Métodos Separativos - Clase 7 - Consulta HPLC

Vamos a grabar también esto, así después se lo podemos subir. Tengan en cuenta que los estamos grabando.

Bueno, la idea de esta clase es resumir un poco todo lo que vimos sobre, eh, básicamente métodos cromatográficos orientados a la cromatografía líquida, ¿no? Pero vamos a hacer, bueno, más allá de contestar las preguntas que vayan surgiendo o que ustedes quieran después plantearnos, vamos a utilizar un método de ejercicio o de ejemplo basado en algo más o menos real para ir viendo, desde el punto de vista como una especie de proyecto de trabajo, las distintas temas que tratamos en el curso.

Entonces, yo hace un tiempo, esto ya salió en el 2017, tomé este caso sacado de la prensa de acá de Uruguay. Por eso no es que le estoy haciendo propaganda a la República, sino que simplemente fue el diario que donde encontré esta noticia. Fue un caso que tuvo bastante repercusión en Uruguay, que se siguió por prensa, por televisión, y estuvo unos cuantos meses en danza. Entonces, vamos a ver desde ese caso cómo nosotros, como químicos, a veces tenemos que enfrentarnos a estas situaciones, estos problemas, y todo lo que estamos aprendiendo cómo lo vamos a ir desarrollando para resolver esta situación.

Esto fue el caso de, el titular dice: "Un agroquímico arruinó cosecha anual de tomates y morrones en Canelón". Unos cultivos en una zona de Canelones empezaron a quemarse, todos los cultivos a secarse, la plantación. Entonces, motivó que hubiera investigaciones, hubiera denuncias. Y básicamente, lo primero que manejaron fue, bueno, la hipótesis esta de que, eh, básicamente el agua de riego que los productores estaban tomando de cañadas, ríos cercanos, estaban contaminadas con un agroquímico. Acá ponen de alta potencia, en realidad eso es bien periodístico, la potencia del agroquímico no estaba determinado porque las plantas se murieran, porque básicamente los herbicidas, no los herbicidas, básicamente matan plantas que no que son susceptibles a ese herbicida. Entonces, bueno, la hipótesis era esa, que en el agua de riego ellos estaban regando con agua contaminada.

¿Cuál sería entonces para nosotros, poniéndonos en la posición de químicos, ya sea en la Dinama o en la Intendencia de Canelones, en el laboratorio que le cayó este problema, cuál sería nuestra opción en este tipo de análisis? ¿Qué análisis deberíamos realizar para determinar el [Música] agroquímico?

Esta pregunta, básicamente, nosotros no conocemos la respuesta de qué agroquímico es, si es un agroquímico, cuál es el que está presente. Entonces, este tipo de análisis es bien un análisis que nosotros definimos como no dirigido, o sea, donde las sustancias que nosotros queremos analizar y determinar no son conocidas a priori. O sea, básicamente sospechamos que es un agroquímico, y todo agroquímico es un producto sintetizado que tiene permisos, que tiene un historial de análisis de uso que se conoce, pero en principio nosotros no sabemos cuál es. O sea, que esto es una búsqueda de un desconocido conocido.

Este tipo de análisis generalmente se desarrolla por sistemas de screening, donde básicamente son métodos analíticos que están diseñados para abarcar un tipo grande de moléculas, un grupo grande de moléculas que tienen determinadas características comunes. O sea, aquí estarían caracterizados por agroquímicos hidrosolubles, básicamente. Ah, entonces tenemos ahí todo lo que son herbicidas, insecticidas, pesticidas en general. También puede ser otras sustancias, puede ser de origen no orgánico, podrían ser sales de metales, por ejemplo, que también pueden causar este tipo de daño. En ese caso, bueno, los análisis que se van a hacer van a ser justamente diseñados para enfocar esos grupos y bueno, establecer primariamente cuáles serían los agentes presentes.

Luego, siguiendo la noticia, surge que, bueno, concretamente hay un antecedente, hay un establecimiento vecino que tendría plantaciones donde se aplican este tipo de herbicidas. Entonces, de ahí surge básicamente un posible candidato que es el imazapir. El imazapir sería un agroquímico utilizado para plantaciones de maíz y soja, que en las inmediaciones había sido utilizado o habría sido utilizado. Esto no sabemos cuál es la fuente ni dónde sube.

Ahora, para este tipo de análisis, ahí ahora es mucho más concreto. Sabemos que el imazapir es un compuesto que lo podemos buscar, que podemos buscar su fórmula, los análisis que haya acerca de él, tanto como producto manufacturado, digamos, como agroquímico, como contaminantes en aguas superficiales, por ejemplo. Entonces, aquí ya el análisis sería un poco más concreto, y es lo que conocemos con análisis dirigido, análisis donde básicamente vamos a buscar si está presente o no el imazapir. Y ahí es un ya mucho más específico.

Entonces, ¿qué es el imazapir? Lo primero que tenemos que, como químicos, es bueno ver este tipo de sustancias, a qué nos estamos refiriendo. Imazapir, lo encontramos, es esta, básicamente ustedes pueden buscar en Wikipedia. Si buscan en Wikipedia, traten de confirmar la estructura que está presente de alguna forma, por ejemplo, generalmente está el número CAS. Busquen luego, confirmen en en Sign Finder que el número CAS coincide con la estructura, porque yo he tenido la experiencia de que las estructuras que están en Wikipedia, sobre todo en español, a veces no coinciden con el producto real, sino que es una estructura genérica y las confunden. Confirmen eso, vean qué otra información pueden encontrar de ese producto.

Aquí, básicamente, el imazapir es este producto, este compuesto. No sé si ven acá que tiene determinadas características. Es un derivado de imidazolina, que son una familia de herbicidas. O sea, que si bien puede ser que sea imazapir, pero capaz que puede ser otro anal o otro derivado del imazapir lo que está ahí presente. Y bueno, tiene sus peculiaridades, digamos. Su acción herbicida se basa en la inhibición de síntesis de los aminoácidos de cadena ramificada de las plantas susceptibles. No sé cuáles son las plantas susceptibles. Se absorbe por las hojas, por las raíces, y poseen actividad residual. Esto básicamente lo convierte en un buen candidato para el problema que estamos viendo, básicamente los tomates deberían poder ser susceptibles a este herbicida que no está pensado para ese cultivo.

Entonces, bueno, riesgos ambientales: no tiene prácticamente para aves y peces, y es moderadamente tóxico para la abeja. O sea, que es básicamente un agroquímico de los que están permitidos y de los que su uso está regular. ¿Por qué está en en puede estar en las aguas de ríos? Bueno, básicamente porque no se degrada rápidamente, los suelos no lo retienen con suficiente fuerza, digamos, y las aguas de lluvia van lavando este componente hacia las cañadas o arroyos, y entonces puede haber una concentración de ellos en esos lugares, además de que se pueda haber usado cantidades excesivas o una dosificación y una aplicación inconveniente. Eso es tema de otros cursos.

