LEUCEMIAS: DEL HEMOGRAMA AL INMUNOFENOTIPO

Vamos a hablar sobre las leucemias y, específicamente, desde lo que en el laboratorio empezamos como la realización del hemograma, a lo que es el estudio de las leucemias por el inmunofenotipo.

Las leucemias agudas son un grupo heterogéneo de patologías que presentan proliferación de un clon maligno originado de la célula madre hematopoyética, con producción de células inmaduras que pierden la capacidad de diferenciación, que son los llamados blastos. Según la Organización Mundial de la Salud, vamos a diagnosticar la leucemia cuando tenemos en sangre periférica o en médula ósea un porcentaje mayor al 20% de blastos. Además, también existen otros tipos de criterios que ya fueron nombrados en la clase de leucemias.

¿Qué es lo que observamos en el hemograma en las leucemias agudas? Ya de por sí, las leucemias agudas son difíciles de caracterizar en un frotis, tanto de sangre periférica como de médula ósea, porque los blastos son difíciles de diferenciar, porque son células inmaduras indiferenciadas. Si yo estoy observando un frotis de un paciente que está debutando por, o sea, está teniendo por primera vez una leucemia, me va a ser difícil caracterizar en un frotis de sangre periférica si esa célula que yo estoy observando es mieloide o linfoide, porque si recordamos, en las leucemias agudas lo que sucede es una parada en lo que es el normal de las células en la hematopoyesis de progresar hacia una célula más madura. En las leucemias se detiene ese proceso de maduración y se estanca en una etapa de la hematopoyesis donde esas células son inmaduras y es muy difícil de caracterizarla a nivel de lo que es el frotis. Pero hay ciertas características que muchas veces acompañan a las agudas y es lo que a nosotros nos ayuda para continuar el diagnóstico.

Asimismo, también la clínica de estos pacientes es muy característica. Por lo tanto, sumado a lo que es la clínica y los datos de laboratorio, podemos llegar a inferir de que se trata de una leucemia. Las leucemias mieloides agudas y las linfoides agudas van a diferir en su presentación clínica, en la respuesta terapéutica y en su curso. Por lo tanto, cuando yo estoy enfrentando a un paciente con una leucemia mieloide aguda o una leucemia linfoide aguda, lo importante a saber como para lo que es nuestro trabajo como licenciados es que ese hemograma no debe llevar interpretaciones sugestivas. Yo en el hemograma tengo los datos que me da el equipo, que es un contador hematológico y que cuenta células y cuenta lo que puede, porque vamos a ver que en estas leucemias hay ciertas características que se comparten entre todas ellas. Entonces, cuando tenemos un hemograma, yo no le voy a decir al médico, este paciente tiene una leucemia mieloide aguda, nunca voy a darle una interpretación sugestiva de lo que yo estoy viendo.

Lo que sí es importante destacar en ese hemograma y en el frotis que se pueda llegar a observar es la presencia de estas células que van a ser los blastos, que son hallazgos morfológicos característicos de las leucemias mieloides agudas, por ejemplo. Pero hay ciertos hallazgos que tenemos una vez que realizamos el hemograma y tenemos el frotis, que sí nos van a dirigir más bien a lo que es una leucemia mieloide aguda, por ejemplo, y no es otra cosa, como por ejemplo, la presencia de los bastones de Auer, que es lo que se observa en la imagen. Los bastones de Auer son cristales de lisozima. Si se acuerdan, los granulocitos, la serie granulocítica, contiene distintos gránulos y esos gránulos contienen sustancias. Una de ellas son las lisozimas, que cuando funcionan correctamente, lo que hacen es destruir los patógenos con los que estas células entran en contacto. Bueno, entonces lo que sucede en la leucemia mieloide aguda es que estas lisozimas precipitan dentro del citoplasma y se forman estas estructuras características que son los denominados bastones de Auer.

Describir estos hallazgos en la población es ya dirigirnos a lo que es una célula inmadura que nos va a permitir decir el linaje y sugerir pruebas adicionales. La presencia, por lo tanto, la presencia de estos bastones de Auer ya nos están diciendo de que es una célula inmadura y que es un blasto y que lo más probable es que se trate de una leucemia mieloide aguda, porque estas estructuras no aparecen en ninguna otra célula del organismo.

¿Cómo voy a realizar el informe del hemograma de un paciente con un debut de una leucemia aguda? Bueno, lo importante es caracterizar el porcentaje de blastos. Yo debo informar en ese hemograma la cantidad de blastos que presentan, sin discriminar. No necesariamente tengo que decir esto es un mieloblasto, monoblasto, linfoblasto, porque esa célula, como dijimos, no la voy a poder identificar ya de por sí. Pero sí se debe realizar una descripción minuciosa de las características que yo estoy observando en el frotis, que son características morfológicas. Y el término que voy a utilizar es muy importante, porque si ya conocemos que el paciente tiene un historial, es una cosa diferente a cuando yo tengo un paciente por primera vez, ese paciente debuta con una leucemia aguda que viene acompañada, como dijimos, de la clínica. Por lo tanto, es importante describir lo que yo estoy observando al microscopio. Esta descripción generalmente la hace el médico laboratorista o quien esté a cargo del laboratorio, pero muchas veces nos pasa que estas leucemias, como son debut, los pacientes generalmente no están en su casa tranquilos esperando una consulta, sino que estos pacientes son pacientes de emergencia, van a llegar a la emergencia con una clínica muy sugestiva del desarrollo de lo que es una leucemia aguda. Por lo tanto, nos va a llegar al laboratorio en un momento de guardia, por ejemplo, un hemograma de este tipo.

Entonces, cuando nos encontramos ante este tipo de hallazgos, es importante tener a la mano la posible realización del frotis de sangre para poder observar qué es lo que estamos viendo, qué es lo que ese hemograma me está arrojando como resultados, porque según lo que yo observe en el hemograma, me voy a dar cuenta de que esto no es normal. Y es importante describir morfológicamente en el frotis lo que estoy viendo como células de apariencia inmadura, blastos. Muchas veces tendemos a no querer utilizar la palabra blasto porque es como algo que suena muy directo, pero si yo los estoy mirando y el blasto, ¿qué característica principal va a tener? Es que esa célula no es normal. Yo voy a mirar conociendo lo que es normal, voy a poder identificar esa célula que no es normal, pero se puede incluir en el informe el término "probablemente". Probablemente pueden ser de la línea monocítica, de aspecto de monoblastos, de aspecto mieloide, son términos que sí vamos a poder utilizar.

¿Qué vamos a poder encontrar en los debuts de leucemias agudas? Bueno, ya lo hemos comentado, pero vamos a hacer un repaso. La anemia es un hallazgo constante en los pacientes que están debutando con una leucemia aguda. Esta va a ser normocítica, normocrómica, con un grado variable de anisocitosis y poiquilocitosis. La plaquetopenia es otro hallazgo constante que aparece en más del 90% de los casos. Y ya los leucocitos van a variar dependiendo del subtipo de leucemia y de la edad del paciente. En la mayoría de los casos vamos a encontrar leucocitosis en los casos de leucemias, pero también podemos encontrar leucocitos normales o disminuidos. Y en algunos casos sí vamos a poder observar hiperleucocitosis, que es la presencia de más de 100,000 leucocitos por milímetro cúbico. Y esta hiperleucocitosis en estos casos aparece en el momento del diagnóstico.

Entonces, ¿qué tipo de blastos vamos a poder encontrar en las leucemias agudas? Bueno, por un lado tenemos los mieloblastos. Los mieloblastos son células de tamaño variado con una moderada relación nucleocitoplasma, donde el núcleo va a presentar cromatina fina o laxa, como le llamamos muchas veces, con un nucleolo generalmente prominente y con un número bastante variable. El nucleolo es un hallazgo muy característico de las células inmaduras. Yo sé que estoy observando una célula inmadura si esta célula presenta nucleolo y su citoplasma es basófilo. Cuanto más basófilo es el citoplasma, más inmadura es la célula. Y si presenta en su núcleo nucleolos, yo ya sé que estoy observando una célula inmadura y no una célula madura. Como decía, este citoplasma puede tener una tonalidad levemente basofílica o incluso muy basófila. Y vamos a tener en el caso de los mieloblastos, blastos sin gránulos, que son aquellos que llamamos blastos tipo uno, o con granulaciones azurófilas, que son los tipos dos y tres. Si recordamos la maduración de las células en la hematopoyesis, comienza con la generación de lo que son los gránulos azurófilos y los gránulos secundarios, y cuanto más madura la célula, se va perdiendo lo que es la maduración de los gránulos y se sustituye por la maduración del núcleo. Por lo tanto, si yo observo mucha granulación en este tipo de células con estas características que mencionamos antes, también estamos ante la presencia de un blasto. Y como mencionamos también, la presencia de estructuras cristalinas de color rojo en forma de bastón, que son los bastones de Auer, de los mieloblastos de las leucemias, generalmente las tipo 2, la M2, la M3 y la M4. El nucleolo, como se observa en la imagen, es esta depresión que se presenta en el centro o en cualquier parte del núcleo, y se ve como de una coloración mucho más leve de lo que es el núcleo.

¿Qué otro tipo de célula vamos a poder encontrar en las leucemias? Bueno, estamos frente a lo que son los promielocitos, característicos de lo que es la leucemia promielocítica aguda. Los promielocitos también, obviamente, los vamos a encontrar en médula ósea, en el estadío normal de su diferenciación, pero cuando los encontramos en mucha cantidad en médula y a su vez pasaron a lo que es la sangre periférica, ahí estamos ante lo que es una proliferación. Como recordamos, estas células que estamos nombrando, lo que son los blastos y lo que son los promielocitos en este caso, su maduración sucede en médula. Nosotros en sangre periférica no deberíamos tener ningún tipo de estadío anterior a lo que es el neutrófilo. Podemos encontrar a veces en determinadas patologías infecciosas elementos inmaduros, pero esos son transitorios, no van a perdurar en sangre periférica cuando se trata el foco inicial de la presencia de esas células. Entonces, ¿qué vamos a encontrar en sangre periférica? Es un desplazamiento de lo que son las células normales que va a ser ocupada por estas células inmaduras que allí en sangre periférica no deberían estar.

Entonces, los promielocitos van a ser células con baja o moderada relación nucleocitoplasma, con una cromatina condensada, con nucleolos o sombras, como se observan ahí. Lo que observamos es una sombra dentro de lo que es el núcleo de la célula. Presentan su citoplasma innumerables gránulos azurófilos que van a ser muy marcados. Como se observa en la imagen, la célula es mucho más grande, se observan, si prestamos atención, una tonalidad diferente en lo que son los gránulos, unos que son un poco más violetas y otros que son un poco más claros. Ahí estamos ante la presencia de azurófilos y gránulos secundarios. Hay una zona perinuclear en el promielocito que es de un color mucho más claro, que es la ubicación del aparato de Golgi. El núcleo va a ser excéntrico, o sea, va a estar ubicado sobre uno de los extremos de la célula. Y estas células las vamos a encontrar en lo que son las leucemias promielocíticas hipogranulares y las hipergranulares, células que van a ser, van a tener poca granulación en el citoplasma, como observan estas dos juntas acá, y aquellas que van a tener mucha granulación en el citoplasma, como es esta.

Otros blastos que vamos a encontrar son los monoblastos. Los monoblastos son blastos grandes con moderada a alta relación núcleo citoplasma y van a presentar una cromatina laxa, bien delicada. Como se observa, como decíamos, la cromatina, cuando la célula madura, esa cromatina se va a condensar más y cuando hacemos la tinción, vamos a observar en las células maduras generalmente la tinción más intensa, a diferencia de las células inmaduras que van a presentar esta característica como que si tuviera grumos dentro de lo que es el núcleo, y es lo que llamamos cromatina laxa. Los nucleolos en los monoblastos van a ser bien distinguibles, como se observan acá, dos nucleolos en esta célula. El citoplasma puede ser discretamente basófilo a grisáceo, con finos y a veces imperceptibles gránulos en su interior, gránulos azurófilos. Los monoblastos son característicos de la leucemia M5A y B y de la M4.

