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Il trasporto di molecole dal citoplasma al nucleo è un casino e oggi proviamo a capire nel dettaglio molecolare. Quali sono le leggi e le ragioni che guidano il trasporto di proteine dal citoplasma al nucleo e dal nucleo al citoplasma? E il processo detto di importino sportine guidato dal gradiente di Run? Capiremo tutto nel video.
Allora, per orientarci un attimo, dato che richiederà un po' di sforzo, dobbiamo immaginare qui di avere una la membrana plasmatica formata da un doppio strato fosfolipidico. Ti dico questo perché ovviamente lo sai, ma sarà importante per confrontarla con la membrana nucleare. Infatti, qua c'è il citosol, la membrana citoplasmatica di mestiere separa lo spazio extracellulare dal citosol, separa i due componenti, i due compartimenti. Ma non solo, noi sappiamo che le cellule eucariotiche, a differenza di quelle procariotiche, sono delle cellule che contengono compartimenti membranosi. Infatti, vi è il nucleo. Il nucleo è questa regione che contiene all'interno la cromatina e il nucleolo. Il nucleolo è la regione di spazio dove si ha la sintesi degli RNA ribosomiali, gli rRNA. Invece, questa qui in verde è la cromatina, che si divide in due territori, due regioni: l'eucromatina, in cui gli istoni sono separati tra di loro in nucleosomi, meglio, sono separati tra di loro e vi è azione trascrizionale, attività trascrizionale, mentre l'eterocromatina è quei territori compatti in cui vi è repressione dell'espressione genica a causa del compattamento dei nucleosomi.
Ora, ti dico questo perché lo spazio nucleare, detto nucleoplasma, come il citoplasma e lo spazio citosolico, mentre l'interno del nucleo si chiama il nucleoplasma, è separato dal citosol non da una, ma da due membrane. Queste due membrane sono la membrana nucleare esterna e la membrana nucleare interna. Ora, queste due membrane vengono tra loro in contatto attraverso, diciamo, delle giunzioni e formano insieme alle altre giunzioni controlaterali un poro. Cos'è un poro? È una regione, eh, fondamentalmente vuota, che potenzialmente potrebbe mettere in connessione libera il citosol col nucleo, col nucleoplasma. Ma questo non avviene perché? Perché il poro nucleare, che ha un diametro circa di 120 nanometri, è, diciamo, ehm, è sì, all'interno di un poro nucleare si trova una un complesso proteico che si chiama NPC o complesso del poro nucleare, di cui adesso vediamo nel dettaglio la struttura.
Ora, il complesso del poro nucleare, che mestiere ha? Ha la funzione di permettere di controllare, ok, di controllare, di regolamentare il flusso di proteine dal citoplasma al nucleo. Infatti, dal citoplasma al nucleo, dal citoplasma al nucleoplasma possono fluire attraverso questo complesso del poron nucleare NPC, in inglese Nuclear Pore Complex, possono fluire liberamente ioni e piccole molecole. Quindi, qui ti ho rappresentato una cosa. Allora, gli ioni calcio e sodio, banalmente, possono fluire tranquillamente. Da dove? Dal citoplasma al nucleoplasma. Il calcio, per esempio, può derivare dallo spazio extracellulare e dal reticolo sarcoplasmatico, per dire. Il sodio può derivare dall'apertura di canali ionici. Oppure, cosa abbiamo qui? Qui è interessante perché abbiamo l'acetilenzima, l'acetilenzima A. Tu ti chiederai, ma non deriva soltanto dalla conversione del piruvato, del dalla dalla conversione del piruvato in acetilico enzima nel mitocondrio? No, perché sappiamo che l'acetil coenzima viene anche prodotto nel citoplasma dalla conversione del citrato in acetilo enzima e oster.
