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Hola a todos. Vamos a hablar sobre los clústeres de diferenciación que los vamos a ver mucho en el tema de leucemias.
La designación clúster de diferenciación o CD se refiere a las proteínas de la superficie celular. A cada molécula una se le asigna una designación numérica diferente, lo que permite identificar los fenotipos celulares. La expresión superficial de una molécula CD en particular puede no ser específica de una sola célula o incluso de un linaje celular. Sin embargo, muchas son útiles para la caracterización de fenotipos celulares. Se han identificado más de 350 marcadores individuales y únicos. Los CDs específicos han sido útiles para determinar las funciones de las proteínas y para identificar su distribución en diferentes poblaciones celulares. También se han utilizado para medir los cambios en la proporción de células que portan esos marcadores en pacientes con enfermedades.
¿Qué tendemos como clúster de diferenciación? CD son antígenos de la superficie celular de todas las células que pueden ser reconocidos por anticuerpos. A medida que las células maduran, expresan diferentes receptores de proteínas en la superficie celular, lo que puede ayudar a determinar el tipo y la etapa de maduración de las células examinadas.
¿Qué propiedades presentan estos marcadores? Bueno, son proteínas o marcadores de antígenos. A un marcador de superficie se le asigna el número CD cuando dos anticuerpos monoclonales se unen a él y los números designados son arbitrariamente. Los antígenos CD sirven como receptores y ligando si regulan la señalización celular. Y en algunos casos los antígenos CD son expresados solo en determinados estadíos de diferenciación o bajo ciertas situaciones. Entonces, por ejemplo, como vemos en esta figura, tenemos la stem cell, que específicamente se le asigna el CD 34, es la es el marcador de superficie que identifica a la stens y así sucesivamente. por ejemplo, me está mostrando los granulocitos, los monocitos, los linfocitos T, los linfocitos B y las y las plaquetas, cada uno con su marcador. ¿Qué presentan estas células? un marcador específico que es el CD45 que se llama pan leucocitario, o sea, que todos los leucocitos presentan el CD45 como marcador eh específico. Y después, por ejemplo, los granulocitos presentan CD15, los monocitos CD14, los linfocitos T CD3, los linfocitos B CD19 y las plaquetas CD61. Y así, por ejemplo, los linfocitos T helper. van a presentar el CD45, el CD3, pero también otra molécula que es el CD4. Eh, y los eh linfocitos T supresores van a presentar el CD45 porque está en todos los leucocitos y van a presentar el CD3 también presente en su superficie y las los linfocitos T activados van a expresar también el CD25. Entonces, los linfocitos B van a presentar esta proteína de superficie que es el CD19. Las células NK, el CD56, los monocitos y macrófagos, el CD14, las células dendríticas, CD1C y los linfocitos T expresan CD4 o CD8 y CD3.
Aquí tenemos los marcadores específicos de algunos de los marcadores específicos de estas células. El linfocito B va a presentar el CD19 CD20. Los linfocitos T CD4 CD CD4 o CD8 y CD3. Las células dendríticas CD11C, CDB 123. Las células NK CD56. La stem va a ser CD34, macrófago CD14, los monocitos CD3, plaquetas CD41, CD61 y CD62 que corresponden a las glicoproteínas de la membrana. los eritrocitos, el CD235A que corresponde a una de las proteínas de superficie del eritrocito. Galulocitos CD69B 66B, la célula endotelial el CD 146 y la célula epitelial SD 326. Así vemos como la mayoría, o sea, todas las células del organismo van a presentar un marcador específico de superficie que corresponde a un antígeno al que para nosotros identificarlo le vamos a añadir un anticuerpo que va a unirse a este antígeno y lo va a poder identificar.
Entonces, el inmunofenotipo, que es lo que nosotros usamos para hacer la determinación, se define como la caracterización de determinadas células en una muestra basándose en la identificación de antígenos de superficie o intracelulares mediante el uso de anticuerpos dirigidos contra dichos antígenos. Es una técnica de suma importancia al momento de analizar poblaciones y subpoblaciones celulares, adquiriendo particular protagonismo la valoración de enfermedades oncohematológicas como las leucemias y los linfomas.
Entonces, ya lo hemos visto a esto, ya lo vimos en en la clase de eh de citometría, pero simplemente para eh para mostrar como ejemplo y para recordar un poco este tema, ¿no? Nosotros tenemos nuestra nuestra muestra, una sangre, por ejemplo, en la que se tiene que separar y se tiene que preparar esta sangre para poder ser analizada por el citómetro. se le agrega un anticuerpo fluorescente a la muestra y un marcador de superficie. Luego se se coloca en el equipo, se adquiere la la eh la información porque un láser va a incidir sobre estas células y va a excitar las células y provocar que este fluocromo eh sea evidente en la superficie y luego esto va a ser transmitido a un software que va a poder captar y diferenciar las células dependiendo del marcador que haya presentado en su que haya aparecido como positivo en su superficie.
Entonces, nosotros tenemos eh una de las características de el inmunofenotipo y que nos permite a nosotros analizar las muestras es lo que denominamos la estrategia del gating para identificar, por ejemplo, en este caso, las células T CD4 positivas y las las T CD8 positivas por citometría de flujo. Entonces tenemos un primer paso que es la identificación de los leucocitos porque van a ser todos CD45 positivos. Y vemos acá a la izquierda que se grafican las células según la dispersión lateral eh o side scatter y la fluorescencia para CD45. Las células CD45 positivas, que son todos los leucocitos, se seleccionan en el en la puerta uno, en el gate un. Por eso decimos gating. Buscamos una puerta de células, identificamos todas esas células, en este caso como CD45 positivas, excluyendo así otras poblaciones celulares que no son pleucoitarias.