Los linfoblastos. Los linfoblastos vamos a encontrar de diferentes tamaños dependiendo del subtipo de leucemia, que van desde pequeños a grandes. La relación núcleo citoplasma también puede ser variable, que puede ser de moderada a alta. La cromatina generalmente es laxa, núcleos variados. Algunas tienen, otros no, o no se perciben en realidad, pero sí son células inmaduras y los presentan. Y el aspecto de citoplasma también puede ser variado, puede ser una basofilia moderada o una intensa basofilia. Acá se observa este linfoblasto que es un poco más grande de lo que son más chicos, pero se observa bien claro lo que es la presencia de los nucleolos en estos también. Y muchas veces los blastos, los blastos que son más chicos o incluso aquellos que son más grandes, tienen una característica es que se empiezan a agrupar unos a otros, se empiezan a pegar cuando hacemos el frotis. Pero eso no es porque la célula se pegue. Ahí es cuando hacemos el frotis de sangre periférica, lo que hacemos es un desplazamiento de las células desde donde está la gota que realizamos el frotis hacia delante cuando hacemos la extensión. Entonces, esas células empiezan a pegar unas con otras, pero es un hallazgo característico en lo que son, hay tanta cantidad de células que esas células aparecen pegadas unas a las otras, como se observa acá. Estas células, el citoplasma es bien intenso, bien basófilo, bien azul, casi violeta. Acá se observa un citoplasma bien azul, también basófilo, y este tiene una intensidad un poco menor. Pero esas son tres características que sí diferencian a los blastos: la basofilia, la presencia de nucleolos, la cromatina laxa y el citoplasma con estas características que dijimos.

En resumen, ¿qué es importante? Es diferenciar los blastos de las células normales. Cuáles son las características de los blastos y qué es una célula normal. Eso es importante para lo que es nuestro trabajo diario en lo que es el laboratorio de hematología y la citometría.

Cuando tenemos un hemograma con más de 100,000 leucocitos, lo más probable es que estamos ante un caso de una neoplasia proliferativa. Cuando el número de leucocitos está elevado y se trata de una leucemia, los blastos van a estar siempre presentes. Pero va a depender de la variante, de la edad, de si la leucemia es primaria o secundaria a una mielodisplasia, de la quimioterapia. No es lo mismo observar un frotis de un paciente que está debutando en ese momento y que no ha recibido ningún tratamiento, que aquel hemograma de un paciente que ya está en quimioterapia. Vamos a tener un historial de ese paciente y vamos a ver los cambios que suceden al correr del tiempo mientras se instaura el tratamiento. Tanto el número de leucocitos como de blastos vamos a ver diferenciado en todos estos procesos, en todo este progresar de lo que es la enfermedad, desde el momento en el que es diagnosticada hasta el momento en el que nosotros informamos al médico que estamos ante un caso de leucemia y se inicia un tratamiento en el paciente.

Entonces, ¿para qué nos va a servir el inmunofenotipo en las leucemias agudas? Bueno, lo importante es conocer, que ya lo dimos en la parte de lo que es la hematopoyesis, pero solo para ver un pantallazo general de lo que es la hematopoyesis. ¿Se acuerdan que partimos de lo que es una célula madre hematopoyética que tiene capacidad de autorrenovación hasta que esta célula, por distintos mecanismos en la médula ósea, se va a activar y esta célula va a comenzar un proceso de diferenciación hacia los distintos linajes dentro de lo que es la hematopoyesis? Vamos a tener las células comprometidas ya para linaje, que aquellas que van a ser las células que van a dar formación a lo que es el linaje mieloide, aquello que es el linaje linfoide, y dentro de lo que es mieloide, vamos a tener lo que son la serie roja, la serie plaquetaria y la serie granulocítica. Y en el caso de lo que es linfoide, vamos a tener lo que es la formación de los linfocitos y sus distintos tipos de células.

Vamos a repasar un poquito lo que es esta célula hematopoyética. Esta se va a ubicar principalmente en la médula ósea, en un sector de la médula que se denomina nicho endotelial. Esta va a interactuar de manera importante con todo el microambiente medular y vamos a tener células que son de soporte, células principalmente de origen mesenquimal, células que van a estar activando a la célula madre hematopoyética, su proliferación y su autorrenovación. Por otro lado, vamos a tener células que permitan la liberación de factores autócrinos o paracrinos que van a hacer que esta célula entre en fase más proliferativa, y vamos a tener células como los adipocitos que van a inhibir la proliferación de la célula madre hematopoyética. Esto es importante, pues es necesario que sepamos identificarla. Ella va a tener un fenotipo característico que se le conoce por un marcador característico que es el CD34. Tenemos ausencia del CD38, ya que es una célula que no ha tomado una decisión, entre comillas, de compromiso de linaje y es aún una célula indiferenciada. Va a tener ausencia de CD45RA y dos marcadores que nos van a permitir también identificarlo, que son el CD90 y el CD49F.

Una vez que la célula madre hematopoyética, debido a la interacción con determinadas citoquinas, interleuquinas y el microambiente medular, es capaz de tomar un compromiso de linaje y aquí adquiere ciertos marcadores de linaje como es el CD38. El fenotipo característico de la célula madre hematopoyética va a ser CD34 positiva, CD38 negativa, CD45RA negativa, CD90 y CD49F. Todo esto de los CD lo vamos a ver ahora con la explicación de lo que es la citometría de flujo, que es para lo que vemos esta clase. Es importante y es una ayuda para lo que es el diagnóstico dentro del laboratorio. Porque, ¿qué significan estos CD? Estos CD son expresiones a nivel de lo que es la membrana o el citoplasma de las células de determinadas moléculas. Y nosotros cada molécula corresponde a una estructura de lo que es dentro o fuera, en contacto con el ambiente, marcadores específicos de lo que es en esta célula. Entonces, en el laboratorio, la citometría de flujo nos va a permitir utilizar anticuerpos anti estas estructuras que presenta la célula, que cada una va a tener un número diferente, como vemos acá, CD34, CD38. Esas estructuras nos van a permitir a nosotros en el laboratorio identificarlas a través de lo que es la citometría de flujo marcada con anticuerpos monoclonales.

Conocemos la hematopoyesis normal. Pues ahora, ¿cómo se producen estas neoplasias? Que en este caso vamos a tomar como ejemplo las neoplasias mieloides. Esta imagen pretende hacer una simulación en la cual vamos a imaginar que estos círculos son stem cells hematopoyéticas que en algún momento adquirieron una mutación de expansión hematopoyética y esta mutación hace que esta célula tenga cierta capacidad de proliferar mayor a la capacidad de sus hermanas que no tienen esta mutación. En general, estas células podrían llamarse como preneoplásicas y hay ciertas mutaciones o alteraciones que van a provocar, por ejemplo, que la capacidad de expansión de estas células nos deje algún tipo de hematopoyesis ineficiente, llevando a algún tipo de citopenia periférica. Entonces podemos tener pacientes con citopenias que no conocemos su significado, que no es necesariamente una mielodisplasia, y por otro lado, tenemos una proliferación celular que no podemos darle el nombre o subtipo. Esto es lo que podría llamarse la presencia de esta mutación nos puede hacer aparecer otro tipo de mutación. Vemos la primera mutación que sucede en las células, que es esa que lleva a la posibilidad de que este tipo de pacientes lleguen a sufrir una citopenia. ¿Por qué? Porque esta expansión clonal provoca el desplazamiento de células desde lo que es sangre periférica a nivel de médula. Y la afectación de la médula por esta proliferación descontrolada que recién está comenzando provoca que la médula no responda correctamente y empiecen a aparecer las citopenias como las observamos en las leucemias agudas: la anemia, la trombocitopenia.

La presencia de una mutación nos puede hacer aparecer otro tipo de mutación, que es la que nosotros denominamos las mutaciones drivers o iniciadoras, que es esa ahí que está con el puntito amarillo. La segunda mutación hizo que estas células que tenían la primera mutación ya tuvieran una capacidad de proliferación o de alteración mayor. Y aquí entramos en lo que denominamos, dentro de la evolución clonal de las neoplasias mieloides, las fases crónicas, donde encontramos las neoplasias mieloproliferativas y las mielodisplásicas. Por ejemplo, la leucemia mieloide crónica. No hay una mutación inicial y aparece una segunda mutación que hace que esta célula prolifere también de manera descontrolada. Ahora sabemos que el hecho de que exista una mutación genética, en este caso ya hay dos mutaciones genéticas o alteraciones genéticas, provocan lo que se llama inestabilidad génica, lo que aumenta la probabilidad de que aparezca otra mutación. Y si aparece una tercera, como esta que está acá, de color rosado, puede constituir lo que llamamos una asociación a la progresión, que después nos puede llevar a una fase acelerada de estas enfermedades crónicas para después adquirir esta otra de color verde, que ya es otra mutación, por ejemplo, la FLT3, transformando lo que se llama una transformando esta patología en lo que denominamos la leucemia mieloide aguda.

Toda enfermedad, en este caso oncológica, viene de una alteración preexistente que puede o no haber sido evidenciada, pero son evoluciones clonales. Ya lo conocemos en el mieloma múltiple, que todo mieloma múltiple proviene de una gamapatía monoclonal de significado incierto. También se describe en algunas patologías linfoides que vienen de linfocitosis monoclonal de significado incierto. Y también sabemos que las neoplasias mieloides tienen su inicio, muchas veces no pesquisado, de mutaciones genéticas que en general no son capaces de generar una leucemia propiamente dicha o una enfermedad mieloproliferativa o mielodisplasia, pero sí nos predispone a la aparición de otras mutaciones, en este caso iniciadoras, para luego entrar en el lecho oncológico y llegar a mutaciones asociadas a progresión.

¿Por qué es importante entender esto? Porque la leucemia mieloide es el estadío final de un proceso proliferativo que tal vez fue tan rápido que no pudimos pesquisarlo a tiempo, que apareció, debutó como leucemia mieloide, y que dentro de la leucemia mieloide también podemos tener evoluciones clonales. El concepto de que la leucemia es una enfermedad clonal es un concepto antiguo. Podemos tener múltiples clones y múltiples leucemias dentro de una misma leucemia. Por eso es tan difícil el tratamiento y por eso tendemos, los pacientes tienden a recaídas muchas veces fenotípicamente distintas.

Entonces, ¿para qué nos va a servir el inmunofenotipo y de dónde sale el término inmunofenotipo? Bueno, el inmunofenotipo deriva de lo que son las pruebas citoquímicas. Actualmente hay algunas pruebas citoquímicas que se siguen utilizando. Hay otras que ya no tanto, más bien para investigación y no tanto para la clínica, porque son bastante engorrosas y que llevan tiempo a realizarlas. Y actualmente contamos con metodologías como es la citometría de flujo, que es la que nos va a ayudar a nosotros en el diagnóstico. Por lo tanto, el inmunofenotipo deriva de lo que es la inmunocitoquímica y, por otro lado, el inmunofenotipo lo vamos a realizar a través de lo que es la citometría de flujo.

Con el paso de los años, la tecnología en la citometría de flujo, con sus múltiples aplicaciones, ha tenido un impacto enorme en lo que es la comprensión de la biología celular, la inmunología y la ontogenia hematopoyética, permitiendo la aplicación de esta tecnología en lo que es la medicina actual. El principio fundamental de la citometría de flujo está ligado a la habilidad para analizar múltiples características de una célula aislada en una población heterogénea en poco tiempo. El término heterogéneo es muy importante, ya que hay muchas situaciones clínicas en las que no está nada claro si una proliferación celular es reactiva o no, o si es neoplásica esta proliferación. Además, estas poblaciones no están aisladas, sino que están en el entorno de otros tipos celulares. Son muy variadas las patologías que sufren las células en los distintos compartimientos corporales, y la correlación clínica-patológica constituye la esencia de este diagnóstico exacto. Sería poco prudente ignorar las características de estas células, ¿no?