Allora, comunque, che ruolo ha questo acetilico enzima? Oppure anche questo altro metabolita, la S-adenosilmetionina? Oppure questo, cos'è il lattato? Questi tre metaboliti, ad esempio, possono fluire secondo gradiente di concentrazione attraverso il complesso del poron nucleare in maniera libera. Infatti, vedremo che non è proprio un trasportatore, ma è un complesso proteico. Queste tre molecole che ti ho rappresentato sono chiave non solo nel metabolismo energetico, ma anche soprattutto e soprattutto l'S-adenosilmetionina nei processi di regolazione dell'espressione genica. L'acetil coenzima, esempio, è chiave nei processi di di acetilazione degli istoni. Questo è il gruppo acetile che acetila i residui di lisina delle code istoniche, permettendo di decompattare i trascritti e le RNA polimerasi al DNA. Invece, la la S-adenosilmetionina, che deriva dal ciclo dei folati e dei metili nel citoplasma, trasferisce questo suo gruppo metilico dove? Sempre più o meno agli stessi residui aminoacidici delle code istoniche della dei nucleosomi e questo permette, attraverso il reclutamento di adattatori, di compattare la cromatina. Mentre il lattato, si è visto che deriva dalla, sappiamo bene che deriva dalla riduzione del piruvato, però il lattato può avere anche un ruolo un po' dibattuto nei processi di anche qui modificazione degli istoni in un processo noto come l'attilazione.
Tutto questo, questa menata per dirti che in realtà il il nucleoplasma, ma non è una regione così, diciamo, eh, così diversa dal citoplasma, o meglio, così protetta rispetto al citoplasma, ma proteine di grosse dimensioni che vengono prodotte dai ribosomi citosolici, è qui che ti ti volevo, prodotti dai ribosomi citosolici, ecco, per entrare nel nucleoplasma hanno bisogno di una particolare classe di proteine. Bene, ora immaginiamo di zoomare su questo complesso del poro nucleare e vediamo che cosa succede. Allora, ci ci troveremo più o meno in una condizione del genere. Ok, allora questo qui che cos'è? Cosa vediamo? Vediamo qui la membrana nucleare esterna, che ti facevo vedere prima, quella che si affaccia sul citoplasma. Questa è una visione più o meno tridimensionale. Qua c'è il citoplasma, qui c'è la membrana nucleare interna e qui c'è il nucleoplasma. Questo spazio si chiama spazio perinucleare, tra le due membrane. Guarda, è molto simile a un mitocondrio. Sappiamo che in un mitocondrio abbiamo una membrana mitocondriale esterna in contatto col citoplasma e una membrana mitocondriale interna in contatto con il mitoplasma, cioè quella regione in cui si trovano solubili, per esempio, i substrati e gli enzimi del ciclo di Krebs, per dire.
Ora, la differenza però chiave qual è rispetto e questo è importante rispetto alla alle membrane mitocondriali? Che qui la membrana mitocondriale interna e quella esterna a livello del poro nucleare si fondono tra di loro, si fondono in questa giunzione e le due, diciamo, queste due giunzioni separate delimitano un poro che viene occupato dal complesso del poro nucleare, che adesso analizziamo tra un attimo. Allora, quello che ti voglio far vedere, che io non avevo capito molto bene, che non avevo mai capito in realtà, è come si fondessero queste membrane. Molto semplice, in realtà. C'è una membrana nucleare esterna che non è un singolo strato, ok, come ad esempio avevamo visto nella goccia lipidica negli adipociti, no, in cui, se ti ricordi, l'abbiamo visto, in cui c'è una un'unica goccia lipidica, un unico droplet. Invece, in questo caso, c'è un doppio strato fosfolipidico, una classica membrana, però ha una particolarità, perché questa è quella esterna che si affaccia sul citosol, questa si affaccia sul nucleoplasma, quella interna semplicemente cambia interno esterno per la localizzazione, ma si uniscono queste membrane, ok, e continuano tra di loro, curvano. Bene, e questo è il poro nucleare, pari a circa 120 nanometri, una cosa del genere, ok? E lo spazio, diciamo, le due membrane insieme vanno a formare quello che si chiama involucro nucleare, che separa il citosol del nucleoplasma.
Ora, un concetto chiave, un po' di struttura su come funziona questo nucleoplasma, come su come funziona questo complesso del poro nucleare. Vediamo. Allora, abbiamo, intanto, si dice che ha una simmetria ottaedrica. È semplice, guarda, questa è una visione dall'alto, visione dall'alto, perché ritroviamo che cosa? Questo è il citosol e qui ritroviamo queste regioni, su da, ci torneremo, che si chiamano fibrille citosoliche. Le fibrille sono delle regioni delle proteine disordinate. Ora, questo è un concetto importante. Le proteine hanno la caratteristica di avere, ovviamente, una sequenza aminoacidica primaria, no, dove abbiamo un amminoacido in serie all'altro, i quali però poi assumono forme secondarie, strutture superiori a causa di interazioni deboli, i quali poi si vanno a strutturare in strutture terziarie. Bene, esistono però delle regioni di proteine che sono dette regioni disordinate, regioni disordinate o non strutturate, vuol dire che non assumono una struttura tridimensionale definita, hanno più che altro una struttura fibrillare, una struttura disordinata, una struttura lineare. E vediamo oggi che nel complesso del poro nucleare questa struttura disordinata ha una funzione, ha una funzione. Quindi, nonostante sia disordinata, non abbia una struttura precisa, in questo caso vediamo che ha una funzione.