Bueno, pero nosotros ahora que conocemos esta estructura, nos vamos a preguntar, vamos a poder deducir de esa estructura muchas características que nos van a ir guiando hacia dónde o cómo trabajar con este producto, ya sea en su parte analítica y en su parte de manipulación. Entonces, ahí nos tenemos que preguntar si esta molécula, básicamente con esta estructura, es una molécula polar, apolar, si es iónica, si es hidrofóbica o hidrofílica, o ambas cosas. Si es neutra, ácida, básica. Esas propiedades químicas que son en su disolución acuosa son las primeras que van a evidenciarse. Si la molécula es volátil o no, si va a ser transparente en UV o no. Son propiedades que nosotros podemos ver directamente de la estructura o deducir más o menos analizando un poco la química y los grupos que están presentes.

Muchas de estas cosas no se pueden definir como blanco o negro. O sea, es polar, apolar, o iónica. Bueno, si es iónica, puede ser ionizable y puede estar ionizada o no. La polaridad depende mucho de los grupos funcionales y puede tener partes polares y partes totalmente apolares. Lo mismo la hidrofobicidad o hidrofilicidad. Las moléculas a veces tienen comportamientos ambiguos o ambos comportamientos. Pero nosotros tenemos que empezar a definir eso.

En esta molécula, quizás, básicamente ustedes pueden decir: "Bueno, es ionizable". Yo aquí reconozco un grupo ácido fácilmente que me dice este grupo es ionizable. También tengo un grupo piridina que generalmente, si no está muy desactivado, es un grupo ionizable. La imidazolina, ya puedo tener dudas, ¿será ionizable o no? En principio, también es un grupo, pero hay moléculas que a veces no es tan fácil deducir sus características, sobre todo ácido-base. Hay heterociclos que son difíciles a veces de definir claramente.

Para eso, entonces, yo presenté, tenemos una ayuda que es el Chemical. El Chemical, o sea, la versión Alfa acá es como versión Beta, nos permitía hacer una búsqueda ilimitada de productos, que se basa en que nosotros dibujemos la estructura o le pongamos el nombre, el número CAS o el número IUPAC, y el Chemical lo que hace es calcular. Estos no son propiedades experimentales, sino propiedades de cálculo, calcular en base a esas estructuras propiedades fisicoquímicas de esa molécula. Hoy en día no está libre totalmente, pero sí les deja, creo que hacer hasta unas 10 cálculos. Depende si ustedes se registran con otro nombre, pueden hacer otro, etcétera.

Pero, perdón, perdón que te interrumpa, Danielo, pero creo que ahora el Chemical les permite únicamente para moléculas pequeñas, que era lo que cambiaron el año pasado.

Bueno, básicamente lo que tenía ese programa, que tiene ese programa, que es muy interesante, no sé, capaz que también haya otros. Nunca la búsqueda de otros libres es que ustedes poniendo la estructura, por ejemplo, el programa les calcula las distintas formas iónicas que puede tener esa sustancia y cómo varía la concentración de esa forma según el pH. Acá tenemos pH de 0 a 14, y con los colores estamos identificando determinadas distintas formas iónicas de esta molécula, que fíjense que hay ocho formas iónicas.

Esto es fundamental para ustedes, vieron cuando estemos hablando de, por ejemplo, HPLC modo reverso. HPLC en modo reverso, el tiempo de retención de los productos está pautado por el equilibrio entre las formas no ionizadas y las formas ionizadas. Y aquí no tenemos un solo equilibrio, tenemos básicamente siete u ocho. Tenemos una forma neutra, totalmente neutra, pero al tener un aminoácido, las formas neutras es esta que no tiene ninguna carga, no tiene ninguna carga, pero también hay otras que, a ver si me doy cuenta cuál es, por esto debe ser esta de acá. Yo no tengo una barra acá que no logro ver los colores que están abajo, pero aquí, por ejemplo, esta es un zwitterion. La carga de la molécula es neutra, pero esta molécula es iónica, por lo tanto no se va a repartir bien en una fase orgánica. Y fíjense el color de esta es celeste, no sé cómo lo ven, creo que es esta que está aquí abajo. Ah, o sea, esta que estamos que está representada por el azul, que es la forma neutra, no existe a pH 7, sino que existe a pH 2 y pico. La forma que existe a pH 7, pH neutro, es esta que es verde, que es la forma aniónica.

Entonces, cuando ustedes básicamente van a correr en un HPLC una sustancia como esta, esta sustancia está continuamente entre esos equilibrios, y según el pH, lo que vamos a conseguir es si se va a desplazar más hacia la fase móvil su distribución o más a la superficie estacionaria, y entonces los tiempos de retención van a básicamente cambiar según el pH. No quiere decir de que nosotros para analizar este herbicida tengamos que tener esta forma, esta forma únicamente para trabajar. Nosotros en HPLC vamos a poder trabajar a pH 7. Si queremos, podemos analizar esto a pH 7. Generalmente se recomienda si tenemos una sola función, pH cercanos donde la molécula está totalmente ionizada o la molécula está con su presión iónica alejada de estos puntos de inflexión. Pero eso es más bien una ventaja para que la variación de los tiempos de retención con pequeñas variaciones del pH se minimice. Pero siempre vamos a poder trabajar en cualquiera de los pH, siempre y cuando que, acuérdense, que las columnas de fase reversa comunes tienen un rango que pueden ustedes trabajar para que la columna sea estable entre dos y siete, ocho como máximo. O sea, que aquí sería donde ustedes podrían trabajar con una columna de fase.

Pero ya me estoy adelantando, diciendo bueno, si esto lo vamos a trabajar o no con HPLC o fase. Lo que les quería mostrar es esto del Chemical, que bueno, les trae ese tipo de estudio gráfico, les trae este otro, por ejemplo, el cálculo del punto isoeléctrico, que vemos que aquí el punto isoeléctrico, o sea, donde la molécula es cero, la carga es cero, está en un pH 2 con 7, 2 con 5, no sé, pero y después la molécula siempre es negativa. Y por debajo de ese pH, o sea, pH entre 0 y 1, la molécula es positiva.

Cuando hablamos de la distribución de si es hidrofóbica, si hidrofílica, si la molécula se reparte entre una fase acuosa y fase orgánica, se acuerdan que para moléculas ionizables ya no hablamos de log P, sino hablamos de log D, porque el log D es esto, en todo el rango de pH va cambiando según el pH. Y el log P es exclusivamente a pH 7.4, o sea, es a pH fisiológico. El log P por definición se estableció para los fármacos en una reparto octanol-agua pH 7.4, porque era el pH fisiológico. Entonces, aquí tenemos el log P de esta sustancia, pero el log D de esta sustancia varía, siendo máximo aquí en la zona que estamos viendo de pH entre dos y cuatro, y después más bien baja, porque la molécula se hace cada vez más iónica, más ionizada. Todo este rango estamos viendo que la molécula se está haciendo, va, digamos, las poblaciones de moléculas de molécula ionizada cada vez son mayores. Tenemos una población máxima de molécula neutra en este.