Los equipos de citometría de flujo pueden analizar miles de células por segundo. Estas células en suspensión atraviesan un haz de luz, por lo general es un láser en una sola línea, y las señales generadas se relacionan con el tamaño de la célula, su complejidad y su granularidad, permitiendo al equipo identificar diferentes poblaciones celulares dependiendo de estas características. Hay un amplio rango de aplicaciones para la citometría, pero actualmente en la hematología constituye una herramienta importante para la identificación de alteraciones hematológicas en un amplio rango de muestras biológicas, como son sangre periférica, médula, líquido cefalorraquídeo y en distintos derrames serosos.

El citómetro de flujo generalmente presenta tres componentes principales: el sistema fluídico, la presentación de la muestra al láser que constituye el sistema óptico, la recolección de información a partir de la luz dispersada durante el análisis, el sistema electrónico o computarizado y la conversión de esas señales ópticas a digitales para poder visualizarlas. El objetivo del sistema fluídico es presentar células o partículas en suspensión al punto de transducción del láser, el punto donde las células atraviesan la luz láser una célula a la vez. Esto se consigue por un proceso conocido como enfoque hidrodinámico. El fluido con la muestra es inyectado en la cámara de flujo dentro de un fluido más rápido conocido como fluido envolvente, usualmente una solución buffer fosfato salino. Las diferencias de presión y velocidad y densidad de ambos fluidos evitan que se mezclen estas células. Y la cámara de flujo está diseñada para que en el punto de transducción láser las dos corrientes sean sometidas a presión, llevando la solución con la muestra en el centro del fluido envolvente, forzando las células a colocarse en una sola fila antes de atravesar el láser. La presión sobre la muestra es siempre mayor que la ejercida alrededor de ella. Es fundamental que la aplicación que se esté usando emplee la velocidad de flujo correcta, porque esto nos va a permitir que se puedan conseguir las mediciones con mayor rapidez y que realmente pueda identificarse los distintos tipos celulares.

El sistema óptico del citómetro comprende una óptica de lo que es la estimulación y la recolección. La óptica de estimulación está compuesta por el láser con lentes de enfoque y prismas, mientras que la de recolección está compuesta por lentes, espejos y filtros que concentran la luz dispersada y la dirigen a sensores ópticos específicos. El punto de intercepción de la luz láser y las células debe ser constante, por lo que el láser se mantiene en una posición fija. A medida que la célula atraviesa el punto de interrogación, la luz del láser se dispersa progresivamente en ángulos de 90 grados. La cantidad de luz dispersada depende de las propiedades físicas de la célula, tales como lo que es el tamaño, la complejidad del núcleo y la granularidad del citoplasma. Estas señales de luz dispersas son recogidas por detectores específicos, digitalizadas y finalmente presentadas en gráficos de puntos para ser analizadas.

La luz difractada en ángulos estrechos para el láser es conocida como luz dispersada frontalmente o FSC por las siglas en inglés, o dispersión de luz en ángulo frontal. La cantidad de luz dispersada frontalmente es proporcional al área de la célula. Esta luz es captada por un detector alineado con el haz láser al lado opuesto del fluido con la muestra. Algo de luz atravesará la membrana celular y será refractada y reflejada por los organelos del citoplasma o núcleo celular. Esta luz es captada por un fotodiodo colocado en un ángulo aproximadamente de 90 grados en relación al haz de láser como luz dispersa lateral o SSC, por lo que es la sigla en inglés, scatter. La luz dispersa lateral es proporcional a la granularidad o complejidad interna de la célula. Por lo tanto, vamos a tener una luz dispersada frontal que va a ser proporcional a lo que es el tamaño de la célula y una luz dispersada lateral que nos va a hablar de lo que es la granularidad y la complejidad interna de la célula. Y eso lo vamos a ver en los gráficos de dispersión juntos. Lo que es la FSC, que es la luz frontal, y el scatter lateral proporcionan información sobre las propiedades físicas de las células, permitiendo la diferenciación de células dentro de una población heterogénea. Por ejemplo, cuando hacemos la diferenciación de leucocitos.

La citometría de flujo también se basa en lo que denominamos fluorescencia, usando fluoróforos o fluorocromos. Y cuando este no está siendo excitado por un haz de luz a determinada longitud de onda, se encuentra en un estado basal. Cuando llega el haz de luz, el fluoróforo absorbe fotones y emite fotones también, donde lo que emite es una longitud de onda diferente a la que recibe, y esto ocurre muy rápido. Cuando se detiene ese haz, el fósforo vuelve a su estado original basal. Las señales de luz dispersa frontal y lateral son emitidas en una longitud de onda generalmente de unos 488 nanómetros y son del mismo color de luz láser. Estas señales, por tanto, pueden ser determinadas sin la necesidad de una investigación especializada en fluorescencia. Para determinar las propiedades bioquímicas específicas de una célula, se utilizan colorantes que pueden fijarse directamente a la célula o lo que denominamos el fluorocromo o fluoróforo unido a ligandos, por ejemplo, anticuerpos monoclonales. Los colorantes o fluoróforos son activados por la luz a una longitud de onda característica para esa molécula. Ella absorberá la luz, acumulando energía, lo que provoca la estimulación de los electrones dentro de la molécula y al regresar a su estado basal no estimulado, este exceso de energía es liberado como fotones generando fluorescencia. El rango de longitudes de onda en las que un fluoróforo absorbe luz y es excitado es conocido como longitud de onda de excitación o de absorción, y el rango de longitud de onda de la luz emitida es denominado longitud de onda de emisión. El rango de longitud de onda de emisión será mayor que el rango de longitud de onda de absorción. Esta diferencia se conoce como desplazamiento de Stokes. Como la luz láser es de una longitud de onda fija, es fundamental que los fluorocromos o las tinciones que vayan a ser usadas tengan longitudes de onda de excitación compatibles con el citómetro de flujo.

Este citómetro de flujo va a constar con un sistema electrónico que convierte las señales de luz en datos numéricos para ser analizados. Como la luz impacta a los fotodetectores, los fotones que ingresan son convertidos a electrones generándose una corriente. Esta corriente atraviesa un amplificador y se genera un pulso de voltaje que es proporcional al número de fotones detectados. El pulso del voltaje es creado tan rápido al momento en que la célula o partícula pasa a través del láser, alcanzando su punto más alto cuando la célula o partícula está dentro del haz de luz. Son usados dos tipos de fotodetectores denominados fotodiodos y fotomultiplicadores. Los fotodiodos son menos eficientes, con sensibilidad menor que los fotomultiplicadores y por lo general son usados para captar la luz dispersada progresiva que genera una señal fuerte. Los tubos fotomultiplicadores son más eficientes y se usan para recolectar las señales de luz dispersa lateral y fluorescente. Las señales amplificadas deben ser digitalizadas antes de que puedan ser mostradas en la computadora para su análisis. El conversor analógico a digital genera un valor numérico para la altura, ancho y área del pulso al cual se asigna un número de canal. Este número es transferido a la computadora y es mostrado como un punto en un gráfico de análisis. Las señales pueden ser aplicadas lineal o logarítmicamente para su estudio.

Por lo tanto, nosotros podemos aplicar lo que es la citometría de flujo a la utilización de la identificación de los tipos celulares para detectar y etiquetar las poblaciones específicas de células a través de anticuerpos monoclonales acoplados a fluorocromos. Estos anticuerpos monoclonales se van a unir a antígenos específicos de la célula de interés y están unidos a fluorocromos de manera covalente, el cual, al ser excitado por el láser, emite luz fluorescente que después va a ser directamente proporcional a lo que es el tamaño de la célula y el tipo de célula que estamos identificando. Y cada uno de estos fluorocromos va a tener una determinada longitud de onda.

Cosas que tenemos que tener en consideración cuando estamos analizando muestras de posibles leucemias es considerar que las células malignas frecuentemente conservan antígenos asociados con la célula normal a partir de la cual fueron derivados. ¿Qué nos va a facilitar? La identificación y cuantificación de poblaciones celulares en una muestra. Lo que es la citometría de flujo nos va a ayudar en esto: en la identificación y cuantificación de poblaciones celulares en la muestra, la diferenciación de lo que son las células normales de las anormales, la diferenciación de células reactivas de neoplasia, la identificación del estado de maduración de una población celular y la cuantificación de la infiltración de un tumor.

La interpretación de los datos requiere de conocimientos muy fijos en lo que es leucemias, el conocimiento de las características físicas y antigénicas, de la expresión de las células normales, la habilidad de distinguir distintos patrones de expresión antigénica, habilidad de identificar expresión antigénica aberrante e identificar un inmunofenotipo robusto asociado a lo que es la leucemia.

¿Qué ventajas tiene el inmunofenotipo por citometría de flujo? Es que incrementa la precisión para diferenciar neoplasias hematológicas por la combinación de los datos usados por los anticuerpos. Identifica la línea celular involucrada y su estado madurativo. Requiere bajo volumen de muestra. Generalmente incluye de entre 8 a 10 anticuerpos por tubo. Vamos a ver que cuando estamos estudiando las leucemias, van a haber distintos tubos para utilizar, que estos tubos vienen ya preparados por un fabricante y se va a mezclar la muestra en este tubo. Y este es el que va a ser estudiado en el citómetro. Y es importante en las muestras pediátricas cuando hablamos de líquido cefalorraquídeo y médula ósea. Posee costo-efectividad. Vamos a ver que el costo de esto generalmente es muy alto, pero tiene una efectividad muy alta también. Incrementa la eficiencia e incrementa la sensibilidad para el monitoreo de la enfermedad residual medible. Una vez que la enfermedad es tratable y es tratada, nosotros vamos a medir el progreso de esta enfermedad a través de la cuantificación de la enfermedad residual medible.

Entonces, ¿cómo vamos a visualizar los datos en el citómetro? Una vez que a las señales se les ha asignado los números de canal, la computadora procesa y recopila esos valores. Los datos guardados son almacenados en un formato estándar y los archivos pueden ser mostrados en varias formas dependiendo del software de análisis y reanalizados una y otra vez.

Entonces, ¿qué vamos a ver? Hay dos tipos de gráficos en citometría de flujo: los histogramas y los dot plot o gráfico de puntos. El histograma representa una dimensión única y es usado para mostrar un solo parámetro. El eje Y muestra el número de eventos contados y el eje X muestra la intensidad de fluorescencia de lo que estamos investigando. Entonces, estos histogramas, como se muestran en la imagen, es un canal en particular de un fluorocromo versus el número de eventos asociados, como se observa acá, número de eventos, o sea, número de cantidad. Si hablamos de eventos, es cantidad de lo que estamos contando, y intensidad de fluorescencia en el otro eje, en el eje X y el eje Y. Esto genera un gráfico en un eje.

El dot plot o gráfico de puntos es un gráfico de dos ejes porque muestra dos canales distintos. En la imagen dice CD8 FITC y CD4 PE. ¿Qué significa esto? Que en el tubo de prueba se utilizaron dos anticuerpos, por lo menos un anticuerpo anti CD8 y otro anti CD4 para detectar ambos, que son moléculas del clúster de diferenciación, cada uno de ellos conjugado con un fluorocromo o fluoróforo con patrones de fluorescencia distintos. El dot plot muestra agrupaciones denominadas poblaciones celulares. Cuanto más a la derecha se encuentra la gráfica, mayor es la intensidad de fluorescencia emitida luego de la señal original. Entonces, cada vez que vamos hacia la derecha, es mayor la fluorescencia emitida, y lo mismo pasa al revés. Cuanto más arriba está, es mayor la fluorescencia emitida.