Ora, ti dicevo che ha una simmetria ottaedrica, perché come vedi, il il complesso del poro nucleare è formato, non te l'ho detto, da proteine che si chiamano nucleoporine. Ora, la simmetria ottaedrica, perché fondamentalmente queste porine sono otto, ok? E come vanno a formarsi? Allora, qui è un po' complicato. Ci sono all'esterno, se ti immagini la la membrana, diciamo, la membrana nucleare esterna e interna, quindi l'involucro nucleare, all'esterno, come una ciambella, all'esterno abbiamo le nucleoporine di impalcatura, quelle che contattano il nostro poro nucleare, quelle che fanno da bordo, ok? Poi si assemblano all'interno per formare proprio il poro, la vera sezione del poro, le citosoliche. Poi, però, abbiamo ovviamente le nucleoporine giù di qua, che sono le nucleoporine del nucleoplasma, ma sempre nucleoporine di impalcatura. Sono impalcatura perché vanno proprio a affacciarsi, vanno proprio a meglio contattare il poro nucleare, a delimitare, ecco, il poro nucleare e permettono che cosa? Beh, di aderire al poro nucleare. Questo avviene anche grazie ad altre proteine che si chiamano proteine di membrana dell'anello, che vanno a inserirsi su tutto il lo lo strato, diciamo, questo qua di giunzione e vanno a contattare le nucleoporine dell'involucro. Cioè, si forma un'impalcatura, un involucro. Poi all'interno abbiamo queste nucleoporine del poro. Poi, ovviamente, qui a livello del nucleoplasma abbiamo sempre le nostre nucleoporine del poro con delle fibrille. Queste fibrille, che sono sempre regioni disordinate, sono fibrille nucleari.
Quindi, il concetto qual è? Abbiamo un esterno che sono nucleoporine di impalcatura, all'interno nucleoporine del poro, sempre raggruppate, diciamo, in gruppi di otto, quindi simmetria ottaedrica si intende questo. Poi, però, abbiamo non solo delle regioni ordinate delle nucleoporine, abbiamo anche delle regioni disordinate che prendono il nome di fibrille, oppure anche banalmente regioni disordinate. Ora, che ruolo hanno queste fibrille? Allora, qui partiamo dalle nucleoporine del poro, perché alla fine, se ci pensi, abbiamo detto che gli ioni o le piccole molecole non hanno problemi a passare il complesso del poro nucleare. Chi ha problemi è il sono le proteine. Ok, adesso vediamo come avviene il processo. Ora, il punto, però, qual è? Tu tu quello che tu puoi pensare è questo: va bene, mi hai spiegato tutta cosa, tutta questa cosa del complesso del poro nucleare, ma alla fine, se io formo un canale acquoso tra, fondamentalmente, un un sì, un vero proprio poro acquoso tra il citoplasma e il nucleo, non cambia niente. Ecco, è vero, in realtà ci deve essere una membrana di diffusione che separa proprio il citoplasma dal nucleoplasma. E questa membrana è una membrana di diffusione non selettiva. Cioè, quello che ti voglio far capire, questo non funziona come un trasportatore, il complesso del poro nucleare, ma funziona così. Vi parlavo delle della struttura disordinata e ha questa, ed è molto importante, la struttura disordinata, diciamo, dei segmenti, dei domini disordinati delle delle nucleoporine del poro, si contattano tra di loro. Cioè, immagina proprio così, no? Tu hai, eccole qua, immagina che le mie mani siano le nucleoporine, quelle del canale, ok, che presentano dei domini organizzati e poi presentano, però, anche dei domini non organizzati, non strutturati. Questi domini non strutturati, eh, che appunto si chiamano fibrille delle nucleoporine del poro, le fibrille, domini non strutturati delle nucleoporine, che vanno a formare il centro del poro, si contattano