo, il ferro sarà tornato di nuovo in forma ferrica. Per questa ragione, questo metallo può causare ingenti danni radicalici.

Ultimo radicale è il perossinitrito, che si forma per reazione tra l'ossido nitrico, che normalmente viene secreto in numerosi processi, e l'anione superossido.

La rimozione dei radicali liberi avviene in quattro modi diversi. Il primo è il più semplice: il decadimento spontaneo. Abbiamo detto che i radicali liberi sono specie estremamente reattive, quindi tenderanno a reagire con qualche composto cellulare. Il problema del decadimento spontaneo è che non è un fenomeno controllato, quindi può facilmente accadere che il radicale vada a legarsi dove non dovrebbe.

Uno dei più efficaci sistemi antiradicali del corpo umano è il glutatione. Il glutatione è un tripeptide, è formato da cisteina, glicina e glutammato, ed esiste in due forme: la forma ridotta, che si scrive anche GSH, è quella comunemente attiva. Due glutationi ridotti sono capaci di reagire con una molecola di perossido di idrogeno e formare due molecole d'acqua. Gli idrogeni che verranno ceduti dai gruppi sulfidrilici del perossido di idrogeno per formare, appunto, le due molecole d'acqua, i due gruppi sulfidrilici uniti tra loro in questa forma, si parlerà di glutatione ossidato, che si scrive anche in formula GSSG, proprio a indicare il legame tra i due gruppi SH della cisteina. Il passaggio da forma ridotta a forma ossidata è, quindi, il modo in cui il glutatione smaltisce i radicali. Tuttavia, il glutatione ossidato va ridotto, altrimenti non potrebbe più funzionare di nuovo. Questa reazione viene compiuta a spese di NADPH ad opera di un enzima chiamato glutatione reduttasi. La glutatione reduttasi, quindi, ricarica il glutatione, in un certo senso.

Altra forma di meccanismo antiradicalico è rappresentato da alcune vitamine, soprattutto la vitamina E e la vitamina C. La vitamina E, per esempio, il tocoferolo, è capace di inattivare i radicali lipidici trasformandoli in lipidi semplici e diventando però essa stessa un radicale: tocoferolo. A questo punto interviene la vitamina C, o acido ascorbico, la quale si carica dell'elettrone in più della vitamina E radicalica, diventando vitamina C radicalica. In realtà, la vitamina C ha una struttura tale da poter creare una forma di risonanza tale da essere bilanciata, nonostante l'elettrone in più, e da non essere considerabile un radicale pericoloso.

Altro sistema è rappresentato da alcuni enzimi. Primo fra tutti, la catalasi dei perossisomi, che, come abbiamo visto, è capace di convertire il perossido d'idrogeno in acqua e molecole d'ossigeno. Poi abbiamo la superossido dismutasi, che è capace di convertire l'anione superossido in perossido e molecola d'ossigeno. La superossido dismutasi contiene al suo interno dei metalli per eseguire la reazione di ossidoriduzione. In base al tipo, abbiamo, quindi, la manganese superossido dismutasi e la rame-zinco superossido dismutasi, che è localizzata nel citoplasma, mentre la prima è localizzata nei mitocondri. Abbiamo, infine, la glutatione perossidasi, che, sfruttando il glutatione, può catalizzare una reazione molto particolare: o a partire dal perossido e da due glutationi ridotti, forma un glutatione ossidato e due molecole d'acqua, oppure a partire da due ioni ossidrili e due glutationi ridotti, forma due molecole d'acqua e un glutatione ossidato. In sintesi, questi sono i principali meccanismi di rimozione dei radicali.