Cuando hablamos de, vamos a ver que muchas veces cuando observamos un resultado de inmunofenotipo, nos dice un CD, que es el clúster de diferenciación de la célula, que nos dice positivo o negativo. ¿Qué queremos decir? Que es positivo porque contiene el marcaje que se busca y negativo que no lo tiene. Los gráficos además nos dicen qué cantidad de células tenemos en cada sector del gráfico de puntos nos está indicando que tiene tanta cantidad de células en cada sector de la gráfica. Por ejemplo, acá observamos un histograma en el cual tiene para se utiliza para estudios de poblaciones celulares. Generalmente este estudio de poblaciones celulares tiene un punto de corte que es el que a mí me va a poder permitir diferenciar de lo que es positivo de lo que es negativo. Entonces, acá por ejemplo nos muestra este histograma en los que hay una población de células que es negativa. El punto de corte que me va a decir, me va a separar lo que es positivo o de negativo. Entonces, todas aquellas células que se encuentran del lado derecho son positivas, del lado derecho de lo que es el punto de corte. Y todas aquellas que se encuentran del lado izquierdo en el histograma del punto de corte son células negativas para el marcador que estoy utilizando.

Lo mismo sucede en el gráfico de puntos. El gráfico de puntos me utiliza un punto de corte para lo que es el marcador que se está utilizando en el eje X y el marcador que se está utilizando en el eje Y. Todas las células que se encuentran por debajo de este punto de corte para el marcador en el eje X son negativas, y todas aquellas que se encuentran a la izquierda son positivas. Lo mismo para el otro marcador. Todas aquellas que se encuentran a la izquierda van a ser positivas para el marcador en el eje X y positivas para el marcador en el eje X. Ah, ¿cómo se observa acá en la parte superior izquierda? Es una señal negativa para el eje X y a su vez positiva para el eje Y. En la parte baja,

una señal negativa para el eje X y para el eje Y, para los dos. el punto de corte, ¿no?

Por encima de la derecha, señal positiva para ambos ejes y por debajo señal positiva para el X y a su vez negativa para el y.

Un ejemplo específico de este gráfico, por ejemplo, nos está diciendo que acá utilizamos el CD3 y el CD19. nos está diciendo que es negativa para CD3 y CD19 y es positiva. El en el este es el bajo, el e el bajo a la derecha es positivo para CD3 y negativo para CD19. En en el superior a la izquierda es negativo para CD3 y positivo para C19. Y e por debajo a la derecha es positivo para CD3 y para CD19.

Y simplemente observamos las longitudes de onda de excitación y de emisión de distintos florósforos fluoccromos que utilizamos. Eh, uno de los más utilizados es el isoto de fluoreceína, la ficeritrina, la proteína peridina clorofila, eh Alexafluors, eh, que es una marca registrada, Alexofluor 7147 e Aloficen, el Cinianina, el Pacific Blue, entre otros, el Sian.

Estos florósforos se pueden conjugar con los que son los anticuerpos. Cada uno de ellos se conjuga con un anticuerpo y estos mismos van a entrar en contacto con la muestra que vamos a analizar, se van a mezclar porque cada anticuerpo va a tener afinidad por un marcador en la superficie de la célula, por eso decimos cláster de diferenciación. Cada uno de los anticuerpos que nosotros vamos a utilizar es anti un factor de la célula. Entonces, se va a pegar con el anticuerpo a ese antígeno de forma covalente y no va a poder ser eh separado, ¿no?

Esta muestra a su vez se procede a una a un lavado y luego de ese lavado, como es una unión covalente, ese anticuerpo va a quedar pegado a la superficie o al interior de la un marcador que está en el citoplasma de la célula y no va a poder ser lavado después de este procedimiento y después va a ser pasado por el citómetro de flujo y va a poder eh este e este láser va a excitar ese fluorocromo que está pegado al anticuerpo y que a su vez se pegó al antígeno. ¿no? Y nos va a poder decir si está presente o no, cuántas células presentan esta unión y cuántas no. Y es lo que observamos en los gráfico de puntos por fluorescencia.

Entonces, las poblaciones leucocitarias por citometría de flujo ah es recomendado la utilización combinada de eh antis 45 y el scat, el side cut, que es la complejidad interna de las células. En este ejemplo, lo que observamos es eso, ¿no? La el primer gráfico que yo voy a que yo voy a obtener es el eh gráfico de el marcador CD45 unido a lo que es el anticuerpo antic fluorocromo y el side catter que nos muestra que los linfocitos en este caso en promedio tendrían más CD45 por células que otros. Los blastos poseen CD45, pero en menor cantidad, y los blastos poseen eh menor complejidad interna que los neutrófilos, pero similar al linfocito.

Entonces, cuando eh vieron la clase de hemograma, vieron que el también es lo mismo, es la misma tecnología, solo que en este caso utiliza fluorescencia y en el otro simplemente dispersión de luz. Acá utilizamos un marcador pegado a lo que es el fluorocromo que se va a unir a las células y cada una de estas células se va a unir a este marcador. Entonces, según el punto de corte vamos a poder identificar las eh células, ¿no?

Entonces, si tenemos el punto de corte para lo que son las células, vamos a encontrar que tienen una complejidad mucho más grande las células que se encuentran más arriba, como son los granulocitos, y aquellas que tienen eh mayor gránulos eh también por encima, porque es la la el side scatter que me habla de la complejidad interna y los gránulos de esas células. Los granulocitos siempre se van a ubicar hacia arriba porque son los que son más complejos internamente y van a estar más abajo las células que son complejas en menos cantidad.

Cómo utilizamos en este en este tubo que mezclamos con la muestra y el fluocromo el marcador anti CD45 CD45? La muestra eh nos muestra que los linfocitos en promedio contendrían tendrían más CD45 por célula que otros, como encontramos eh aquí abajo. Los linfocitos tienen CD45, es una célula normal, es un marcador normal de identificación del linfocito. Están hacia la izquierda de el punto de corte que es este.

Entonces, eh los blastos también poseen CD45, pero en menor cantidad. Ah, como se acuerdan que cuando usábamos el gráfico de puntos lo dividíamos en los cuatro cuadrantes. Todos aquellos que están por debajo son positivos para el marcador que estoy utilizando y todos aquellos que están por encima van a ser negativos para el punto de corte de que estamos utilizando.

Los blastos poseen menor complejidad interna que los neutrófilos, por eso están abajo, pero similar a lo que es los linfocitos y los monocitos. Por eso cuando eh hacemos un hemograma, muchas veces los blastos por su complejidad interna se encuentran a la misma altura de los monocitos y linfocitos. Y el equipo, el el contador hematológico, los identifica por eso los identifica como monocitos o linfocitos, pero a su vez como tiene un punto de corte de decir esto es monocito o linfocito, me va eh muchas veces aparecer una alarma de presencia de blastos y eso a mí me va a llevar al estudio más profundo de la muestra.

Entonces, ¿cuáles son las poblaciones normales que encontramos en sangre y médula ósea? Por un lado tenemos las células progenitoras hematopoyéticas. Las células madre hematopoyéticas normales son CD34 positivas. En médula ósea, en estado estacionario, la fracción total de CD34 positivas incluye células madre hematopoyéticas que van a ser células progenitoras tempranas no comprometidas que pueden girar múltiples líneas celulares. Los mielomonocitos, aquellas células que van a ser de linaje eritroide y precursores de células B. Otros antígenos expresados por la célula madre hematopoyética no comprometida incluye el HLR y CD13. A medida que la población de células madre hematopoyéticas se diferencia, adquiere la capacidad de expresión de CD38, que es un marcador de activación.

Las poblaciones normales de precursores celulares en la médula pueden causar confusión en el diagnóstico y monitoreo de las leucemias agudas. Esto es en gran parte porque comparten con los blastos leucémicos muchos antígenos de inmadurez, así como similitudes morfológicas. Por ejemplo, podemos decir que las células e dentro de todos los que son las células C34 positivas corresponden solo a un 1 a 2% del total de células medulares. Una de las diferencias más notables es que los blastos leucémicos de forma eh usual son mucho más numerosos que los precursores normales, como decíamos e recién. Por lo general, las células progenitoras de muestras de médula en estado estable en poca cantidad. Estas, como decíamos, las células CD34 positivas no representan más del 1 al 2% del total de células medulares.

Un antígeno que se expresa con mayor presencia que CD34 es el antígeno CD 117 que se e presenta en células progenitoras mieloid que está en un porcentaje de entre 2 a 4%. Aproximadamente el 25 de las% de las células CD34 positivas son también CD 117 positivas. El CD45, un antígeno panleuncoitario, o sea, que lo presenta todos los leucocitos, es en general expresado en forma atenuada en células medulares precursoras, incluyendo mieloblastos, monoblastos, precursores de célula B y eritroblastos.

Otro marcador e muy importante es el CD13, que es un marcador precursor e que se observa en eh precozmente en las células mieloides y pueden ser definidas en la médula normal como las siguientes poblaciones precursoras. Cuando una célula presenta el patrón CD 34 positivo, CD 117 positivo, CD45 positivo y CD13 positivo, esta población define una población precursora mieloide monocosítica, normal. Pero cuando tenemos el patrón CD34 positivo, CD 117 negativo, CD45 positivo y CD13 negativo, define una población precursora de células B. normales.

Con respecto a la maduración mieloide, así como está presente en células madre pluripotenciales, el CD34 permanece activado y mantiene su expresividad por progenitores de linfocitos y granulocitos monocitos, pero disminuye rápidamente su intensidad en las diferen eh en las e diferentes eh progresiones posteriores en el linaje junto a HLADR se perderá a medida que los mieloblastos normales maduren a promielocitos. El CD 117 o también llamado sequit receptor es entonces expresado por encima de CD34, incluyendo los promiocitos y se pierde solo cuando la célula madura eh prolifera hacia etapa de mielocito. En consecuencia, el CD 117 entonces retrata una población mieloide mayor y ligeramente más madura que el CD34. Y es un distintivo de células madre maduras, aunque ellas son muy escasas en médula normal, como mencionamos.

Durante la maduración también ocurren variaciones en la intensidad del antígeno. Por ejemplo, la expresión del CD13 y CD33 en mieloblastos aumenta progresivamente su intensidad hasta la fase promielocito y aún durante esta fase. Los últimos antígenos en aparecer durante las fases mielocito neutrófilo incluyen CD15, el cual aparece por primera vez en la fase promielocíptica tardía y CD11B. CD16 y CD10 son expresados a partir de la fase metamelocito y en las formas banda. Los neutróns y los maduros tienen un fenotipo CD45 positivo, CD3C positivo, CD3 positivo, CD1B positivo, CD 15 positivo y CD1 positivo.

¿Se acuerdan que mencionamos que cuando hablamos de estos marcadores CD y cada uno de los números corresponde a como nosotros lo observamos en el gráfico de citometría, aquellos que se encuentran por encima del valor de corte designado para esa población son catalogados como positivos y aquellos que están por debajo de ese punto de corte son caracterizados como negativos.

Una característica también de estas e células es que puede ocurrir la expresión del CD64 el mieloblastos tempranos, pero desaparece más allá de esta fase. Puede ocurrir reespresión de CD64 por neutrófilos activados, lo que podría indicar sepsis. El CD64 generalmente marca la e la expresión, es una expresión que aparece en los en la línea monocítica y no granulocítica, pero también lo podemos encontrar en los mieloblastos.