tra di loro, ok, si prendono tra loro contatto. Ma perché? Qual è la ragione? Ecco, si è scoperto che le fibrille, sia delle nucleoporine del poro, che anche però delle nucleoporine di impalcatura, ovviamente, sia di quelle che affacciano sul citosol, che sul nucleoplasma, presentano dei residui, delle ripetizioni di fenilalanina e glicina. Cosa vuol dire? Ma prima di passare alle nucleoporine del poro, ti faccio vedere una cosa facile. Immaginiamo di prendere queste fibrille citosoliche e di zoomare un attimo e vedere qual è la sequenza aminoacidica. Tanto non sono ripiegate, no? Una conformazione lineare, non strutturata. Qual è la la sequenza? È facile: fenilalanina, glicina, fenilalanina, glicina e così via. Poi, ovviamente, queste ripetizioni sono, diciamo, separate da residui idrofili. Perché? Perché la fenilalanina e la glicina, alla fine, sono abbastanza idrofobici, soprattutto la fenilalanina. E tu dirai, vabbè, ma sti cavoli? È vero, ma adesso capiamo perché sono importanti queste ripetizioni. Abbiamo detto che sono presenti nelle regioni non strutturate che ritroviamo sia nelle nucleoporine di impalcatura, sia fuori che dentro, cioè sia nel citosol, quelle che affacciano nel citosol, che quelle che affacciano nel nucleoplasma, ma soprattutto sono rilevanti in queste nucleoporine del poro. Infatti, se noi zoomassimo qua e vedremmo che cosa? Che le le fibrille non strutturate del nucleoplasma, proprio una barriera. Immagina questo, in che modo forma la barriera? Intanto, allora, forma una barriera di diffusione detta tipo gel, gel-like, viene definita negli articoli, perché questo? Perché è una questione termodinamica e in realtà è facile. Guarda, abbiamo le sequenze di fenilalanina, glicina, fenilalanina, glicina e così via, sia in un dominio non strutturato di una nucleoporina del poro, sia nell'altro. Quindi, quelle che tra loro prendono contatto. E vedi cosa succede? Succede che formano, questa è una fenilalanina di una di una fibrilla del poro, questa è una fenilalanina di un'altra fibrilla della nucleoporina del poro, non la stessa, un'altra. E tra loro prendono contatto, un pochino come la è presente le zip, è uguale. Cioè, io ho due zip, ok? Immaginiamo che siano le zip, sono quelle separate, sono le le le le regioni non strutturate di due nucleoporine controlaterali, che però quando le avvicino e le avvicino perché si avvicinano per interazioni idrofobiche, le fenilalanine stanno tanto bene tra di loro perché sono idrofobiche e quindi escludono le molecole d'acqua. Questo forma un'interazione debole, ovviamente, tra di loro, però forma una barriera di diffusione. E cosa vuol dire? Vuol dire che io l'unico modo che ho, eccolo qua, il punto, per rompere questa interazione, qual è? Interagire idrofobico, cioè trovare un modo per riuscire a rompere questa interazione e fare in modo che rompendo questa interazione io lo faccio in modo energeticamente favorito. Ora, queste ripetizioni di fenilalanina, glicina, si trovano anche nelle nucleoporine di impalcatura, in particolare, come dicevamo, nelle regioni non strutturate delle nucleoporine di impalcatura del che si affacciano sul nucleoplasma. Una piccola differenza è che la le le fibrille citosoliche sono libere, come dei tentacoli, vengono definiti, esattamente come dei tentacoli, in realtà, mentre la nel nucleoplasma queste nucleoporine si vanno a strutturare, si, diciamo, si vanno a incontrare, a formare su una proteina di impalcatura, qui a formare quella struttura che si chiama canestro, un vero e proprio canestro da da basket, ok?