¿Alguna duda hasta aquí? Bueno, ahora vamos a tratar de visualizar paso a paso cómo seguiríamos o procederíamos con este problema. Nosotros tenemos que es una muestra de agua, no agua de riego, básicamente. ¿Cómo tomaríamos esa muestra? ¿Cuánta muestra debemos tomar? ¿Y qué precauciones debemos tomar con esa muestra de? O sea, básicamente, en este caso, tomaríamos en varios puntos en el agua de riego, en la plantación, pero también muestras de agua en las fuentes de aguas superficiales cercanas para ver de dónde viene esa agua, a ver dónde surge la contaminación. Y tenemos que acondicionar esa agua. O sea, básicamente, en el agua pueden crecer microorganismos. Los recipientes que usemos tienen que ser adecuados, que no retengan sustancias. En el agua vamos a tener una contaminación, pero que no es una cantidad excesivamente grande. Si usamos un recipiente inadecuado, puede ser que el contaminante quede pegado al recipiente, absorbido al recipiente, y luego no lo visualicemos o lo tengamos en cantidades que no son representativas. Básicamente.

Bueno, cuando hablamos de la preparación de muestra, vimos que también, bueno, si vamos a inyectar después esto en algún instrumento, ya sea cromatógrafo gaseoso, cromatógrafo líquido, generalmente conviene, bueno, concentrar, eliminar interferencias, filtrar el agua de riego puede venir con barro, con arena, con lodos, todo eso lo tenemos que quitar. Si es mucha cantidad de agua, vamos a tratar de concentrar para tener un volumen y una concentración adecuada para ser más sensible del experimento. En este caso, interferencias en el agua no vamos a tener, no es una planta que le estamos extrayendo todos sus contenidos, entonces no vamos a tener que hacer ese tipo de tratamiento. Pero todos los la preparación adecuada para este tipo de, que básicamente también están pautados ahí, si ustedes trabajan en un laboratorio de contaminación ambiental, esas cosas ya están básicamente muy estudiadas y se siguen protocolos que ya están validados de que, bueno, los recipientes son adecuados, las cantidades deben ser más o menos adecuadas y seguir determinados procedimientos.

Bueno, aquí nosotros deberíamos empezar a visualizar qué vamos a usar [Música] para analizar. ¿Qué les parece? ¿Qué vamos a usar? Por lo que vimos de las moléculas, podemos poner votación eso. ¿Qué qué podría ser? ¿Qué van a elegir entre GC, HPLC o distintamente? Esta molécula les parece es analizable porque c. Es analizable por HPLC. Bien. Les vamos a poner una votación. Ustedes pueden agarrar y votar. Este es totalmente anónimo, o sea, que júguenla y pongan algo. Vieron, ahí va. Cuéntenme si lo ven. Sí, se ve. Bueno, dejamos un minuto para que todos. Ya el 53 votó, o sea, lo están votando muy rápido. 57%.

¿Cómo hacemos nosotros para discernir esta primera división de caminos, digamos? Básicamente, siempre nos vamos a referir en principio a si la molécula es volátil o no. Si pensamos que se puede volatilizar en ciertas condiciones, por lo menos con un calentamiento que no puede ir más allá de 200, 300 grados, 300 grados de lo que un cromatógrafo de gases puede alcanzar, entonces las sustancias que son estables, que no, que vemos que se pueden volatilizar en esas condiciones, básicamente la cromatografía gaseosa brinda ventajas sobre la cromatografía líquida. Las ventajas ya las van a ver ahora en las próximas clases, porque la cromatografía gaseosa, sobre todo capilar, tiene un alto poder de resolución que la cromatografía líquida le cuesta o le ha costado y cuesta incluso económicamente alcanzar.

Bien, esta molécula, como vimos, tiene grandes posibilidades de ionizar y de hecho, en el agua nosotros tomando a pH 7, 6, 5, que son los pH comunes de las aguas naturales, va a estar en forma ionizada, como zwitterion, como anión, o como básicamente con dos, una o dos cargas en la molécula, y eso prácticamente es una inhibición muy a que esa molécula sea volátil. Entonces, básicamente, este tipo de moléculas difícilmente se pueda analizar así como está por GC, lo cual después ya lo van a ver con Eduardo. No evita de que si se pueda analizar por GC si empleamos algún truco químico, como hacer, si nosotros esterificando el ácido, por ejemplo, ya evitamos esa posibilidad de formación de zwitteriones y entonces esa molécula no es de un tamaño muy grande, va a poder ser volatilizada. Pero entonces ya estamos yéndonos a un análisis ya más complicado, que tiene que estar, sí, un análisis dirigido. Sí se puede hacer, es difícil hacer un análisis no dirigido con derivatización, a no ser que uno busque ya compuestos de un tipo determinado, o sea, que tenga un grupo funcional muy conocido.

Danilo, me confirman acá que tenemos los resultados a boca de urna. Si querés te los comparto. Básicamente, eso es para que ustedes vayan probándose con su si están bien orientados o tienen que revisar un poco su parte conceptual. Nosotros vamos a hacer bastante hincapié en tratar esto de deducir propiedades sobre las estructuras. Entonces, esto es bueno que se vayan ejercitando. Los ven los resultados ahí. Yo no sé, yo siempre los veo. Vi que hay una fuerte tendencia, mayoritariamente la opción del HPLC era bastante clara. O sea, bueno, de hecho, estuvimos hablando de. Pero no deja de ser cierto de que si se pueden analizar por GC si derivatizan, así tal cual está la molécula. Bueno.

La preparación de la muestra, básicamente, hablamos también un poco. Este sería si es una muestra de agua que la vamos a pasar por un HPLC. El agua se puede inyectar en HPLC, columnas de fase reversa sin problema. El ahí es la concentración. Bueno, se debe filtrar para sacar partículas, pero a veces es conveniente hacer una concentración previa para tener una cantidad de sustancia fácilmente determinable. Entonces, ¿qué es lo que vamos a poder utilizar? Bueno, podríamos utilizar un reparto, una extracción clásica con una bola de decantación, o lo que actualmente se utiliza, sobre todo si tenemos un número grande de muestras y tenemos un laboratorio más o menos equipado, bien, es usar las extracción con fase sólida, esos cartuchitos que ya vienen, se compran prehechos, que nosotros vamos a pasar cierto volumen de las muestras de agua de distintos lugares, y vamos a luego pasarle, por ejemplo, un solvente que puede ser metanol, y concentrar los productos hidrofóbicos en ese solvente y poder analizar a partir de ese menor volumen más concentrado los analitos.

La extracción de fase sólida es muy utilizada en este tipo de problema, porque da sus ventajas. O sea, pasamos del agua a un sistema solvente, que eso ya tiene la ventaja de que en metanol no van a crecer microorganismos, por ejemplo, ya no se va a contaminar con el crecimiento bacteriano o de algas en ese medio. Vamos a tener un solvente que no se puede reducir el volumen, podemos pasar de tener un litro a tener dos o tres mililitros. Entonces, todas esas cuestiones prácticas para un laboratorio que trabaja con gran cantidad de muestras son, bueno, y la muestra la vamos a poder tener indefinidamente en una heladera. En cambio, tener bidones de agua en una heladera se complica.

Entonces, bueno, decidimos usar un sistema de HPLC. Cuando tomamos esta decisión, básicamente el laboratorio nuestro debe estar equipado con un HPLC, pero acá vamos a trabajar un poco sobre la idea de que podemos elegir el equipamiento de HPLC que vamos a usar, o sea, o tenemos un laboratorio con mucho equipamiento y todas las opciones son posibles, o simplemente, bueno, vamos a definir nosotros qué equipamiento querríamos usar para hacer este.