La maduración de monocitos sigue un curso similar. Los monoblastos muy tempranos son CD34 positivos y CD 117 positivos. muy parecidos también los blastos normales. Ambos disminuyen y desaparecen con la evolución a una fase promonocítica. El HLR, HLADR, al contrario de la situación con la maduración granulocítica, durante la cual desaparece en la etapa promielocito, mantiene expresividad a lo largo de la maduración monocítica. Diferencias posteriores incluyen la adquisición de CD4 en la etapa pro monocito, seguido muy cerca por CD64 y CD11C. El CD14 aumenta la intensidad de su expresión en la etapa de monocito maduro. Los CD4, CD64 y CD14 son en consecuencia marcadores útiles para identificar poblaciones de linaje monocítico. Y otro marcador que también aparece en esta serie es el CD15, que es expresado en ambos en neutrófilos y en monocitos.

La maduración eh eritroide, los eritroblastos primivos tienen un fenotipo precursor precoz temprano genérico que corresponde a CD34 positivo, CD 117 positivo, CD45 positivo y CD38 positivo. Al igual que en otras líneas celulares, estos marcadores de inmadurez se pierden rápidamente durante la maduración, desde la fase de prolitroblasto hasta la etapa de eritroblastovasófila y se establece la expresión de CD71 y CD235A que corresponde a clicoforina. La expresión de CD36 y CD45 de las formas tardías se pierde progresivamente, pero CD71, que es el receptor de transferrina, es detectable en muchas células activamente proliferativas, que este este CD es un marcador de activación y no es específica para un linaje. La expresión máxima en la serie de este marcador se de 71. desaparece cuando los reticulocitos se transforman en eritrocitos maduros.

Con respecto a la maduración de meacarocitos, estos se desarrollan a partir del fenotipo percursor mieloide genérico, al igual que los anteriores, con la desaparición progresiva de los marcadores precursores. En tanto se adquieren los específicos para líneas celulares como son CD41, CD42 y CD61. Las plaquetas mantienen la expresión de estos antígenos, pero son CD45 negativos. El CD41, CD42 y CD61 son los que conocemos como eh las glicoproteínas de superficie de la plaqueta.

Las células en corresponde a la maduración linfoide. Las células B primarias son producidas en la médula en donde también ocurren las primeras fases de maduración. Los patrones de expresión antigénica de las células B en maduración e han sido detallados múltiples veces. Mientras ocurre eh este proceso fisiológico, pueden eh observarse fases particulares de expresión antigénica y estas pueden ser correlacionadas ampliamente con las fases de detención en la maduración, por ejemplo, de eh que sucede en la leucemía agudo. Las células B maduras en circulación expresan CD19, CD20 y CD79A e inmunoglobulinas de superficie. Estas células B son fácilmente separables de los precursores de células B primarios identificados en médula, los cuales son CD34 positivos, TDT positivos, CD10 positivos, CD19 positivos, CD22 positivos, CD79B positivos, CD20 negativos. En eh estas células no hay inmunoglobulinas citoplasmáticas o de superficie, lo que sucede lo contrario en las células B maduras.

Entonces, el desarrollo de las células e que no ocurren médulas, sino que inicialmente dentro del timo, como es en el caso de los linfocitos T, sucede de manera similar a las células B. se guarda semejanza con muchos de los estadíos de la célula T y a su vez comparado con la proliferación en las leucemías linfoblásticas de tipo T. El receptor de células T es reorganizado de manera progresiva y finalmente se expresa sobre la superficie celular en un complejo con CD3 de superficie. La mayoría de las células T circulantes expresan un receptor que contiene cadenas denominadas alfa y beta, que es el TCR alfa beta. Pero se describe mejor lo que son la maduración linfoidb porque la mayoría de los casos tanto de leucemia linfoblástica linfocítica crónica y leucemía linfoblástica aguda corresponden linaje B.

Para ver más detalladamente esto con algunas imágenes, lo que conocemos clásicamente y arbitrariamente y por morfología como la maduración de la línea del neutrófilo con estos generalmente lo conocemos con estos seis estadíos donde vamos a tener el mieloblasto, promielocito, mielocito, metamiocito, callado banda y neutrófilo. y cada uno va a tener distinta expresión de ciertos marcadores o de ciertos fenotipos. Ahora, si nosotros entendemos que esta división es arbitraria, también deberíamos entender que la expresión de un solo marcador per sé o de un grupo de marcadores no necesariamente se traduce en la célula exacta que yo estoy mirando.

A modo de ejemplo, nosotros por mi definición sabemos que el mieloblasto va perdiendo la expresión de CD34 o se está dejando o está dejando de ser una célula hematopoyética indiferenciada. y está entrando a hacer un linaje específico como es la línea de neutrófilos. Todos los progenitores, precursores y células maduras de neutrófilos expresan de manera intensa o menos intensa la mieloperoxidaz. Sabemos que la Organización Mundial de la Salud nos pone a la mieloperoxidasa como un marcador propio de línea mieloide en específico de línea de neutrófilis. sabiendo que los gránulos primarios donde se ubica la mieloperoxidasa la expresan más intensamente en los promelocitos y después en los melocitos se comienza a perder porque acuérdense que después ya no viene la proliferación de gránulo, sino que viene la división celular por la e la división celular y más bien a nivel del núcleo. Por lo tanto, empiezan a caer a la mitad la presencia de gránulos primarios, por lo tanto, la mioperoxidasa tiende a caer. Yo podría aprenderme de memoria el estadiaje de cada una de estas células, pero el fenotipo de las células va cambiando. Las células van adquiriendo o van perdiendo distintas expresiones proteicas, ya sean de membrana o intracelulares, de manera continua, siendo las divisiones totalmente arbitrarias. Entre mieloblasto y promielócito, yo puedo poner 10, 20, 30, 40, 50 estadíos distintos.

Porque si nosotros vamos viendo, por ejemplo, la expresión de CD13, en este caso, eh esto es un grafo, un gráfico madurativo que e que muestra que se ha hecho una simulación como si en neutrófilo tuviera 20 estadios madurativos y no seis como eh como sabemos vemos cómo se van expresando los distintos marcadores dependiendo del estadío de neutrófilo, siendo hacia la izquierda más inmaduro y a la derecha más maduro. Entonces, imagínense la expresión de CD13, como se va perdiendo de manera continua y posteriormente se va ganando nuevamente en las series más maduras.

Entonces, conocer el fenotipo que tiene un mieloblasto o un promielocito es muy importante porque desde el punto de vista teórico tenemos que armar de alguna manera el conocimiento y asociar lo que uno ve en la práctica clínica con lo que vemos en el frotis y con lo que estamos viendo en el fenotip. Sin embargo, nosotros tenemos que entender que las herramientas computacionales e informáticas nos han mostrado de manera más profunda lo que sucede en realidad.

Ahora, si este proceso es continuo, yo voy a necesitar de muchas variables computacionales que me ayuden a hacer estos análisis, dado que voy a tener que conocer no solo la expresión de los marcadores, sino también la intensidad de expresión. No es lo mismo, por ejemplo, un mieloblasto que expresa CD 117 en e en esta magnitud que se encuentra entre 10 elevado a la 3 o 10 elevado a la 4, o sea, entre 1000 y 10,000 de intensidad de fluorescencia a un mismo mieloblasto que va a tener una intensidad de fluorescencia de 10 elevado a la 5, mucho más arriba. No es lo mismo este mieloblasto que encontramos un poco más abajo que este que está en la en la parte superior de la gráfica. Entonces va eh a pasar ahí.

Entonces, ¿qué va a pasar ahí? Yo voy a a decir si es un mieloblasto porque expresa CD 117, pero tiene que haber alguna herramienta que me diga que esa expresión de CD 117 es mayor a lo que deberíamos tener normally. Y es por eso que el grupo Euroflor tomó la decisión de, además de estandarizar la técnica, que conozcamos profundamente la expresión normal y generemos bases de datos que nos permitan comparar, siguiendo patrones estrictos de estandarización de las técnicas, la población a estar comparada con un conjunto de datos normales para saber si realmente corresponde anormal o anormal, más allá de la subjetividad de la persona que está mirando É, como vamos a ver un poquito más adelante, este grupo Euroflor, Euroflow es el que desarrolla los tubos que utilizamos para el procesamiento de las muestras por inmuno fenotipo y citometría de flujo.

Si nosotros analizamos con los paneles clásicos de Euroflor, la maduración de neutrófilos, aquí tenemos la expresión de distintos marcadores. Esto no está separado en los seis, sino que son continuos celulares. Vemos entonces con este eh con el color lila, los neutrófilos más maduros. Vemos que los neutrófilos siguen un patrón madurativo que es bien característico. Por ejemplo, los neutrófilos van ganando de alguna más de alguna forma más complejidad y adquiriendo CD45 y van perdiendo HLR en las formas más precursoras y a su vez manteniendo CD 117. como marcador e y por eso usamos el CD 117 como marcador de neoplasia mieloide y después cuando ya comienza a adquirir patrones madurativos más avanzados probablemente pasando la etapa de mielocito comienza a perder la expresión de CD 117 o seit y generando este patrón e clásico madurativo de pérdida de HLADR para después perder CD 117.

En el caso del análisis de CD13 con CD11, vemos que las células comienzan siendo muy intensas para CD13, pero no tienen CD11B, que es un marcador de madurez celular. comienzan a perder CD13. ¿Se acuerdan lo que veíamos en el gráfico? Adquieren CD11B y posteriormente vuelven a ganar CD13. Todo este flujo en no las células comienzan a ser CD13 positivas, pero CD11 negativas y luego pasan al revés, ¿no? Vuelven a ganar CD3. Lo mismo vemos en el gráfico de CD64 con el CD 35, en el cual vemos que las células más inmaduras son CD64 negativas, CD64 positivas, perdón. También sacando el mito de que el CD64 es exclusivo de las de la línea monocitoide, cuando los neutrófilos más inmaduros tienen también expresan CD64, pero después vemos que mientras madura va adquiriendo CD35 y pierde CD64.

Acá vamos a analizar la expresión de distintos marcadores. Esto es, sí, lo veo de manera cuantitativa con medianas y desviaciones estándar de la intensidad de fluorescencia. Vemos la expresión de los distintos marcadores mientras ocurre la maduración de neutrófilo. Aquí tenemos un N de 20 estadios distintos. Vemos el fenotipo oscilatorio de CD13, ¿no? Que comienza siempre alto, baja y vuelve a aumentar al final. Vemos cómo se gana a e CD16 más menos similar al CD11B y vemos como la célula más madura expresa CD10 ya en la etapa más de banda como como el CIT o CD17 se pierde de manera más precoz en los precursores más inmaduros y no se vuelve a ganar nunca más. Por lo tanto, vemos que tenemos herramientas que nos apoyan al conocimiento de este tipo normal de neutrófilos. Lo veíamos en la gráfica, pero esto es una forma muy e clara de ver cómo cambia la expresión de estos marcadores. Que decíamos CD13 comienza a hacer madura muy tempranamente, luego baja y luego a aumentar. El C17 se gana, pero luego se pierde y no vuelve a aumentar. El CD11B aumenta. Y el CD10 también empieza abajo y aumenta al final en la maduración.

Ahora vamos a analizar los monocitos. Se puede hacer exactamente lo mismo. En morfología nos enseñan que hay tres tipos, el monoblasto, el promonocito y el monocito. Eh, y hay marcadores que son propios de la línea monocitoide como son el CD38, el CD33, muy intenso el CD64 y en forma un poco más maduras tenemos al CD14. Ya en formas eh maduras tenemos el Irm 2 o CD300E. En la maduración del monocito vemos que se cumplen de alguna forma también patrones que son continuos, que se van ganando en el tiempo y que esta división de los tres subgrupos también es arbitraria.