Ora, qui, quindi, questo è per ricapitolare questo concetto che è molto, molto importante. Qual è? Che abbiamo le nucleoporine che sono, hanno geometria ottaedrica, cioè si dispongono in in gruppi di otto, e abbiamo le nucleoporine di impalcatura, poi le nucleoporine del poro, sia quelle di impalcatura nel citosol e nel nucleoplasma, che quelle del poro, presentano sia domini strutturati che hanno una funzione, cioè, o meglio, che hanno una una struttura tridimensionale definita, però hanno anche una struttura non organizzata, non definita, non strutturata, appunto. Queste presentano, in particolare, tutti e tre i gruppi di fibrille citosoliche, nucleoplasmatiche e quelle del poro, presentano ripetizioni, sequenze di fenilalanina, glicina. Queste hanno una funzione biologica chiave. Vedremo, saranno in grado di contattare le proteine di importo ed esporto nucleare. In particolare, però, abbiamo capito una cosa: la barriera di diffusione che separa il citoplasma dal nucleoplasma è formata così, proprio dalla presenza di queste nucleo da queste nucleoporine, da questi domini non strutturati delle nucleoporine del canale, che si contattano tra di loro, perché alla fine, per effetto idrofobico, cioè le fenilalanine si contattano tra di loro ed escludono le molecole d'acqua.
Ora, per apprezzare ancora però di più il processo di trasporto nucleare, perché è quello di cui ci occupiamo, e è un altro, cioè gli attori alla fine sono tre: il complesso del poro nucleare con le sue ripetizioni di fenilalanina, glicina, che sono molto, molto importanti, la le proteine di importo ed esporto nucleare, adesso vediamo che si chiamano importina ed esportina, poi una proteina G, una piccola proteina G che si chiama Ran. Ne parleremo ancora molto. Adesso, ma per introdurla, sul nucleoplasma, cioè nel nucleoplasma abbiamo un'elevata concentrazione di una delle forme di Ran che si chiama Ran GTP. Guarda, in realtà è facile, perché Ran GTP, o meglio Ran, che cos'è? Ran è una è una proteina, è una proteina G, le proteine G, è una piccola proteina G. Le proteine G, perché si chiamano così? Si chiamano così banalmente perché contengono una tasca di legame per il GTP, un nucleotide. E nel nucleoplasma vi è un'elevata concentrazione di Ran GTP. Ora, perché vi è un'elevata concentrazione di Ran GTP? Perché, eh, perché una forma è Ran GTP, un'altra forma, però, è sempre Ran, che però lega il GDP, o meglio, qual è la differenza? Semplicemente che il GTP ha tre gruppi fosfato, il GDP ne ha due. Ora, per convertire il Ran GDP, il Ran GTP, cosa dobbiamo fare? Banalmente, spostare il GDP e inserire il GTP, facile, cioè dobbiamo scambiare questi nucleotidi. Ora, esiste una proteina che si chiama Ran-GEF, e GEF sta per cosa? Facile, fattore che scambia le guanine. Che cosa fa di mestiere? Le Ran-GDP, nella forma GDP, induce un cambiamento conformazionale, come se io avessi la mia Ran, che lega, scusami, se io avessi GEF qua, Ran-GEF, che induce lo scambio delle guanine, e qui avessi Ran-GDP, che all'interno della tasca di legame contiene il GDP. Ran-GEF che cosa fa? Vi si lega e induce un cambio conformazionale. Questo succede. Ora, Ran-GEF induce uno scambio conformazionale in Ran-GDP, Ran-GTP esce, e adesso entra Ran-GTP, perché entra Ran-GTP? Perché è in più alta concentrazione. Ora, la cosa importante, però, qual è? Come vedi, nel nucleoplasma, nel nucleo, vi è un'elevata concentrazione di Ran legato al GTP, e questo sarà importante per dopo. Nel citoplasma è il contrario, vi è un'elevata concentrazione di Ran-GDP, perché? Perché quando è presente, adesso vedremo perché è presente, quando è presente il Ran nella forma GTP, che abbiamo formato nel nucleoplasma, vedi, abbiamo formata nel nucleoplasma grazie a Ran-GEF, che ha scambiato il GDP con il GTP, quando Ran-GTP è nel citoplasma, viene subito, ehm, il GTP viene subito idrolizzato in GDP grazie a cosa? Eh, grazie al legame di una GAP. GAP sta per proteina che attiva l'attività GTPasica di Ran. Perché non ci detto una cosa? Che le Ran, come sono, fanno parte di una grossa famiglia, una grossa tribù di piccole proteine G. Questa tribù contiene Ras, famosissima nelle mutazioni del cancro, di cui parleremo, Rab, Rho, eccetera. In particolare, Rab e Rho controllano il citoscheletro, Ras, invece, controlla la crescita cellulare. Ran, invece, controlla l'importo e l'esporto. Ha, ha la caratteristica di idrolizzare, quando è da sola, comunque, il GT, cioè ha attività GTPasica intrinseca, però molto lenta, se la prende con calma, a differenza di Ras. Di conseguenza, quando Ran-GTP è presente nel citoplasma, per favorire questa attività idrolasi intrinseca, che lui comunque ha, o lei, non so, Ran, Ran, forse lui, cosa c'è? Vi si lega un'altra proteina che gli dà una mano, gli dà una spintarella. Vi si lega, infatti, Ran-GTP, e scusami, Ran-GAP. Vi si lega GAP, sta per proteina che attiva l'attività GTPasica di Ran. GTP, vi si lega, induce un cambio conformazionale che permette e facilita l'idrolisi del GTP in GDP. Di conseguenza, nel citoplasma avremo un'elevata concentrazione di Ran-GDP, mentre nel nucleoplasma avremo un'elevata concentrazione di Ran-GTP.