Ma quali sono, invece, i meccanismi di danno dei radicali? Beh, sono parecchi. Il primo è, senza dubbio, la perossidazione lipidica. Parleremo qui di perossidazione lipidica, ma possiamo vedere, ma è semplice immaginare, come questo tipo di meccanismo sia iterabile ovunque esista una certa catena di carboni. Questo meccanismo di perossidazione lipidica, quindi, si verifica anche in modo leggermente diverso per le proteine e per gli acidi nucleici. In questo caso, abbiamo una lunga catena lipidica che interagisce con un radicale ossidrile. Tale radicale, un elettrone spaiato, quindi, tenderà a legare l'idrogeno, il quale tenderà a preferire il legame con l'ossigeno, che è più elettronegativo, lasciando, quindi, il lipide in forma radicalica, con un elettrone spaiato. Tale elettrone spaiato tenderà ad attaccarsi al primo accettore, e il primo accettore, solitamente per elettronegatività, è rappresentato dalla molecola d'ossigeno, che forma, quindi, un complesso con il radicale lipidico. L'elettrone spaiato della molecola d'ossigeno va a legarsi, quindi, all'idrogeno di un altro lipide, diventando un lipide perossidato. Il lipide perossidato, però, avrà lasciato un altro lipide senza un idrogeno e, quindi, con un elettrone spaiato. Per questa ragione, il processo, in teoria, potrebbe andare avanti all'infinito. Quando si blocca questo processo, ci sono tre casi possibili di blocco di questo fenomeno di perossidazione lipidica, che è un meccanismo a catena, come avete visto, e potrebbe iterarsi all'infinito, a meno che due radicali lipidici non interagiscano tra loro, legandosi e formando una nuova molecola, oppure si può avere l'interazione tra due lipidi ossidati con formazione di una molecola d'ossigeno e unione delle due molecole attraverso i due atomi d'ossigeno. Un'ultima possibilità è che il radicale lipidico sia intercettato dalla vitamina E, che diventa radicale, come abbiamo visto prima, ma rende il lipide di nuovo, ma rende il radicale lipidico di nuovo lipide.

Ora, gli effetti di una perossidazione lipidica a catena sono molteplici e tutti sconvenienti da un certo punto di vista. La prima conseguenza che ci viene in mente è il fatto che in questo modo le membrane si disgregano, poiché i lipidi che le formano si rompono. Allo stesso modo, abbiamo visto come la perossidazione a catena possa avvenire anche dove esistano lunghe catene carboniose all'interno delle proteine o all'interno del DNA. In ultima analisi, quindi, un danno da radicali potrebbe portare allo sviluppo di una neoplasia, in quanto un danno di questo tipo a livello genetico può portare alle alterazioni che poi saranno abili del cancro.

Ma vediamo, nella pratica, quali sono le malattie legate principalmente alla formazione di radicali. Andrebbe detto che, in realtà, tutte le malattie hanno una certa componente di danno mediato dai radicali, ma qui vediamo due casi davvero eclatanti. Uno è la protoporfiria eritropoietica, una patologia nella quale la formazione di emoglobina è compromessa perché la protoporfirina 9 di questi soggetti è alterata. La protoporfirina 9 normalmente andrà a legare il ferro, diventando ferro-protoporfirina 9, o gruppo eme dell'emoglobina. Tuttavia, nei soggetti affetti da protoporfiria eritropoietica, la molecola è instabile e bastano le radiazioni solari per indurre la formazione di ossigeno singoletto a livello dei bracci terminali della molecola. L'ossigeno singoletto, quindi, causerà tutta una serie di danni a livello cellulare, lasciando, inoltre, una protoporfirina radicalica. Questi soggetti, quindi, non possono essere esposti al sole, altrimenti i loro globuli rossi vengono distrutti dalla stessa protoporfirina che contengono, per questo diventano anemici. Parallelamente, non possono mangiare cibi che inducano stress radicalico, tra cui l'aglio. Inoltre, nel passato, questi soggetti, a causa delle crisi emolitiche a cui andavano incontro quando si esponevano alla luce, venivano creduti morti, poiché andavano incontro a forme più o meno gravi di shock, ma molto spesso non erano morti, erano semplicemente svenuti, quindi si risvegliavano all'interno delle bare. Questi tre fenomeni sono stati presi e romanzati per creare il mito dei vampiri, per stessa missione dell'autore di Dracula.