¿De qué sirve conocer las formas madurativas? Sirve porque si yo analizo y conozco los patrones madurativos de las distintas series, lo llevo a variables matemáticas, lo pongo en una base de datos, lo puedo comparar con mi caso y ver realmente si tengo alteraciones madurativas. Por ejemplo, nos fijamos en este en este ejemplo que es bastante interesante. Y vemos el gráfico entre CD14 y CD 35. Vemos que los que están en rojo, que podrían ser precursores o monoblastos e más precursores eh monocíticos y los azules ser promonocitos. Fíjense que hay un estadillo en el que están todos mezclados, en la cual uno no puede diferenciar de alguna forma eh qué es lo que estoy viendo. E por qué no existe esa diferenciación, porque es un continuo de ganar y perder eh distintos fenotipos. Por eso es que e podemos podemos decir que la morfología es la cara y el fenotipo son las intenciones de las células. Lo que está mostrando el fenotipo realmente son las proteínas que se están expresando y es realmente el estadio celular que estamos viendo. Por eso si miramos morfología, podemos encontrar que estas células más inmaduras son bastante parecidas a aquellas que van avanzando en el tiempo, pero en un momento se juntan todas y yo no puedo decir realmente por morfología que es un monoblasto CD17 y que el siguiente es un CD17 que lo perdió, sino que e lo voy a ver solo por morfología, va a tener la misma morfología, pero cuando hago el inmunofenotipo veo que existe esta progresión hacia lo que es la célula madura. Entonces, en este lugar intermedio tengo células que tienen un marcaje totalmente distinto a estas que están en un estadio anterior y que por morfología no lo podía ver.

Volviendo a lo que es la técnica de inmunenotipos. Después de ver lo que observamos en en lo que es normal en sangre periférica y en médula, eh vemos que una vez que procesamos la muestra, obteníamos aquellos gráficos de diferenciación y uno de los términos usados en citometría es el llamado gating o tipificación, que se refiere a la habilidad de agislar poblaciones específicas dentro de una muestra heterogénea. En tanto que los citómetros de flujo son capaces de analizar miles de células por segundo, la tipificación permite que el análisis se limite a una subpoblación celular sin tener que aislarla antes del procedimiento.

En este ejemplo, lo que vemos en este gráfico es todos los leucocitos, ¿no? Como se observa lo que es la el primer gráfico que vamos a tener, que es el CD45, ya que el CD45 está presente en todos los leucocitos. Observamos la población de leucocitos totales, pero nos interesa específicamente lo que es los linfocitos. Aquí va lo que denominamos e son todos los eventos que se observan por sitometría de flujo, pero para e para poder identificar o e realmente cuantificar una población específica es que se realiza el gain en esta limpieza de los eventos que no son de interés para el análisis eh que queremos hacer. Entonces, esto incluye los restos celulares y otros tipos celulares.

El gating con marcadores específicos como el CD19, como se ve en este caso, me va a diferenciar los linfocitos específicamente. Entonces, tenemos por un lado los linfocitos B marcados con CD eh son CD19 positivos y CD3 negativos. Y los linfocitootes al revés son CD19 negativos. eh y CD3 positivos. La población de linfocitos B, a su vez con marcaje para lo que son las cadenas de livianas de inmunoglobulinas, las podemos también diferenciar. Marcamos específicamente a los linfocitos B con marcadores de cadenas livianas y podemos ver la maduración del linfocito B. Cuando también queremos cuantificar los linfocitos T citotóxicos, también se pueden utilizar marcadores específicos. Lo mismo también para los linfocitos T.

Entonces, esto que es lo que nos permite es una discriminación en base a lo que es la dispersión de la luz. Esto fue descripto por primera vez en 1990 cuando se marcó a todas las células con CD45 y después eh se fue discriminando cada uno de estos eh tipos celulares. Entonces, ¿qué nos interesa a nosotros? Es realmente conocer los tipos celulares a los que estamos enfrentados.

Entonces hablamos de un término que es la jerarquía de eventos. Es el resultado del gating o la tipificación de todos los eventos que muestran de qué poblaciones derivan nuestros eventos de interés. Eh, ejemplo, en base a los gráficos de análisis leucocitarios podemos observar las subpoblaciones linfocitarias. Si tenemos todos los eventos, vamos a tener que el citrómetro de flujo calcula el porcentaje de eventos, teniendo en cuenta que la población padre es el 100%. No, si tenemos el total de eventos, vamos a tener marcado con e color rosado ahí los monocitos que son CD45 positivos, los neutrófilos son CD45 positivos y los linfocitos son CD45 positivos porque todos los linfocitos son todos los leucocitos son CD4 positivos. Pero vamos a ver cómo se disponen en la gráfica según el escáter lateral o la complejidad en distintas a distintas alturas. Los granulocitos van a estar más arriba, los monocitos un poco más abajo y los linfocitos más abajo, porque todos son CD45 positivos, pero tienen un escáter o una complejidad interna de eh distinta magnitud. Los linfocitos son menos eh complejos que los granulocitos y las células que se ubican más allá de los granulocitos o sinófilos, basófilos y células inmaduras.

Podemos encontrar también, como veíamos en e en la maduración de lo que son los linfocitos, teníamos todos los eventos y esto nos permite a nosotros diferenciar eh aquellos que son monucleares, aquellos que son linfocitos, en el caso específicamente de linfocitos, los linfocitos B, poder identificar a través del gating las eh la diferenciación A linfocito B y a su vez La diferenciación si expresan en cadenas livianas lambda o cabenas livianas k y si los linfocitos T son CD4 positivos o CD8 positivos. Todo parte de lo que son todos los eventos que son todas las células que tengo en mi muestra. Y al al yo querer diferenciar cada una de ellas, siempre voy a utilizar marcadores específicos de las series. Todos esos marcadores que veíamos anteriormente, en lo que veo normal, los utilizo yo para diferenciar cada uno de ellos. Por eso es que hablamos de jerarquía. Tenemos una población total que incluye a todos y después vamos diferenciando el tipo celular que yo quiero ver.

La adquisición de estos eventos se refiere a la cantidad de eventos o células que se adquieren por lectura. El número de eventos de adquisición le entregará mayor o menor sensibilidad a la detección. Por ejemplo, para desórdenes linfoproliferativos, 50,000 eventos en el gate determinado como linfocito. Esto quiere decir que yo voy a identificar distintos tipos de células y cuando esto supera los 50,000 1 eventos, ya puedo decir que me encuentro ante una situación e proliferativa, o sea, menor a 50,000 eventos. Yo podría llamarlo como eh una muestra que es normal, pero si tiene más de 50,000 eventos mi eh mi inmunofenotip, mi citometría. Eh, esto quiere decir que estoy ante un desorden linfoproliferativo para enfermedad residual eh mínima medible entre 500,000 y 1 billón de eventos eh totales. O sea, todo aquello que esté por encima de un millón me está hablando de que no hay una recuperación, sino que esto sigue proliferando. Y si encuentro 500,000 y 1 millón, podría decir que estamos en un e en una buena progresión de lo que es la medición de la enfermedad mínima hasta que entengamos cero, ¿no?

Por cada célula deía, el citómetro de flujo le asigna un valor proporcional al tamaño, la FCC y complejidad interna, ¿no? escáter lateral y distintos canales de fluorescencia. Este ejemplo de inmuno fenotip muestra la separación de las células por el marcaje con CD45 y a su vez el total de células por tamaño y complejidad interna. En el ejemplo A vemos lo que es normal en médula ósea, o sea, el side cuttered y el tamaño y e las células marcadas con CD45 y la complejidad interna. Tenemos todos los leucocitos marcados con CD45, que como habíamos dicho, todos los leucocitos son CD45 positivos y los eritrocitos son CD45 negativos.

A diferencia de esta población, este ejemplo, el ejemplo B, que es una leucemia mieloide aguda. También tenemos en este caso células por tamaño y complejidad. Vemos que hay células que son de de pequeño tamaño, pero tienen poca complejidad. Ya no tenemos tanto lo que son eh las células más maduras, los granulocitos, por ejemplo, que nos encontraríamos más arriba. Vemos que todo se ha desplazado acá y que ha aparecido, como mencionamos en algún momento, el desplazamiento de toda esta serie, que es normal, a lo que es células que son mucho más pequeñas, pero que a su vez también tienen e una complejidad mucho menor. y aquellas que son marcadas con CD45, tenemos que también se ha desplazado todo lo que es normal de granulocitos y se ha concentrado en una zona específica que podemos reconocer como blastos en el e en el marcaje con CD45. Está bueno después hacer un gatin, por ejemplo, de esta población de blastos. diferenciamos y hacemos un marcaje de solo esta serie de blastos y podemos hacerlo de cada uno de ellos. Hacemos el gating y para cada una de los marcadores vemos qué marcadores están expresando estos blastos para poder diferenciar si se trata de de qué tipo de leucemia se eh trata.

Como mencioné anteriormente, ¿cuáles son los marcadores inmunológicos que utilizamos para leucemia? Existe en eh diversos organismos que han creado paneles distintos de anticuerpos por tubo para el estudio de las leucemias, pero uno de los referentes mundiales es el consorcio Euroflor. Euroflor es una división de la fundación europea para científica de laboratorio de hematooncología y esta este consorcio ha desarrollado protocolos con ocho fluoccromos por tubo. Entonces, vamos a tener todos estos tipos de tubos dependiendo de el dato clínico que yo tenga. Yo tengo un dato clínico que a mí me llega al laboratorio de una probable tipo de leucemia que ella se evidencia por la clínica, es una orientación. Eh, entonces cuando tengo un paciente al que se le sospecha una leucemia aguda, por ejemplo, se va a usar este tubo. Si es un screening linfoide, se va a usar este, ¿no? Si sospechan de un desorden de las células plasmáticas, se va a usar otro panel. Eh, así no célula leucemia aguda aguda mieloide si es un mielodiplásico, ¿no? Para cada una de las patologías dentro de lo que son las leucemias y síndromes proliferativos, tenemos distintos tubos que vamos a utilizar al mezclarlo con la muestra para poder hacer el la citometría de flujo e inmunofenotipo de ese paciente.

Por ejemplo, acá tenemos uno de los paneles que es el alot, que es el tubo de orientación en leucemías agudas. Y e este tubo tiene el fluoróforo y el anticuerpo anti el marcador de superficie. Detecta la mayoría de las leucemas agudas clásicas. Entonces tenemos en este tubo ocho eh marcadores, ¿no? El CD3 citoplasmático, el CD45, ¿se acuerdan? CD45 presente todas las células. Mieloperoxidaza citoplasmática presente en la línea mieloide neutrófilo CD79A citoplasmático. CD34 no CD CD34 Cummadura, CD19 CD7 y CD3 eh de superficie de membrana. Entonces, cada uno de estos eh manticuerpos anti está marcado con un fluoróforo que al entrar en el citómetro, el citómetro lo va a excitar y va a decirme si tiene o no presencia de alguno de estos marcadores.

Entonces, ¿qué es lo que eh voy a poder evidenciar? ¿Qué es lo que significan estos marcadores? Al tener presencia de uno u otro, según los criterios diagnósticos para cada uno de los tipos de leucemias, yo sé que voy a estar ante un tipo X de leucemia. Entonces, eh ¿qué qué no qué es lo que nos indica, por ejemplo, esto? Si eh presenta un marcador de inmadurez, que es el CD34, y el marcador común de leucocitos, que es el CD45, por ejemplo, si estamos ante un linaje B, lo que se va a marcar es el CD19 y el CD e citoplasmático, CD79A citoplasmático. Si se trata de en línea GT, voy a tener CD3 y CD7 positivos. Y si se trata de línea GMLide, además de CD34, CD45, voy a tener citoplasmático, eh mioperoxidasa citoplasmático. Y si estoy ante un linaje T y e un marcador de madurez es el CD3 de membrana. Entonces, esto es lo que nos indica, eso, ¿no? Parto de lo que es eh los marcadores de inmadurez que si están presentes y si cada uno de estos marcadores está presente me dirige directamente hacia el linaje que quiero eh identificar.