Entonces, ¿cuáles son los componentes que definen nuestro equipo? Un HPLC básicamente tiene, por primer tema que es importante definir, es cuál es el sistema de mezclado. O sea, si nosotros vamos a usar un sistema, por ejemplo, para gradiente, en los casos de los análisis como eran el primer lo primero que nos planteamos, un análisis no dirigido, por ejemplo, donde tenemos que buscar entre muchos productos distintos, generalmente vamos a tener que usar un sistema de gradiente para explorar compuestos de distinta polaridad, distinta hidrofobicidad, básicamente, y entonces vamos a trabajar con gradiente amplio de fuerza de fase móvil. Para eso vamos a precisar un sistema de mezclado.

Y ustedes vieron con Guillermo que para eso hay dos soluciones básicamente en HPLC: una solución que trabaja con una sola bomba y otra solución que trabaja con una bomba por cada solvente que haya que mezclar. El primer caso es que se llama de mezclado a baja presión. Se usa una válvula cuaternaria que, básicamente, esa válvula toma de las botellas de cada solvente y en pequeños intervalos de tiempo va separando, va tomando, abriendo y cerrando la válvula con intervalos de tiempo proporcional a la composición que quiere realizar. Luego va la bomba en el pistoneo, y si tiene un sistema de mezclador, la se realiza propiamente dicha la mezcla y eso se bombea a la columna.

El otro sistema trabaja con una bomba que succiona y luego otra bomba succiona de otro recipiente, de otro solvente, y luego ambas van a una conexión donde se mezclan. Entonces, la mezcla ahí es a alta presión, o sea, la mezcla se produce después de la bomba, no en la bomba misma. ¿Se acuerdan cuáles eran las ventajas de un sistema o de otro? ¿Cuál era el inconveniente de usar el sistema de mezclado a baja presión? Burbujas, justamente, por la baja presión. Exactamente. O sea, cuando el aire se mezcla, cuando se mezclan dos solventes que tienen una solubilidad diferente del aire en sí, en esa mezcla, el aire generalmente tiene una solubilidad menor y se producen desprendimiento del aire por burbuja. Eso nos convertiría la línea en vez de ser una línea donde se transporta la fase móvil continua, tendríamos intervalos de fase móvil y aire, y eso haría imposible la cromatografía, además de afectaría el detector. Habría burbujas de aire en todo el sistema.

Para evitar eso, los sistemas actuales de baja presión tienen un desaireador en línea que generalmente prácticamente elimina todo el aire, o por lo menos baja un contenido de aire los solventes que no se produce luego del mezclado desprendimiento de burbujas. Bueno, entonces eso lo tendríamos que básicamente definir. En general, actualmente en sistemas con detectores clásicos de tipo UV se usan este sistema de mezclado a baja presión con desaireado de gasificador en línea.

Lo otro que tenemos que definir para un HPLC es el detector. ¿Qué detector usaríamos para analizar el imazapir? ¿Qué les parece a ustedes? Me estoy quedando sin voz, así que les pregunto a ustedes. ¿Qué detector usarían para esta [Música] molécula?

Eh, podría funcionar aquel de redox, tal vez, por ese grupo del ácido carboxílico. Buen, si se pueden utilizar para reducir, pero se me ocurría quizás, habría que ver, quizás se podría usar. Pero básicamente en HPLC hay un detector que es el caballo de batalla, que es el detector UV-Visible. Acá en el chat, Belén había puesto, había consultado a ver si UV era una opción. Claro, o sea, en general, lo que ustedes van a tratar de hacer es usar lo más común posible, o sea, el detector más versátil y más común en los laboratorios. Ese es el caso del detector UV-Visible.

Un detector redox o un detector de índice de refracción o un light scattering, un electroquímico, todos esos detectores se podrían ver de usar, pero los vamos a utilizar básicamente cuando este detector UV-Visible no nos sirve, porque son siempre más complejos, siempre tienen algún problema y no son detectores comunes en los laboratorios. Son detectores comunes en laboratorios especializados en algún tipo de problema o de compuesto. Si ustedes no tienen cromóforos en la molécula, tienen que usar un light scattering evaporativo o un índice de refracción. En esta molécula, cromóforos tenemos, por lo pronto, tenemos un aromático bien claro, además conjugado a un ácido y conjugado a una enamina, o sea, con otro carbonilo. Es un [Música] cromóforo en el rango del 260, 240, por ahí. Entonces, siempre piensen primero en lo más común y después, si eso no es aplicable, vayan a cuestiones más específicas.

Pero detector UV-Visible, ¿cuál usarían ustedes? ¿Qué detectores UV podríamos utilizar? Es lo mismo usar un detector de lambda fija, un detector lambda variable, que un arreglo de diodos. Si sabes dónde absorbe más, puedes usar uno de lambda fija. No. Bien, podrías usar el detector de lambda fija o el detector de lambda variable, mejor, porque si sabes dónde absorbe. Pero si el de lambda fija no tiene los filtros correspondientes a esa longitud de onda, estás perdiendo sensibilidad.

Generalmente, una consulta, la idea no era solamente identificarlo y no cuantificarlo. Solamente queremos saber si hay. Y cómo lo identificas. Eso íbamos a ir más adelante, pero el detector es una fuente de identificación y de cuantificación, como decir recién, pero también de identificación. Y la identificación en un HPLC no se hace únicamente por el tiempo de retención. Algún elemento más para la identificación. Y ahí es que viene ayuda el detector de arreglo de diodos. Detector de arreglo de diodos te brinda un elemento más de identificación, que es el espectro UV de la sustancia. Entonces, vos podés tener espectros de los picos que vas viendo, y esos espectros te pueden servir para confirmar o justamente decir que no es determinada sustancia.

Entonces, para este tipo de estudios, generalmente el detector de arreglo de diodos es más adecuado. En lambda fija es el más barato, más económico, pero es el detector que se usa cuando uno tiene un único análisis, unos análisis muy definidos, muy establecidos. Un laboratorio analítico de tipo ambiental, más bien, tiene que tener un arreglo de diodos, porque ahí podría ser el imazapir, pero podría ser otro tipo de sustancia que tenga otro tipo de espectro. Entonces, tú en el análisis vas a ver el pico y vas a ver el espectro, y eso te va a guiar hacia la identificación.

Entonces, el, en general, el problema del arreglo de diodos es el costo, que es mayor que los otros detectores, y es que a veces, para algunas cosas, es un poco menos sensible que un detector de longitud de onda variable. Pero si no, yo diría que es casi el que se va a elegir si ustedes tienen para elegir en un laboratorio para comprar. Siempre van a tratar de que sea un arreglo de eso. Por ahora, es una regla bastante genérica. Si tienen que, pero la diferencia de precio es mortal. Claro, si tienen que recortar por precio, una longitud de onda variable es una opción bastante adecuada.

Longitud de onda variable puede llegar a medir espectros, pero con flujo detenido. Quiere decir que uno tiene que hacer el análisis, cuando sale el pico, parar la bomba y ahí medir. Eso no es viable para muchos análisis o mezclas complejas. Entonces, H es son tampoco. Generalmente, un detector de longitud de onda variable también te permite usar por lo menos dos longitudes de onda. Y ahora, hasta ahí el truco este que emplea Ilil, que los que en los equipos de la unidad de cromatografía donde se hace el práctico, por problema de dinero, se tiene dos detectores que son de arreglo de diodos y otros detectores que se llaman de detección múltiple o múltiple longitud de onda, que es un detector de arreglo de diodos pero sin el software para detectar todas las longitudes de onda, sino que se pueden detectar hasta ocho longitudes de onda simultáneamente. Específicamente, eso es otro nuevo opción que también hay en el sistema de detector.