Altra malattia che è intimamente legata al danno radicalico è il deficit della glucosio-6-fosfato deidrogenasi. Come detto in precedenza, la glutatione reduttasi ha bisogno di NADPH per funzionare e per riportare, quindi, il glutatione nella sua forma attiva. Ma il NADPH chi glielo fornisce? Un enzima chiamato glucosio-6-fosfato deidrogenasi, che converte il glucosio-6-fosfato in 6-fosfogluconato. Questa via è estremamente importante non solo per la produzione di zuccheri di natura diversa, ma soprattutto per la produzione di NADPH a partire da questa deidrogenazione, poiché è la principale fonte di NADPH a livello cellulare. I soggetti carenti di questo enzima, quindi, avranno grosse difficoltà a attivare la glutatione reduttasi, quindi la protezione dai radicali che normalmente viene offerta dal glutatione in questi soggetti sarà estremamente ridotta, perché non potranno portare il glutatione nella sua forma attiva una volta che questo ha reagito. Per questa ragione, si osserveranno danni soprattutto a livello dei globuli rossi, che risulteranno danneggiati. Si parlerà di cellule a morso di topo, proprio perché il danno radicalico per ossidrompe le membrane. Avranno, inoltre, problemi a livello epatico, soprattutto ittero, poiché l'emoglobina rilasciata dai globuli rossi distrutti viene convertita in bilirubina. E inoltre, non potranno mangiare determinati cibi che aumentano lo stress ossidativo, come ad esempio le fave e, in generale, i legumi. Per questa ragione, questa patologia è chiamata anche favismo.

Parliamo ora di forme un po' più complesse di danno. Il danno ischemico-ipossico è una combinazione di danni che già conosciamo. Si tratta di un danno in cui l'ischemia, cioè l'assenza di flusso ematico, porta il tessuto in una situazione in cui mancano sia l'approvvigionamento di nutrienti, sia l'approvvigionamento di ossigeno. Nel danno ischemico-ipossico, chi ne fa le spese sono soprattutto i mitocondri, i quali andranno a causare, quindi, un aumento della produzione di radicali, poiché rallenterà il flusso dell'ubichinone a livello della membrana, e una deplezione da ATP, poiché il mitocondrio non funzionerà più in maniera efficiente. Dalla deplezione di ATP si osserverà, quindi, una riduzione della capacità della cellula di mantenere l'equilibrio elettrosmotico di membrana, nonché un aumento della glicolisi anaerobia con acidificazione del citoplasma. Avremo, quindi, rigonfiamento cellulare e blocco della sintesi proteica, a cui seguirà, quindi, una rottura della membrana legata al deterioramento delle sue stesse componenti, soprattutto ad opera dei radicali. I frammenti di lipidi che si formeranno in seguito all'azione dei radicali si accumuleranno a formare dei corpi spirali chiamati figure mieliniche. In seguito, la rottura della membrana definitiva porterà alla necrosi cellulare.