Entonces, habíamos visto por un lado lo que sucedía de forma normal con respecto a la serie mieloide. Vamos a a ver un poquito lo que es la linfogénesis y cómo se genera este linfocito B. En médula ósea vamos a partir hablando de la de esto lo que es la linf génesis y cómo se genera el linfocito B. Y vamos a partir con las definiciones clásicas donde subdividimos a los progenitores y precursores en distintos estadíos. Estos distintos estadíos tienen el problema de que son arbitrarios y nosotros tenemos que saber que la maduración y diferenciación de las células es un continuo. Por lo tanto, yo podría subdividir en n cantidad de sub e subtipos, digamos, precursores, eh dependiendo de la expresión fenotípica, sabiendo que la ganancia o la pérdida de marcadores es un continuo. Esto no significa que uno sea positivo y el otro se negativiza, sino que en el camino se van positivizando y negativizando. Pero desde el punto de vista académico lo vamos a ver de una manera más directa y separada para que quede más claro.

En la médula ósea vamos a tener principalmente cinco tipos distintos de linfocitos B, de los cuales los últimos dos ya son capaces de salir a sangre periférica. vemos eh de hecho si nosotros vemos el análisis de sangre periférica, vemos que aproximadamente un 2,5% de todas las células sanguíneas son linfocitos B y dentro del desglose de los linfocitos B tenemos que un 5,4% corresponden a los linfocitos inmaduros y que son e linfocitos B que tienen ciertas características como la persistencia del CD10 y del CD38 y la predilección por la inmunoglobulina m de membrana. Este porcentaje puede aumentar en los pacientes que tienen poca exposición antigénica, sobre todo en personas que viven en países más desarrollados, en la cual durante su niñez tuvieron menos exposición a bacterias, virus o parásitos y también está aumentado en pacientes con enfermedades autoinmunes.

La gran mayoría de nuestros linfocitos en sangre periférica son los linfocitos naiv o vírgenes de exposición antigénica que corresponde a más del 60% de los casos. El 31% corresponden lo que nosotros llamamos los linfocitos de memoria, que son linfocitos que se expusieron a nuevo antígeno y fueron capaces de reconocerlo y quedan en ciertos zonas linfoides secundarios esperando la exposición nuevamente al antígeno y generar transformación a células plasmáticas y células generadoras de anticuerpos. Lo que denominamos plasmoblasto, eh, plasmocito, son generalmente 2,1% de todas las células circulantes. La mayoría de los linfocitos que tenemos en sangre periférica son los denominados na o vírgenes, un 64%. Los siguientes en cantidad son los de memoria.

El progenitor B que tomó la decisión de comprometerse al linaje B, CD34 positivo y TDT, expresión de CD22, las células prevenígenos propios del linaje, expresión muy alta de CD10, CD34. Eh, aún tiene TDT. Tenemos algún tipo de generación de hebras nuevas de ADN. Esto quiere decir la presencia de TDT. CD19 comienza a perder CD10 y gana CD20 marcador de linfocitos maduros y ya empieza a expresar marcadores de inmunoglobulinas. Empieza a perder CD10 ya muy bajo y ya empieza a expresar inmunoglobulinas de membrana, generalmente IgM.

En la médula ósea vamos a partir con lo que nosotros llamamos el progenitor B, tal vez la primer célula dentro de la médula ósea, progenitor B, que tomó la decisión de diferenciarse o de comprometerse a un linaje que es el linaje B. Esta célula en general posee ciertos marcadores que son de inmadurez como el CD34. Posee una enzima que es la enzima TDT que va a ser muy importante tanto para la linfogénesis B como para la T y tiene que ver con la generación de hebras de ADN. La expresión de CD22, la presencia de CD19 en estas células en generales es débil o incluso puede ser negativo al igual que CD10.

Una vez que la célula tomó la decisión de comprometerse a este linaje, es lo que nosotros denominamos célula pr1, ¿no? que lo tenemos aquí en la gráfica, lo que antiguamente se conocía como linfocito B común, que es una célula que ya tiene marcadores propios de linfocito B, como es el CD19, que podemos verlo en la gráfica de arriba a la izquierda como esta célula en color mostaza no está marcada con CD19, la cual tiene expresión muy alta de CD10. tiene expresión todavía de CD34, tiene la presencia de CD 38, tiene muy débil la presencia de CD45 y aún tiene TDT la eh presencia que lo que significa es que tenemos algún tipo de generación de hebras nuevas de ADN. Y estas células mientras van madurando comienzan a sufrir ciertos fenómenos que son es que pierden un poco de CD10 y comienzan a ganar el CD20. Sabemos que el CD20 es un marcador del linfocito B maduro. Persiste CD19 y el CD22, que son marcadores propios de linfocitos B, CD38, que es un marcador de célula que está más diferenciada o compromiso de linaje.

Entonces, si nosotros vamos siguiendo este proceso, vemos que esta célula va adquiriendo CD20, manteniendo todavía la expresión de CD10 y comienza la ganancia de una inmunogloburina intracitoplasmática. Y esto va a ser muy importante porque ya tenemos alguna formación de lo que viene a ser el linfocito B generador de inmunoglobulinas. Ya tenemos dentro del citoplasma proteínas de inmunoglobulina. Cuando ya la célula está teniendo una característica más de célula inmadura, la célula inmadura ya tiene persistencia de CD10 que comienza a perderlo de una manera. Tiene CD20 intenso, mantiene el CD2 y el CD 38 y empieza a ganar CD45. Comienza la expresión de inmunoglobulina de superficie del citoplasma salta a la superficie para expresar Igmana y es principalmente IGM porque es cuando la célula es donde pierde la expresión de CD10 y CD38 y tiene la expresión de Igm e IGD que son las principales inmunoglobulinas. Y e estas son las curvas clásicas que nosotros vemos y sobre todo si vemos esta en sangre periférica la e la segunda gráfica a acá a la derecha, este verde que vimos acá en médula en la primera gráfica, se puede ver en sangre periférica. Lo que se observa acá se eh que

Son linfocitos CD20 bien intensos, pero todavía tienen algo de CD10 o algo de CD38, mientras que las células más naiv, más vírgenes, pierden la expresión de CD10. No, no se van en la gráfica de celeste azul. Algo similar, eh, con estos distintos marcadores.

Y acá vemos también como estas células, aquí tenemos la expresión de eh 38 intensamente. Es interesante como siempre está presente el 38 hasta la célula naiv, ya la célula lo va perdiendo. CD38 en la célula inmadura, pero ya en la célula que es e virgen, el CD38 se pierde. No tenemos en madura, pero ese 38 es negativo en la célula madura.

Entonces, el análisis del compartimiento CD34. Tenemos que un 23% de las células presentes en médula corresponden a células CD34 positivas y la mayoría, e, en este caso, un 23% corresponden a linfocitos B con e presencia de TDT, CD79A y CD19 como inmunofenotipo característico.

En el caso de eh la célula B o T, la diferencia se ve en los receptores BCR en la célula B y TCR en la célula T. Acompaña estos receptores eh moléculas accesorias. Por ejemplo, junto con el receptor de la célula B tenemos el complejo CD19, que está relacionado con la traducción de señales desde el interior de la célula hacia el exterior. Otro es el CD21. En el caso de la célula T, hay otro complejo que lo define, que es el CD3, también relacionado con la traducción de señales. Y este aparece en el linfocito maduro. Antes está en el interior de la célula y no se expresa en la membrana.

Marcadores de inmadurez, que ya lo vimos más o menos en lo que es el desarrollo del linfocito B: CD19, CD43, CD20 e CD10, perdón, positivos. El CD10 es conocido como con el término CALA, que es el antígeno común de leucemia linfoblástica aguda. Entonces, si el C10 está presente, podemos estar ante un cuadro de leucemia linfoblástica aguda.

Otro elemento es la aparición de inmunoglobulinas de superficie, como dijimos, específicamente las cadenas de inmunoglobulinas en la superficie de la célula B. Y e por un lado, la identificación de distintos marcadores a nivel del linfocito B y la mieloperoxidasa en los e en los mieloblastos, que al teñirlo con mieloperoxidasa se observa este precipitado de color azul en el citoplasma, que quiere decir que estas células presentan mieloperoxidasa en su citoplasma.

Otro de los tubos que se pueden utilizar para la identificación de las leucemias es el que me permite diferenciar las células e CD8 o en el caso de las leucemias de tipo T y las leucemias del linaje B. En el caso de e de estos anticuerpos se utilizan dos anticuerpos conjugados con el mismo fósforo.

La interpretación de gráfico depende exclusivamente del gating y del otro marcador utilizado. Entonces, cada vez que voy a hacer un marcador de estos, voy a hacer un gating para aislar específicamente la población que quiero ver y ver qué marcadores tiene esa población. Entonces, vamos a tener células que están marcadas cada una con estos e distintos eh anticuerpos monoclonales. Y e el anti-8, por ejemplo, correspondería solo al análisis de clonas del linfocito T. Y el anti eh inmunoglobulinas de membrana capa, en el caso lambda, perdón, correspondería solo al análisis de las clonas del linfocito B.

Acá simplemente es un cuadro que eh me muestra los distintos marcadores que puedo observar eh que puedo utilizar como diagnóstico de las leucemias, ¿no? Los eh los tubos múltiples para las combinaciones de síndrome mielodisplásicos y leucemias agudas mieloides. Eh, cada tubo contiene cada uno de estos anticuerpos marcados con el e fluoróforo. Y después de hacer la citometría, voy a ver si están presentes o no. Y me permite hacer el diagnóstico de los distintos tipos de leucemias.

En la leucemia linfoblástica aguda, por ejemplo, el inmunofenotipo por citometría de flujo es importante determinar la estirpe B o T y la etapa de maduración. La la muestra puede ser sangre periférica o médula. Y los anticuerpos que se van a utilizar son los que ya estuvimos mencionando eh ahora.

Entonces, nos queda la pregunta de que ¿qué elementos dan a entender que es una clona T o clona B? Es simplemente eh saber qué es lo que queremos encontrar en las T o en las B. ¿Se acuerdan que las células B presentan inmunoglobulinas de superficie y las células T no? Que nos ayuda a interpretar que la clona maligna es un precursor linfoide. Entonces, vamos a utilizar específicamente el marcador de precursor linfoide que, como ya mencionamos, en están en la lista de eh que es lo que observamos normalmente. Si en una sospecha de leucemia tenemos un marcador presente de precursor linfoide, lo vamos a tener en una cantidad que corresponde a lo que el citómetro me está indicando. Que al superar ese límite de de células que yo debería tener de forma normal, ya podría hablar de clones.

La confirmación de las leucemias linfoides agudas. Eh, se recomienda el inmunofenotipo por citometría de flujo con los distintos marcadores, la citogenética para eh para cuantificar realmente las distintas alteraciones numéricas o estructurales, por ejemplo, las distintas traslocaciones que también me pueden hacer diagnósticos de leucemia aguda. Y estudios de biología molecular para la detección de traslocaciones cromosómicas específicas. Y a su vez e me va a permitir estratificar los pacientes por factores de riesgo para definir tratamiento y pronóstico.

En la leucemia promielocítica, la inmunotipificación va a incluir cada uno de estos marcadores: CD34, HLA-DR negativos. Entonces, ¿qué nos indicaba el CD34? Inmadurez. Si es una célula madura, CD34 va a ser negativo. Lo mismo el HLA-DR, que lo encontramos en los granulocitos negativos, pero en los monocitos positivos. CD13, CD33 y CD117 van a ser positivos en la leucemia promielocítica.

En la leucemia mieloide aguda vamos a eh utilizar estos distintos marcadores. ¿Y qué otros marcadores también pueden indicarnos como que es una clona mieloide de todo lo que estuvimos viendo hasta ahora? Aparte de esto, ¿no?