Luego, eh dentro de esta estrategia de identificación va a ser la selección de las células T, que van a ser CD3 positivas, que se observa en el panel central. Solo se muestran las células que pasaron por la puerta uno, por el gate 1 y aquí se grafican según la fluorescencia para CD3 y otra variable y seleccionan se seleccionan las células D3 en esta puerta 2 o gate 2. Esto permite aislar las células T del resto de todos estos leucocitos que eran CD45 positivos.
Un nuevo paso se hay que diferenciar las subpoblaciones de células CD3 positivas que van a ser los CD4 y los CD8 que se observa en el siguiente panel y se grafican las células CD3 que están en el la puerta dos según la fluorescencia para CD4 y para CD8. Esto genera cuatro cuadrantes. En el cuadrante superior izquierdo van a ser las aquellas que son CD4 positivos, pero CD8 negativos, que son eh vamos a ver que son las células T helper. En el cuadrante inferior derecho van a ser la CD4 negativos y CD8 positivos, que son las células tes citotóxicas. En el cuadrante superior derecho, las CD4 positivas y CD8 positivas, que es una población doble positiva, que es menos frecuente observarlo en sangre periférica. y en el cuadrante inferior izquierdo CD4 negativa y CD8 negativa, que son las células T doble negativas. Este procedimiento de gatin podemos identificar primero los leucocitos y luego las células T CD3 positivas y finalmente separa las subpoblaciones CD4 y CD8 para distinguir las T helper y citotóxicas. Como recordamos las células, los linfocitos en este caso van a ser CD3 positivos y van a ser CD4 o CD8 positivos. y ahí nos va a permitir diferenciar una célula de otra.
¿Cuáles son las aplicaciones clínicas de la utilización de los CDs? Bueno, el análisis de leucemias y linfomas. En las leucemias y linfomas se expresarán un conjunto específico de marcadores dependiendo de la etapa y de la vía de diferenciación. Por ejemplo, las células CD19 positivas van a ser por un lado los linfocitos, ¿no? Que pueden ser CD5 positivas, se va a utilizar otro marcador para poder identificarlas o CD5 negativas, aquellas que completan un cuadro de eh con otros marcadores como el CD20, CD23, SD22, el CD79B y eh el FMC7 y las inmunoglobulinas de superficie. Entonces, la presencia de estos marcadores, aparte del CD5 positivo, me va a hablar de una leucemia linfocítica crónica. Y eh en el caso de que estos marcadores tengan otra disposición, o sea, otra positividad o negatividad, me permite diferenciar las células como células de linfoma del manto. Y cuando el CD5 es negativo, pueden ser CD10 positivos, o CD10 negativos. Y si son CD10 positivos, van a ser niforular. Y si son CD25 positivos y CD10 positivos, van a ser va a ser el el linfoma o las o la leucemia de las células peludas y si es CD5 negativo, el linfoma de la zona marginal. Simplemente como ejemplo nada más para que veamos cómo estos marcadores nosotros vamos marcando las células y vamos avanzando, porque yo procedo de identificar primero qué célula está presente a través de un marcador. Sé que si este marcador está está presente es un linfocito, por ejemplo. Entonces después utilizo otros marcadores. Y si estoy tratando de diagnosticar una leucemia, voy a tratar de tratar bien de buscar qué tipo de leucemia es determinados grupos de reactivos, por así decirlo, que se utilizan para eh los distintos tipos de de leucemias, que eso también lo vimos en la clase de de inmunofenotipo, que ahí lo lo pueden ver bien claro.
La detección de la enfermedad residual medible o o residual mínima, como se llamaba antes, en la inmunoterapia, en el recuento de células madres, las células madres hematopoyéticas en la médula ósea se pueden identificar por la expresión del CD34 y estas células en médula ósea es bajo y prácticamente nulo en sangre periférica. Eh, sin embargo, si se estimula la movilización de células CD4 positivas de la médula, se puede obtener células madre tanto de la sangre periférica como de la médula.
En el trasplante de órganos compatibilidad celular permite realizar la prueba de compatibilidad entre el suero del receptor y los linfocitos del donante. El análisis de los linfocitos de la sangre periférica puede ayudar a detectar un rechazo precoz en inmunodeficiencias. Las inmunodeficiencias primarias pueden ser consecuencia de defectos de linfocitos T, linfocitos B, granulocitos o monocitos y muchas enfermedades, las proteínas de superficie o citoplasmáticas están ausentes o presentan una función alterada y se pueden identificar mediante inmunotipno inmunofenotipo y la selección de anticuerpos se basa en la presentación clínica.
En los pacientes VIH para determinar el número de linfocitos CD4 positivos en sangre periférica y se utiliza para monitorizar estos pacientes. Y el porcentaje de célula CD4 se puede obtener en un solo tubo mediante la eh tinción para CD45, CD3 y CD4.
En la hemoglobinuria paroxística nocturna, los leucocitos y eritrocitos producidos son disfuncionales y susceptibles a la lisis. Y el análisis de esta anomalía clonal mediante de flujo, pues se puede realizar analizando CD55 y CD59 de los eritrocitos.