Bien, pero acá nosotros, yo recomendaría el arreglo de diodos.

Bueno, y columna, ¿qué columna? Para hacer un análisis de HPLC de este compuesto, ¿qué tipo de columna? ¿Y qué columna elegiría? Ahí vamos a seguir el mismo principio. Vamos a tratar de utilizar lo más genérico y común. Lo más genérico, más del 90% de las aplicaciones en HPLC actual son en columnas de fase reversa, modo reverso. Ah, entonces, la columna más típica de eso es una C18. Y las columnas estándar de, si hablamos de HPLC, sabemos que son columnas de 10 a 25 cm de largo, de un diámetro interno de 4,6 mm de diámetro interno, con partículas de 5 micras. Lo estándar hoy en día es lo que está. Hace 20 años eran de 10 micras. Y si van a trabajar con partículas más pequeñas, están ya pasándose a sistemas más rápidos o tipo UHPLC, como vamos a ver más adelante.

Pero básicamente, las dimensiones de la columna, ¿en qué son importantes para el análisis? Bueno, el diámetro interno de la columna nos va a pautar el flujo con el que vamos a trabajar con esa columna. El flujo de una columna está pautado por el diámetro interno y por el tipo de partículas que tiene. Si las partículas son estándar, básicamente una columna de 4,6 va a trabajar con un flujo de 1.5, 2 ml por minuto máximo. Si trabajan con una columna de diámetro menor, los flujos van a tener que ser proporcionalmente menor. Se acuerdan de que en unas columnas, cuando uno escala columnas, lo que se trata de mantener es la velocidad lineal. La velocidad lineal se calcula para la mayor eficiencia de acuerdo a los número de platos teóricos. Eso también es un cálculo experimental. Ustedes calculan, hacen un análisis y de un producto y pueden medir el tiempo de retención y el ancho, y ahí pueden sacar el número de platos teóricos que esa columna tiene para ese sistema y para esas condiciones. Si ustedes cambian las condiciones, esos dos parámetros cambian y pueden obtener más o menos número de platos teóricos y ahí pueden llegar a un óptimo, que generalmente, como dije, en estas columnas estándares andan por 1, 1.5.

¿Cómo hacen ustedes para en la práctica generalmente saber cuál es el flujo óptimo? Yo lo que les recomiendo siempre es de la columna. Todas las columnas, cuando ustedes las compran, vienen en una cajita. Ojo, guarden la cajita. Viene con un análisis de control, donde el fabricante analiza una serie de estándares y les da las condiciones de flujo que hizo, temperatura y que sea que ustedes hicieron ese análisis, y eso les va a servir básicamente para controlar. Cuando ustedes van a usar por primera vez la columna, lo ideal sería poder repetir ese análisis y estar seguro de que la columna no sufrió en el transporte o en el almacenamiento previo. Las columnas son frágiles. Si alguien las tira al piso, se pueden quebrar internamente y eso se va a ver en el análisis. Entonces, en ese análisis está el flujo, y el flujo que usa la empresa siempre está en sus mejores condiciones, porque ellos quieren demostrar mayor eficiencia y el mayor número de platos teóricos de sus columnas. Entonces, eso es un buen índice del flujo óptimo de la columna.

Bueno, después el largo de la columna es un poco de acuerdo a la resolución que ustedes necesitan para ese análisis. Si ustedes están trabajando en un análisis como el original, donde ustedes pueden tener cientos de productos posibles, ustedes precisan una alta resolución para separar todas esas cosas, y entonces precisan una columna quizás más larga. Si ustedes solo van a analizar una mezcla pequeña de productos o un producto, dosificar una sustancia, pueden usar una columna más corta, 10, 15 cm, con estas partículas.

Bueno, fases móviles. Si estamos hablando de fases reversas, ¿cuáles van a ser las fases móviles? Básicamente, siempre son mezclas acuosas. Vamos a tener una fase móvil A, que es agua, o que yo diría que nunca es agua, y recomiendo que nunca sea agua, a pesar de que hay análisis que se hacen con agua pura. Siempre es un buffer. El buffer nos fija el pH y nos evita que en este caso, por ejemplo, moléculas ionizables, sus tiempos de retención estén variando según el agua, el día, el pH que tomemos el agua del día que estemos trabajando, o según la cantidad de sustancia que inyectemos, porque si ustedes tienen una sustancia ácida, esa sustancia genera un cambio de pH en el momento de inyección, y eso perturba todo el análisis. Van a obtener generalmente picos con formas no simétricas que corresponden a esa alteración.

Entonces, una va a ser un buffer. Pongamos buffer acético, 0% 0%. La B es nuestra fase móvil fuerte, o sea, el componente fuerte del de lo que vamos a utilizar, que va a ser genéricamente, siempre empezamos por metanol o acetonitrilo. Esos son los que se usan casi el 90% de las veces. Si no es suficientemente fuerte una mezcla con buffer con acetonitrilo o metanol, podemos agregar un tercero como THF, como isopropanol, como etanol, pero generalmente ya estamos en condiciones de mucha hidrofobicidad.

Bueno, los parámetros analíticos que tenemos que definir, ahí serían el flujo, que ya definimos un poco por la columna, la temperatura, la longitud de onda que vamos a medir. La temperatura actualmente que se usan hornos, fijar siempre de la temperatura ambiente es preferible que sean 5 o 10 grados por encima de la temperatura ambiente para evitar que justamente el ambiente afecte fluctuaciones de temperatura. Entonces, sea 30, 40 grados es adecuado. Recuerden que las columnas fase reversa, hay algunas columnas especiales que se pueden subir más la temperatura, pero general no pueden trabajar más de 60 grados y recomendable hasta 50.

Después, bueno, ¿qué datos vamos a registrar? Y ahí viene un poco asociado a lo que vimos hoy con el detector. Lo que nosotros vamos a registrar básicamente en el análisis son picos que tienen tiempos de retención, que tenemos que tomar. Podemos tomar las áreas de esos picos para más o menos darnos una idea o para cuantificar si lo vamos a hacer. Idea de la cantidad. Podemos registrar los espectros, que vimos que nos va a ayudar a la identificación. Pero en cromatografía, básicamente, no hay una forma absoluta de identificación directa por tiempo de retención. Entonces, ahí nosotros vamos a tener que confirmar con estándares, ver que los tiempos de retención coinciden con el estándar, pero además con algún otro elemento, con el espectro, y bueno, algo que nos caracterice ese compuesto. Por eso también a veces, para este tipo de situación, y eso lo vamos a ver en la segunda parte del curso, los espectrómetros de masa son mejores, porque te brindan otros elementos que son los espectros de masa o los pesos moleculares de los.