Il danno da ischemia-riperfusione è un danno molto particolare che si osserva nel momento in cui un tessuto in grave ischemia viene riperfuso. L'istantanea riperfusione peggiora di tantissimo il danno ischemico, ed è per questa ragione che, quando si riperfonde un organo dopo averlo clampato in chirurgia, sarebbe meglio farlo in maniera graduale. In questa forma di danno, assisteremo, quindi, a una riduzione della funzionalità mitocondriale, che porterà a una forte deplezione di ATP. Tutto l'ATP presente nella cellula verrà, quindi, idrolizzato per cercare di mantenere una certa vitalità e verrà convertito in AMP. L'AMP, però, a sua volta contiene ancora un fosfato, quindi, per azione della nucleotidasi, sarà convertito in adenosina, liberando l'ultimo fosfato e, quindi, cedendo l'ultima parte di energia che può contenere come molecola. Parallelamente, ci sarà un rallentamento del flusso a livello del terzo complesso della respirazione, fenomeno che porterà alla formazione del radicale semichinonico, con conseguente formazione di anione superossido. Tuttavia, finora siamo in una situazione da danno ischemico-ipossico. Tuttavia, cosa accade se di colpo l'ostacolo viene canalizzato e il flusso riprende? Assistiamo a un peggioramento del danno mitocondriale. Inoltre, l'ingresso dei neutrofili, richiamati dai segnali infiammatori prodotti dalle cellule morte, porterà a un danno tissutale ancora più alto. Ed entrambe queste condizioni hanno in comune il fatto che le cellule si dovranno trovare a confrontarsi con un'enorme quantità di radicali. Questo perché l'adenosina, che avevamo lasciato come ultima forma defosforilata dell'ATP, in presenza di ossigeno viene smaltita dall'adenosina deaminasi, che porta alla formazione di inosina. L'inosina passa a ipoxantina attraverso il taglio del ribosio. L'ipoxantina viene convertita, a questo punto, dalla xantina ossidasi in xantina. Però, abbiamo visto come la xantina ossidasi sia molto prona a rilasciare radicali. Infatti, questa reazione porta alla produzione di due molecole di perossido di idrogeno. Ma la xantina passa di nuovo nell'enzima xantina ossidasi con formazione di acido urico, prodotto smaltibile, ma con l'aggiunta di altre due molecole di perossido di idrogeno. La riperfusione ha portato, quindi, la cellula a produrre una quantità molto maggiore di radicali rispetto all'ischemia. Inoltre, come già anticipato, i neutrofili che accorrono, richiamati dai segnali infiammatori, rilasceranno nel tessuto che già è danneggiato una grande quantità di ipoclorito, che essi sono in grado di formare attraverso la reazione tra cloro molecolare e perossido di idrogeno. Anche se questo meccanismo lo approfondiremo meglio quando parleremo di infiammazione, il danno che si osserva nell'ischemia-riperfusione, quindi, induce rotture delle membrane, misfolding e rotture delle proteine, formazione di legami crociati tra i filamenti del DNA, nonché rotture a singolo e doppio filamento e, in ultima analisi, apoptosi.

Chiudiamo il capitolo sul danno cellulare parlando del danno chimico, un danno che è un po' a parte rispetto a tutti gli altri. Il danno chimico può essere diretto o indiretto. Il danno chimico diretto avviene ad opera di tossici che esplicano direttamente la loro azione tossica, mentre il danno chimico indiretto avviene ad opera di sostanze non tossiche che però vengono metabolizzate dal corpo umano, soprattutto nel sistema delle ossidasi a funzione mista del citocromo P450, in metaboliti che si comportano da tossici. Un esempio di danno chimico diretto può essere quello da cloruro di mercurio, che è capace di legarsi e formare degli addotti con la pompa sodio-potassio, bloccandone la funzione e causando, quindi, rigonfiamento cellulare. Il cianuro di potassio, invece, agisce direttamente a livello mitocondriale, dove lega e blocca il quarto complesso della respirazione, complessi col gruppo eme. Il danno da cianuro di potassio avverrà anche a livello della capacità dell'emoglobina di legare l'ossigeno.

Esempi di danno chimico indiretto sono, invece, più complessi. Un esempio può essere dato dal tetracloruro di carbonio, che viene metabolizzato in tricloruro di carbonio radicale, che, quindi, è capace di compiere tutte le azioni negative che i radicali possono effettuare. Un altro esempio è, invece, legato al paracetamolo, farmaco antipiretico, che viene convertito in una forma radicalica, il NAPQI o N-acetil-p-benzochinone imminico. Questo radicale può dare danno epatico fino a un'insufficienza epatica fulminante, e tale effetto comincia ad osservarsi dai 6 g al giorno di paracetamolo. Il modo più semplice per contrastare questa intossicazione è, senza dubbio, la somministrazione di glutatione. Bisogna ricordare, però, che, per fortuna, solo il 5% del paracetamolo viene convertito in questo metabolita, poiché la parte restante viene glucuronata ed espulsa attraverso la bile. Tuttavia, ovviamente, se si aumentano di molto le dosi di paracetamolo, anche la quantità di NAPQI aumenterà fino a essere tossica, e questa soglia può abbassarsi di molto nei soggetti con deficit di glucuronazione.

Con questo concludiamo il discorso sul danno cellulare. Nel prossimo video cominceremo a parlare di morte cellulare e delle sue varie forme.