Ora, capiamo come mettere tutto insieme. Iniziamo da un processo. I processi che adesso vediamo sono due. Ora abbiamo messo i mattoncini e costruiamo questa casa, perché i processi di importo nucleare e, meglio, di trasporto nucleare sono due: l'importo, cioè dal citoplasma al nucleoplasma, e l'esporto di proteine. È proprio nel citoplasma, a livello dei ribosomi. I ribosomi sono quei macchinari molecolari complicatissimi ribonucleoproteici RNA che sintetizzano a manetta proteine. Queste proteine, però, hanno sia funzioni citosoliche, che extracellulari, e anche di membrana, ma hanno anche funzioni nel nucleo. Per esempio, un fattore trascrizionale. Per esempio, vogliamo importare un fattore trascrizionale nel nucleo. Perché vogliamo importarlo nel nucleo? Vogliamo anche che ci rimanga nel nucleo. E adesso vediamo, cioè, vogliamo fare due cose: nell'importo di un fattore trascrizionale, portarlo dal citoplasma, che è la sua sede di sintesi, attraverso i ribosomi, importarlo attraverso l'involucro nucleare e attraverso il complesso del poro nucleare nel nucleoplasma, e vogliamo anche che ci rimanga nel nucleoplasma, perché vogliamo che lì compia la sua funzione. Altri esempi: le proteine istoniche, per esempio, H2A, H2B, eccetera, sono proteine istoniche che formano l'ottamero istonico del nucleosoma. Le subunità di RNA polimerasi 1, 2, 3 e così via, tantissimi, i rimodellatori della della cromatina, di cui ti parlavo, le DNA transferasi, le Stone metil transferasi o le Stone ctil transferasi e così via, sono tutti proteine che hanno attività o strutturale, come fattori trascrizionali, o enzimatica, come i complessi di rimodellamento, che devono essere localizzati e devono rimanere proprio nel nucleoplasma. Infatti, le proteine che si sono evolute per avere una funzione nel nucleoplasma, nel nucleo, presentano una sequenza, si è visto, che si chiama NLS, NLS sta per sequenza di localizzazione nucleare, Nuclear Localization Sequence. Ed è una sequenza che si è visto si trova più o meno in regioni esterne esposte della proteina, regioni a loop, in particolare, la quale presenta una sequenza di circa 5-7 aminoacidi, dipende, ma è importante che siano arginine e lisine, perché? Perché è importante che siano cariche positivamente? Perché le arginine, le lisine sono cariche positivamente. Guarda la struttura, questa è un'arginina che presenta quattro azoti, questo è un immina, questi qua sono gruppi metilici. Qual è a pH citosolico, che è un pH più acido rispetto alla pKa di questi aminoacidi, cosa vuol dire in italiano? Vuol dire che questi aminoacidi tendono ad accettare protoni e cosa fanno? TAC, accettano un protone e si caricano positivamente, e pure qua accetta un protone e si carica positivamente, e così via, uguale qui la lisina. Di conseguenza, a pH citosolico, questa sequenza di localizzazione nucleare presenta una serie di cariche positive.