Y bueno, los resultados esperados en este caso va a ser la confirmación o la ausencia. Que haya picos en el análisis no nos confirma nada, a no ser que podamos identificar esos picos contra patrones, contra un estándar de este producto, con un espectro de este producto, con algo que nos diga, bueno, este pico realmente es imazapir. Un espectro similar sin el estándar puede ser un análogo. Ustedes pueden tener, por ejemplo, esta molécula puede tener en vez de un etilo en esta posición, puede tener un propilo, una cadena larga, y entonces el espectro, el cromóforo va a ser el mismo, y sin embargo, va a ser otro producto. Entonces, capaz que no coincide con el tiempo de retención de. Entonces, en fase reversa no va a coincidir, porque esto le da una hidrofobicidad diferente. Todas esas cosas hay que tenerlas en cuenta.

Bueno, esto era justamente eso, un ejemplo tratando de ver en las distintas cuestiones del HPLC desde un punto de vista práctico. Esto es lo que nosotros nosotros llamamos son aplicaciones. Acá estamos viendo una aplicación del HPLC a problemas medioambientales. Las aplicaciones tienen un universo muy muy amplio, por eso nosotros básicamente somos muy defensores de que este tipo de cursos son básicamente muy horizontales, porque las aplicaciones luego de los análisis van a variar según las sustancias, pero según las matrices, según las áreas de trabajo, van a tener una variación en un determinado continuo.

Aquí, este siempre me encantó este pintor, artista, su seer, que aquí muestra cómo la transformación de un pájaro se va transformando en barco, en pez, y termina en caballo, o viceversa. O sea, básicamente lo que estamos diciendo cuando hablamos de aplicaciones, que a veces las aplicaciones en un área se centran en el fondo en la matriz, por ejemplo, en lo blanco de esta imagen, y otras veces se centran en lo negro, en el producto en particular.

Este, claramente, el ejemplo lo voy a desarrollar con este ejemplo de los antibióticos. Los antibióticos son, si ustedes se lo plantean, es un problema de la industria farmacéutica, es un producto farmacéutico desarrollado para combatir enfermedades e infecciones, y que aparentemente el área de aplicación analítica de análisis por HPLC de antibióticos sería la industria farmacéutica.

o todo lo relacionado a fármaco. Sin embargo, cuando nosotros buscamos en Sc Direct estas tres palabras: antibióticos, análisis y HPLC, nos encontramos con una enorme cantidad de papers, de los cuales tenemos una gran diversidad de áreas, de matrices, de aplicaciones diferentes.

Por ejemplo, tenemos aplicaciones en alimentos, orina, en la cadena de de animales, básicamente análisis de antibióticos. Bueno, vacas, pollo, con cerdo, etcétera. También podemos tener análisis de antibióticos en monitoreo de drogas, o sea, ya la clínica, básicamente de los fármacos. O podemos tener en muestras, por ejemplo, antibióticos en muestras oculares, lágrimas. No sé si acá sería este fármacos oculares o muestras fisiológicas en plasma humano. Esto también sería, por ejemplo, monitoreo de drogas.

Pero también tenemos en agua superficial. ¿Por qué? Porque los antibióticos están siendo uno de los contaminantes más grandes o más este de mayor impacto en las en las aguas en torno a la población. Los antibióticos, muchos no los ingerimos y los metabolizamos o no los metabolizamos y los eliminamos en la orina, heces, y eso termina en los sistemas acuáticos. Por lo tanto, los antibióticos son uno de los contaminantes indicativos a veces de contaminación por poblaciones, por centros urbanos humanos.

Entonces, el análisis de antibióticos no se centra en el fármaco básicamente. Simplemente el fármaco se enfoca de una forma en eh sistemas ambientales, se enfoca de otra forma en alimentos, se enfoca de otra forma. Las matrices cambian, las concentraciones cambian, los problemas cambian. Una cosa es dosificar un un preparado de un antibiótico donde se sabe que el antibiótico está ahí, que la concentración es alta. Y otra cosa es cuando uno busca en aguas superficiales, donde en principio no sabe si está, puede estar o no estar. Las concentraciones no sabe si son, pero generalmente son bajas y y entonces puede haber otras interferencias. No sabemos cuáles son las interferencias, con qué está acompañado ese antibiótico. Los problemas son diferentes.

Y entonces eh las herramientas analíticas se van especializando en una u otra opción. Por eso las aplicaciones, en resumen, lo que nosotros decimos que las aplicaciones cruzan horizontalmente muchas disciplinas, matrices y problemas. En el ejemplo de los análisis de antibióticos tenemos el área de la química y tecnología farmacéutica, la farmacología y la terapéutica, los alimentos y el medio ambiente como distintos áreas donde básicamente se hace análisis de antibiótico. Y las herramientas son las mismas, los métodos son especializados, pero son los mismos. Lo único que bueno, bueno, para algunas problemas se debe desarrollar o afinar la herramienta en un sentido y en otros en.

Yo de eso tomé un ejemplo. Nosotros seguir, no sé, estamos vamos a tratar de ser rápido con esto. Básicamente un ejemplo de ura donde se analiza en plasma 12 antibióticos betala. Este es una típica aplicación, una aplicación que qué implica. Desarrollar un método analítico para analizar una o varias sustancias que pueden estar o no. Nosotros si vamos a analizar plasma, a ninguna ser humano se le van a dar 12 antibióticos. Nadie va a tener un suero con 12 antibióticos. Pero lo que nosotros estamos desarrollando es una metodología de screening que nos permita en un suero de un paciente evaluar cuál antibiótico tiene ese ese paciente, cuál recibió o cuál este podemos detectar. Eso es lo que es una aplicación.

Nosotros vamos a probar en la aplicación de que el método separa estos 12 antibióticos y permite la identificación de cada uno de alguna forma. Cuando nosotros analicemos un el paciente, si si tiene alguno de estos antibióticos, vamos a obtener un pico y no 12, donde podamos ver que ese pico corresponde a uno de estos sustanci. Ese es el objetivo del desarrollo de la aplicación. Y el método básicamente lo que quiere hacer es ver que ese es un método seguro, que cualquiera lo puede usar en distintos laboratorios y que los resultados son confiables.

Entonces, y vamos a la parte experimental. Y vemos que lo que están usando básicamente es, bueno, HPLC. Es una columna C18, o sea, fase reversa. Aquí están diciendo que están usando una de 30 mm por 4 con 6. Esto y 2 con 5 micras de partícula de soporte de sílica r. Versa. Se acuerdan que la partícula es sílica, pero [Música] [Música] derivatization. La columna es tan corta, es de 30 mm, que tampoco es un largo estándar de columnas de HP. Pero bueno, vamos a seguir eh viendo cómo trabaja este. Esto va a trabajar en tres modos isocrático, o sea, que no tiene básicamente una sola eh técnica analítica, sino que tres. Prueba tres fases móviles diferentes, todas basadas en un buffer fosfato y aceton.

Aquí, bueno, básicamente el fosfato, como dije, siempre en una técnica robusta, siempre debe estar incluido. En este caso, los aminoácidos vemos que tienen los aminoácidos, perdón, betala tienen básicamente un grupo ácido y pueden tener o no un grupo amina. Pero aquí las los nitrógenos son amidas, o sea, que no son básicos. Pero aquí la ampicilina tiene una mina básica. O sea, este es típicamente una amino. Pero básicamente el buffer es indispensable. Y yo digo, aconsejo siempre usarlo, aunque sea una molécula neutra, porque uno puede tener situaciones donde otros componentes este sean ionizables y presenten problemas al cambiar el pH, interfieran diferentes y los pH son diferentes.