En la leucemia mieloide aguda vamos a seguir una confirmación diagnóstica que parte desde lo que mencionamos como el hemograma, con o sin persistencia de blastos. Después una biopsia de médula, que debemos encontrar este mayor al 20% de blastos en en médula ósea según la definición de la OMS. Los distintos marcadores que utilizamos para la inmunenotipificación en médula ósea más la mieloperoxidasa citoplasmática, que me estaría hablando de la presencia de mieloblastos. El estudio citogenético, importante la detección de traslocaciones y de deleciones que van a ser asociadas eh la presencia de algunas de ellas van a ser asociadas a mal pronóstico. Eh estudio de hemostasia, muy importante porque los pacientes con la mieloide aguda tienen complicaciones como es la coagulación intravascular diseminada. Entonces, no se estaría hablando de esta coagulopatía de consumo por activación de la coagulación, por la presencia de estos elementos maduros y sus productos en sangre periférica y en médula. Estudio de la función hepática, renal, LDH, calcio por el síndrome de lisis tumoral. Y estudio de marcadores moleculares, porque muchas veces esos marcadores moleculares me dicen la sospecha de eh una determinada eh leucemia.

Después hay muchos marcadores que también los podemos encontrar en distintas eh leucemias, no los mencionamos. Muchos de ellos es común que desaparezca su expresión en algunos tipos de leucemia. Por eso decíamos que eh lo que vemos en el frotis muchas veces no es lo que se traduce en el inmunofenotipo. Entonces, podemos tener una célula que a mí me parece un promielocito, pero en el inmunofenotipo me está diciendo que, según la intensidad de fluorescencia que presenta por la expresión de un marcador, es un promielocito pero mucho más joven y no tan maduro. O al revés, que sea muy maduro o por la expresión muy alta de un marcador y que sea eh y en el frotis solo a todas las células las veo iguales. No puedo diferenciar un estadiaje, digamos, dentro de lo que es el promielocitoma, la maduración de esa célula, ¿no?

Vamos a ver que utilizamos para otros tipos de leucemia, como es la leucemia linfocítica crónica, eh la prolinfocítica, las células peludas, el linfoma de células pequeñas, linfoma de manto, linfoma folicular. Son marcadores específicos para esos tipos de linfomas. Eh, mencionamos más bien lo que es la mieloide aguda y la mieloide y la linfoide aguda, porque son dentro de todas las que tienen eh las leucemias agudas son las que tienen mal pronóstico.

La e la leucemia linfocítica crónica e vamos a ver que también tiene marcadores específicos. Esta misma identificación y esta misma forma de proceder con el monofenotipo se aplica a todos los tipos de leucemias y linfomas que podemos tener. E como ejemplo es mejor utilizar las leucemias agudas porque e nos permite específicamente ver lo que es inmaduro de lo que es normal. En el caso de las crónicas vamos a tener que tenemos mayor diferenciación, por lo tanto, vamos a tener células que a nivel del frotis vamos a poder identificarlas. Vamos a poder decir que en la leucemia linfocítica crónica son linfocitos los que veo y no células inmaduras, porque en las crónicas son más diferenciadas que en las agudas, que son indiferenciadas. Lo mismo en la leucemia mieloide crónica. Vamos a tener ciertos marcadores que están presentes en la leucemia linfoide mieloide crónica, pero las células son más diferenciadas que los blastos.

Esto simplemente es el el rol que ocupa el el inmunofenotipo en distintos tipos de pacientes, que es lo que vamos a buscar en cada uno de ellos, ¿no?

En la leucemia linfoblástica aguda, en menores de 15 años, es importante la detección de CD19, CD3 y TDT. Específicamente por esto que hablábamos anteriormente de qué significa cada uno de ellos.

En la mieloide aguda, estudios citogenéticos y marcadores tumorales, marcadores moleculares me van a a ayudar en el pronóstico.

En la leucemia promielocítica aguda, que es aquella e enfermedad, esa leucemia que para nosotros es una emergencia médica por la progresión muy rápida que tiene, la identificación de estos marcadores como factores pronósticos.

Y en la leucemia mieloide crónica es importante el cariotipo y el estudio molecular y el recuento de blastos, porque la eh la presencia de blastos en una leucemia mieloide crónica, me estaría hablando del pasaje de una fase crónica a una fase acelerada con posible transformación a leucemia mieloide aguda.

En los mayores de 15 también vamos a eh diferenciar los marcadores que vamos a buscar en la semiomieloide aguda, en la promielocítica y en la linfoide eh aguda.

Si recordamos cuando hablamos de en la clase de leucemias linfoblásticas agudas, hablábamos que existían tres estadios según la clasificación FAB, pero que actualmente a nivel de lo que es el estudio de las leucemias por la organización, los criterios de la Organización Mundial de la Salud, vamos a ver que dentro de lo que es la leucemia linfoblástica aguda tenemos distintos patrones de expresión o distintos tipos de leucemias, como son las células e las leucemias eh como subtipo e pro-B o común o pre-B, depende de la célula que está proliferando el marcador que veo utilizar para poder identificarlo.

Si vamos a lo que es aquella gráfica que veíamos, aquella tabla que veíamos, los distintos tipos de el linfo, el desarrollo del linfocito B, podemos ver que se eh se compara con estos eh marcadores que observamos acá. En el caso de la T, lo mismo. Vamos a ver que la T, dependiendo de dónde es que se desarrolla o el inmunofenotipo que presenta, vamos a poder clasificarla dentro de lo que es los criterios de la Organización Mundial de la Salud en distintos distintos subtipos dentro de cada una de los tipos de leucemias agudas.

Modo de ejemplo, el inmunofenotipo para, por ejemplo, en la leucemia mieloide aguda o M3, tenemos el HLA-DR negativo. El HLA-DR, como ya lo estuvimos mencionando, ¿de dónde de dónde proviene este HLA-DR? Viene del gen HLA, antígeno leucocitario humano. Tiene relación con el complejo mayor de histocompatibilidad y el HLA-DR en particular proviene del complejo mayor de histocompatibilidad clase dos. Quienes presentan eh complejo de mayor histocompatibilidad clase dos son las células presentadoras de antígenos profesionales, recordando que son los linfocitos B, los monocitos, macrófagos y células dendríticas. Si es M4, lo más probable es que tenga HLA-HLA-DR, pues es monocítica, ¿no? Como decíamos acá. La M3 es la promielocítica, por lo tanto, el promielocito no es una célula presentadora de antígenos, negativo, pero la M4 es mielomonocítica, entonces HLA-DR positivo. Eh, la M6 es la eritroblástica, por lo tanto, tenemos glicoforina. ¿Se acuerdan que dentro de la estructura del eritrocito eritroblasto tenemos las glicof glicoforinas? Y si es M7, los marcadores de las glicoproteínas de superficie de la plaqueta.

Entonces, ¿qué indican los gráficos de la muestra de una persona? Los siguientes gráficos corresponden a una misma persona. Tenemos un primer gráfico que combina CD45 con complejidad interna. El segundo combina CD3 citoplasmático y mieloperoxidasa citoplasmática. El tercero CD19 con CD20, CD34 con TDT, CD25 con HLA-DR, CD6 con CD58.

Si preguntamos cuál población corresponde a un blasto, aquí tenemos una población de color naranja, una población verde y una azul. En el primer gráfico, por donde empezamos y donde podemos hacer esta primera diferenciación, tenemos una población con alta expresión de CD45. Eh, se observa acá, ¿no? De color verde, alta expresión de CD45 y otra con menor expresión de CD45. Si recordamos, la población naranja corresponde a los blastos que tienen una complejidad interna medianamente similar a los linfocitos que se observan en color verde y monocitos, y tienen una menor expresión de CD45.

Entonces, ¿qué marcadores poseen y no poseen eh estos blastos? Vemos en la siguiente la combinación de e CD3 y mieloperoxidasa. Si nos damos cuenta, está más hacia la izquierda y así más abajo en comparación con otras poblaciones presentes. Por lo tanto, estos blastos serían negativos para CD3 y mieloperoxidasa.

El gráfico e acá en este caso no negativos para lo que es [Música] e CD3 y mieloperoxidasa. El gráfico C, la población naranja está muy a la derecha para CD19, es positiva y para CD20 está abajo, por lo tanto, es negativo. En la siguiente, la combinación de CD34 y TDT está a la derecha para CD34, por lo tanto, es positiva y arriba para TDT, entonces es positiva. Para HLA-DR está muy arriba, es positivo. Y en este caso parecería que tiene una expresión débil para CD25, que generalmente se toma como negativa, pero no se puede definir aún la expresión de ese marcador. En la siguiente está bien a la derecha, para CD6 es positivo y para CD58 también es positivo.

En resumen, ¿qué marcadores posee estas que se observan en estas gráficas? No. Entonces, podemos decir que los blastos tienen CD19, CD34, TDT, HLA-DR, CD6 y CD58. No tienen CD3, mieloperoxidasa, CD20 y CD25 es 2.

Entonces, nos preguntamos, ¿qué clona está involucrada aquí? Lo más probable es que sea una leucemia linfoblástica aguda de tipo B, porque predominan todos los marcadores de tipo B. No están los DT como son CD3 ni mieloide como mieloperoxidasa. TDT, que es linfoide, está presente. CD34 de inmadurez está presente. Y HLA-DR, más aún, porque está relacionado a la célula presentadora de antígenos.

Entonces, simplemente para hacer un pequeño repaso de lo que es la definición de la leucemia linfoblástica aguda, eh sabemos por definición que corresponde al más, según la definición de la OMS, la presencia de más de 20% o más de blastos en médula ósea, fenotípicamente linfoides B, tejido extramedular con infiltración de blastos tipo B con TDT positiva. Como decíamos, la TDT está relacionada con esa progresión y esa generación de hebras de ADN con o sin compromiso medular que se presentaba clínicamente como síntomas relacionados con las citopenias, con la anemia, neutropenia, trombocitopenia, masas extramedulares y síndrome de lisis tumoral.

Según la clasificación de la Organización Mundial de la Salud, tenemos distintos subtipos dentro de la célula de la leucemia linfoma B, linfoblástica, que vamos a ver cada uno que corresponde no solo a la identificación por e inmunofenotipo que vamos a hacer de la leucemia, sino a traslocaciones presentes en cada uno de estos subtipos, que estas traslocaciones son las que están relacionadas con el buen pronóstico de la enfermedad, así como la presente la presencia de eh cromosomas, aquello que era hipodiploide, hipodiploidía, eh haploide o diploide, que lo mencionamos en la clase de leucemias y anormalidades genéticas recurrentes.

Bueno, y esto es simplemente un ejemplo para que veamos la caracterización de la leucemia linfoblástica aguda B con el escáner de este tipo de células, ¿no? En que se fueron marcando con distintos marcadores. Presente CD45. Los blastos, se acuerdan que los ubicamos acá abajo, lo mismo que los linfocitos. Esos blastos son CD19 positivos, CD24 e negativos con CD10, CD20 positivos y CD10 positivos. Y así vamos viendo cada uno de ellos, ¿no? TDT positivos, CD38, CD22, ¿no? Inmunoglobulinas de eh membrana, ¿no? Presentan inmunoglobulina de membrana, por lo tanto, eh no se trata de células maduras, se trata de células inmaduras, ¿no? Y así cada una de las gráficas que pueden eh pueden utilizarla como ejemplo, utilizando las tablas que estuvimos viendo ahora, ver esta gráfica, ver los tipos como hicimos en el ejercicio anterior y ver cómo caracterizaríamos esta leucemia de tipo B.

Eh, y bueno, simplemente para terminar los marcadores de eh en base al tubo de leucemia linfoide aguda, los marcadores asociados al linaje, cada uno de ellos, aquellos que me van a permitir hacer un diagnóstico diferencial y compararlos con lo que es la población normal. Marcadores de importancia: CD22, CD24, marcadores mieloides y TDT en cada una de las leucemias para poder diferenciarlo de lo que es la población mieloide, de la población que es linfoide.