Ora, nel citoplasma è presente, però, anche una una classe di proteine che si chiamano importine, o meglio, per gli amici, importine. Questa in arancione, le importine, più tecnicamente, recettore di importazione nucleare. Facile, cioè un recettore specie capace di legare un'altra di importazione nucleare. O meglio, importine sono in grado di riconoscere e legare queste sequenze di localizzazione nucleare, semplicemente perché presentano una tasca ricca di aminoacidi acidi, carichi negativamente, che appena la NLS è esposta, loro, Z, vi si attaccano e si forma un complesso. Si forma un complesso binario, talvolta ternario, ma binario va bene, cioè di due strutture. Il cargo viene definito così in gergo, cioè la proteina da trasportare, nostro fattore trascrizionale, e la nostra importina. Questo, questa struttura binaria, questo complesso, adesso deve essere veicolato attraverso che cosa? Il complesso del poro nucleare. Cioè, la prima fase di importo nucleare, che cos'è? È l'impor, continua, o recettore di importazione nucleare lega il cargo, la nostra proteina da trasportare, attraverso il legame con NLS, che è una sequenza basica, e questo avviene nel citosol, ok? Questo complesso è solubile nel citoplasma. Ora, il complesso importina-cargo, importina e cargo, passa attraverso il complesso NPC, ok, il complesso del poro nucleare.
Ora, vediamo come avviene il processo. È un pochino complicato, perché? Perché, come ti dicevo prima, entrano in gioco le sequenze di fenilalanina, glicina, ma se abbiamo capito cosa servono e dove si trovano, ora è banale. Ripassiamo: queste sequenze si trovano a livello dei domini non strutturati, sia citosolici, che nucleari, che del poro. La prima cosa che succede è che si è visto che un dominio delle delle importine, un dominio, una tasca idrofobica, contatta dell'importina, che ti ricordo, legava il cargo, contatta che cosa? Le sequenze fenilalanina, glicina. E questo avviene come? Attraverso un'interazione idrofobica, banalmente. Cioè, immagina questo: immagina che questa qua sia una fenilalanina della nostra dominio non strutturato, che presenta normalmente una, quella che si chiama tecnicamente una shell, un guscio di idratazione. Eccolo qua, così. Bene, ora questa shell d'idratazione, che cosa fa? È abbastanza, entropicamente, termodinamicamente non favorita, perché noi sappiamo dall'entrare, però, no, sappiamo dall'entrare facilitato dal punto di vista energetico, favorito solo se l'entropia aumenta. L'entropia può essere definita come il disordine o gradi di libertà di un sistema. Ora, qual è il concetto? Il concetto è che se io ho una fenilalanina qua, libera di svolazzare nel citoplasma, per le fibrille citoplasmatiche, questa è in contatto con l'acqua citosolica, banalmente. Ora, cosa succede? Arriva, in arancione, bella, bella, guarda qua, arriva in arancione una fenilalanina qua della nostra importina, eccola qui, anch'essa, però, ovviamente, eh, diciamo, ok, anch'essa si trova, è un dominio idrofobico che però è esposto nel citoplasma, quindi anch'essa si trova con, diciamo, idratata dall'acqua, da questa shell di idratazione. Cosa succede? Prendono contatto e le molecole d'acqua in mezzo vengono escluse. Questo comporta che cosa? Alle due, diciamo, alle due fenilalanine, di venire in contatto. Eccole qua, quindi la fenilalanina della nostra importina e la fenilalanina del nostro dominio non strutturato. E l'acqua che stava in mezzo viene esclusa, quindi si disordina, si ha quindi un aumento dell'entropia del sistema a causa dell'esclusione di queste molecole d'acqua. Di conseguenza, questo contatto è, diciamo, entropicamente favorito. E questa è la ragione vera per cui la l'importina è in grado di trasportare con sé il cargo attraverso queste fibrille. Ora, questo contatto, però, come vedi, è un contatto debole, perché è un legame molto debole. Di conseguenza, secondo un modello, il modello, diciamo, che è preferito adesso, è questo, che le interazioni sono transienti, transitorie. Immagina qui c'è un la nostra importina, arriva, si lega con un una sequenza fenilalanina, glicina, si distacca, si lega con un'altra, si distacca, si lega con un'altra, fino a che è un meccanismo saltatorio, finché non arriva dove? A livello del complesso del del, a livello qui della barriera di diffusione, formata da cosa? Te lo scrivo, va, barriera di diffusione. La barriera di diffusione è formata da cosa? Formata dai nostri domini non strutturati del poro. Questi, però, sono il vero, la vera gatta da pelare, perché? Perché, come ti facevo vedere prima, questa si forma una struttura tipo gel, in cui le nostre fenilalanine controlaterali si contattano. E ora, che cosa arriva? Ora, però, deve arriva la nostra la nostra importina col suo cargo, che passa attraverso e ne prende contatto con le fenilalanine, e quindi si, alla fine, si ha una nostra barriera che si scioglie piano piano, cioè, o meglio, si disgrega. Poi, appena la nostro complesso binario fen, sì, cargo-importina, passa, si riforma, cioè, si disgrega piano piano questa struttura gel, che però poi si riforma non appena la nostra il nostro complesso è passato. Ripeto, perché si può rompere questa interazione? Semplicemente perché la nostra importina le fornisce un motivo. Il motivo qual è? La presenza di un di un dominio idrofobico che può contattare le fenilalanine.