Bueno, este acá fíjense, típicamente la presión. Eso es un dato que generalmente los los paper no dan, pero es muy importante. La presión de la columna es de 700 s, o sea, aproximadamente 700 atmósferas. Eso es lo que nos está diciendo que este no es un sistema típico de HPLC. Los HPLC comunes, máximo, o sea, un un HPLC estándar puede llegar a 300, 400 atmósferas, especialmente hasta 600, más arriba de eso ya son sistemas tipo UHPS.

Bueno, después acá hablar. Bueno, la bomba está equipada con una bomba cuaternaria, un degaseador, un autosampler, el detector, un arreglo de di F 996. Tiene un arreglo particular. Los arreglos pueden ser 1024 [Música] 5502, pero este tiene un arreglo de 996 di. El flujo es de 1 ml por minuto. Este flujo, si se ven, no es común para este tipo de de diámetro de columna, pero sí cuando la partícula es más pequeña. Esto lo vamos a ver más adelante. Este es un flujo. Ah, no, perdón, pero la columna es de 4.6 mm de diámetro, o sea, que sí es un flujo estándar para para columnas de HPLC. Podría ser un flujo mayor. Ya ya lo vamos a.

Y monitorean a tres longitudes de onda. ¿Por qué? Bueno, esto es lo que ellos obtienen un poco como resultado. Obtienen, bueno, el tipo de fase móvil que utilizan para cada uno de los antibióticos, la longitud de onda con que van a medir cada uno de esos antibióticos y los tiempos de retención de cada uno de esas sustancias. Yo les pregunto aquí, estos tiempos de retención, ¿los puedo obtener en mi análisis? Bueno, cuidado. Los tiempos de retención no son extrapolables de una referencia de literatura a nuestro análisis. Aún cuando podamos reproducir el análisis con la misma columna y las mismas condiciones, los equipos pueden darnos con tiempos de retención distintos. Las columnas nunca son exactamente iguales, aún cuando la marca sea la misma, sea el tiempo de retención aquí es indicativo y relativo. Básicamente, si usamos esta misma columna de fase reversa 6, la misma marca, el mismo tipo, modelo de columna, podríamos tener este orden de elusión y estos órdenes de tiempo de retención. Si usamos otra marca de columna, los tiempos de retención van a ser totalmente distintos y pueden tener, podemos tener inversiones o alteraciones en el orden de la elusión. O sea, los tiempos de retención los tenemos que confirmar con estándar siempre en HPLC. Muchas veces también FC vamos a trabajar con estándares de los de los analitos para establecer eh la la identidad de los mismos. O sea, que la tabla es ilustrativa, pero es relativa.

Bueno, esto es un poco el tratamiento de de la muestra. Aquí dice que al plasma le agregan un estándar interno. ¿Por qué se agrega un estándar [Música] interno? No sé eso cuánto lo vimos en las clases, pero el aquí la función de un estándar interno es muy importante para eh evaluar la robustez del del método de preparación de la muestra, o sea, para ver si nosotros mediante este método que aquí se describe recuperamos completamente los analitos que hay en la matriz original. Entonces se agrega una cantidad conocida de un estándar que una vez terminado nosotros que tenemos que recuperar completamente y en función de esa recuperación también podemos usarlo para cuantificar a veces en forma relativa los otros componentes. O sea, nos va a servir para esas dos funciones, para una eh cuantificación relativa a a ese estándar interno y para evaluar el proceso de eh preparación de la muestra de extracción, recuperación de los analitos.

Bueno, aquí dice que el sobrenadante, bueno, se le agrega a la al plasma que lo centrifugan, no en algún momento. Los plasmas generalmente va se le agrega acetonitrilo. Eso produce básicamente la precipitación de proteínas. Siempre que trabajemos con este tipo de muestras biológicas, lo primero para trabajar en HPLC es tratar de sacarnos la proteína, pues la proteína luego si no empieza a quedarse en el en la columna, a quedar retenido en la cabeza de la columna y nos termina obstruyendo las columnas o haciendo que esta columna levante mucha presión. Luego eh ese sobrenadante se se le agrega cloroformo y se extrae eh con una partición cloroformo acetonitrilo, donde qué es lo que estamos haciendo aquí. Dónde quedan los antibióticos. Nosotros teníamos plasma que es acuoso, le agregamos cloroformo, separamos este y agregamos acetonitrilo y hacemos una partición. Vamos a tener una fase orgánica con cloroformo y una fase acuosa con acetonitrilo. Los antibióticos van a quedar en la fase acuosa porque vimos que son moléculas muy ionizables. Por lo tanto, este tratamiento con cloroformo lo que busca es separar la parte lipídica, que generalmente también es otra interferencia que eh obstruye el las columnas. Los lípidos en fase reversa tienen a quedarse muy pegados a las columnas y perjudican a la larga las columnas. Entonces, básicamente es una limpieza de la muestra lo que se está haciendo. Y finalmente lo que vamos a inyectar en la fase acuosa y con acetonitrilo es para concentrar, para eliminar interferencias lipídicas y de proteínas a la muestra. La alícuota de la fase acuosa se transfiere a un vial y bueno, esto es lo que se va a analizar.

Aquí muestran análisis donde básicamente lo primero que que miran, perdón [Música], es blancos con el suero para ver que no haya interferencias con los productos que se van a analizar. Y aquí claramente hay un pico en el suero donde tenemos que eso sería una interferencia. O sea, nuestros analitos no pueden caer aquí porque van a caer sobre algo que está presente en los sueros y no pudimos sacar. No es un lípido, no es una proteína. Y estos son los análisis. Ven a distintas longitudes de onda para evitar eh bueno, las interferencias, para aprovechar donde tenemos, por ejemplo, aquí a esta longitud de onda vemos este pico. A esta longitud de onda no lo vemos. O sea, esta este antibiótico lo tenemos que determinar a esta de este en verde que sale entre medio de de esto. Y tenemos que asegurarnos de [Música] que longitud de onda no sale. Entonces vemos que la interferencia aquí es menor. Este pico sería la interferencia. Y entonces aquí tenemos otro anti. Y por eso básicamente ellos están estableciendo tres longitudes de onda porque no consiguen una longitud de onda adecuada para todos los componentes.

Bueno, otro tipo de aplicación. No sé qué hora es, ya va. Vamos a hacer nada más que este detalle. Ustedes básicamente después lo pueden ver. Otra aplicación sería en el en el área que estábamos hoy de medio ambiente, la cuestión de pesticidas o derivados de carbamato. Y que aquí nos planteamos un ejemplo sobre derivados de carbamato y carbamato básicamente es este grupo funcional y derivado de urea es este grupo funcional. Entonces todos estos forman un grupo de pesticidas bastante extendido y que una aplicación busca eh bueno, básicamente detectar los mismos. Esto lo podemos analizar por HPLC o GC. La primera pregunta que nos podemos hacer y básicamente estas moléculas son tamaño pequeño y en principio no son ionizables. O sea, no reconocemos ningún grupo así francamente iónico o ionizable. Son amidas, derivados de urea, tienen halógeno. Por lo tanto, este tipo de de de pesticidas podrían ser analizables por GC y también por HPLC, porque básicamente reconocemos que la HPLC se puede usar para por los cromóforos que que presentan las sustancias o por detectores el tipo universal que también los hay en HPLC. O sea, que aquí hay un caso en que no es [Música] eh completamente definido la técnica que tenemos que utilizar. Generalmente el GC es una técnica mejor en el término de que tiene mejor resolución que HPLC para problemas de mezclas complejas. Entonces prácticamente alta cantidad de técnicas para para este tipo de aplicaciones van a ser diseñadas por por GC y más si podemos usar detectores específicos como detectores de nitrógeno, halógeno, que podríamos utilizar en esta situación.

Bueno, después esto se los dejo para que ustedes lo miren, porque no nos pasamos el tiempo. Acá hay algunas preguntas. Acá hay una observación que yo quería hacer de un ejemplo. Estos son ejemplos de de sacados [Música] de de catálogos, columnas y esas cosas. Son ejemplos generalmente muy muy comerciales, pero le quería mostrar algo que observando sobre básicamente sistema de HPLC donde básicamente tenemos un gradiente. Fíjense los anchos de los picos. En un un gradiente, los gradientes no tienen como objetivo aumentar la resolución, generalmente la resolución la disminuyen porque lo que hacen es juntar los picos. Pero otra cosa que hacen es variar los anchos de los picos y hacer que los los picos tengan anchos más finos que los que tendrían si fuera una un análisis isocrático. Y fíjense aquí cómo se observa bien ese fenómeno, donde los anchos de estos picos que no no son muy impactados por por el gradiente son mayores que estos finales, donde el gradiente los ha impactado más. Entonces el ancho de los picos en un gradiente está controlado mucho por el por el gradiente y la resolución puede ser generalmente menor o mayor si realmente se afinan tanto los los picos que el valor de resolución sube. Pero en un gradiente la resolución sube o baja dependiendo del gradiente de la mezcla que nosotros practiquemos. Lo que recuerden siempre que el gradiente lo que busca es acercar, o sea, tener tiempos de retención menores con los componentes más retenidos de una mezcla y se aplica a mezclas complejas o o con diversidad de hidrofobicidad o de fuerza, tiempo de retención de los analíticos de los an.

Acá miren ustedes cómo afectan después distintos. Acá tienen dos series, básicamente si bien es es como una serie única, aquí tienen por la variaciones estructurales dos series de de compuestos que ustedes pueden ver como en el orden que salen, cómo afecta eh los cambios estructurales la retención de los analitos. Eso generalmente no es fácil de adivinar, salvo en estos casos donde hay una serie de que la estructura se mantiene constante cambiando solo un grupo funcional en la molécula, ahí uno puede sí predecir un poco el orden de elusión. Si son moléculas de estructuras diferentes, la única predicción que uno puede establecer es en base a los log D o log P de las moléculas.

Bien, bueno, y la final quería mostrarles es que cuando la complejidad es mucho mayor, cuando tenemos este tipo de caso donde podemos tener cientos de pesticidas, cientos de analitos o de moléculas en una muestra, la identificación se hace muy compleja porque muchos no los podemos finalmente separar. No hay gradiente que nos permita o nos asegure separar todos los analitos y entonces la identificación resulta este comprometida. Para lo cual, lo que vamos a ver en la segunda parte del curso es los detectores de masa. Nos brindan una mano muy importante. Aquí tenemos un ejemplo donde analizan cientos de de de pesticidas en una corrida muy rápida con unas resoluciones fantástica de tipo cromatografía gaseosa, pero esto es un UHPLC y el detector de masa nos brinda una separación este extra, una separación ortogonal además por la masa de los iones que nos permite ver dentro de una masa o una mezcla que de de analitos que celu Identificar y cuantificar un componente particular. Todos estos picos de distintos colores son pesticidas que pueden ser identificados y cuantificados en una misma corriente. Y esto es una de las razones por las cuales para este tipo de problemas la espectrometría de masas es la técnica de obligatoria a la que uno debe recurrir para para solucionar esa situación. Obviamente, en ninguna es de esperar que ninguna muestra, por ejemplo, de agua pueda tener estos 200 pesticidas en la muestra, pero va a haber tres o cuatro y esos tres o cuatro uno los tiene que identificar con con total seguridad. Entonces, si no puede ser de que dudemos en si no sale en este tiempo de retención, cuál de los cuatro o cinco pesticidas que hay aquí a este tiempo de retención es el que está presente. Eso el masa lo lo puede definir.

Bueno, no fue tan interactivo como [Música] podríamos esperar, pero este ya fuera de hora, si quieren hacer preguntas, tenemos, no tenemos restricción de tiempo para para contestar. [Música] Preguntas. Hola, ¿están ahí? ¿Hay gente todavía? ¿Está está claro? ¿Fue claro? Bien, preguntas que les hayan surgido de las clases. Bueno, más o menos por los foros hemos ido viéndolas, pero si tienen alguna de ahora de lo que dijimos o de lo que quieran plantear, es el momento. No es difícil, todos a la vez. No, por favor. O sí, porque está difícil de de contestar todo así. Bueno, si no tienen dudas, no pasa nada. Bueno, esto los ejemplos de aplicaciones, sobre todo la idea que se tienen que llevar básicamente cuando después nosotros preguntemos o les [Música] propongamos prueba una pregunta examen parcial, ¿cómo diseñaría un análisis, una técnica para analizar, por ejemplo, los pesticidas derivados de la urea? Tengan la idea esa que la aplicación no es realizar un análisis donde van a estar todos los analitos, sino que es una un análisis que permita cuantificar e identificar cualquiera de ellos en una muestra dada. Y entonces lo que tenemos que asegurar es que bueno, el método separe las sustancias, las permita cuantificar y las permita identificar [Música] confirmar. Y siempre este tipo de de análisis dirigido está basado en estándares, estándares de las propias sustancias o estándares internos o estándares específicamente diseñados para esto. Van a ver que en espectrometría de masa se usan muchos estándares que son los compuestos marcados isotópicamente, o también se pueden usar estándares internos de moléculas similares, o sea, por ejemplo, de estos antibióticos estamos hablando de 12 antibióticos, puede haber un treceavo de antibiótico muy similar que se use de estándar interno o que que solo se que no se pueda usar uso humano, sino que es algo que se usa como estándar, o a veces alguna sustancia similar. Pero siempre los métodos cromatográficos siempre son métodos [Música] relativos.

Bueno, estamos siguiendo con subiendo, ya empezamos a subir las clases de cromatografía gaseosa y si el sistema de de que pregunten a través de los foros lo estamos tratando de mantener lo más este ágil posible, pero traten de seguir las clases más o menos en ritmo y vayan preguntando a medida que surgen las dudas, no dejen para la última semana previa al parcial, porque ahí todo se complica. Todo bien. Nos vemos en la próxima, en la próxima zoom. Supongo que va a estar a cargo de Eduardo o de Natalia. No está ninguno de los dos para hacerlo, así que los podemos cocinar tranquilamente, pero va a ser sobre cromatografía gaseosa básicamente. Bueno, muchas gracias. Gracias, hasta luego.