Ora, siamo nel nel nel nucleoplasma. Siamo passati qui attraverso, abbiamo rotto transientemente la nostra barriera di diffusione, e siamo nel nucleoplasma. Scusa, e siamo nel nucleoplasma. Ora, nel nucleoplasma, il nostro complesso Cargo-Importina prende contatto con i residui fenilalanina-glicina del del del del del del nucleoplasma, di queste fibrille del nucleoplasma, e arriva finalmente il complesso. Arriva finalmente nel nel nucleoplasma. Ora, dobbiamo risolvere un problema, perché? Perché noi nel, il nostro obiettivo qual era? Trasportare il fattore trascrizionale nel nucleoplasma, e ci siamo quasi. C'è un c'è un problema, perché adesso abbiamo trasportato il il complesso binario tra importina e transcription factor, e fattore trascrizionale. Qual è il terzo step? Il terzo step è molto facile. Il terzo step è questo: è quello di riuscire a liberare il nostro il nostro fattore trascrizionale dall'importina. E come facciamo? Lo facciamo grazie a Ran, conoscenza di prima. Ran, sappiamo che in elevata concentrazione nel nel nucleoplasma, Ran-GTP, perché ti ricordo, è perché quando arriva, per sbaglio, non per, vedremo quando arriva Ran-GDP nel nucleoplasma, c'è GEF, che è il fattore di scambio della del delle guanine, che induce lo scambio del GDP di Ran in GTP, quindi vi è un'elevata concentrazione di Ran-GTP. Cosa fa di mestiere? Semplicemente si lega alla nostra importina. E quando io mi lego, cosa faccio? Induco un cambiamento conformazionale nell'importina, la quale porta a rompere l'interazione che formava con la la sequenza di localizzazione nucleare. Cosa succede? Immagina che questa qua sia Ran-GTP, che lega la mia importina. Purtroppo non ho tre mani per farti vedere, ma Ran-GTP lega la mia importina, la quale induce un cambio, in quale cambia conformazione a causa della pressione di Ran-GTP. Però Ran cosa faceva di mestiere? L'importina legava la nostra il nostro cargo. Se però cambia conformazione, cosa fa? Sputa fuori il mio cargo. E infatti, quello succede, cioè, io come prodotto cosa ottengo? Ottengo il mio fattore trascrizionale, il mio cargo libero, che può andare a legare il promotore e fare il suo lavoro. E E poi cosa ottengo, però? Un complesso tra Ran-GTP e importina. Quindi, Ran-GTP si lega all'importina, induce il rilascio del cargo, la nostro fattore trascrizionale, nel nucleo, a causa di questo cambiamento conformazionale indotto. Ora, il fattore trascrizionale, adesso l'abbiamo localizzato nel nucleo, perché presenta la sua sequenza di localizzazione nucleare. E tu potrai chiedermi, eh, ma non può uscire come è entrato? No, perché vedremo perché il meccanismo di esporto richiede una sequenza di esporto nucleare. Ma noi avevamo una sequenza di importo nucleare, o meglio, sequenza di localizzazione nucleare.
Ora, cosa ci resta, però? Dobbiamo fare un altro lavoro. Se adesso abbiamo rilasciato l'esportazione, però un'altra, un'altra proteina da importare, come come avviene questo processo? Questo processo avviene grazie al complesso Ran-GTP-Importina, che fa lo stesso lavoro di prima, cioè attraversa il nostro complesso del poro nucleare, grazie all'importina, e questo complesso binario entra nel citoplasma. Nel citoplasma, il complesso, il complesso Ran-GTP-Importina è presente. Ora, domanda, perché, ehm, più che altro, la domanda che faccio a me, questa, però, perché Ran-GTP-Importina è in grado di di uscire facilmente dal dal dal nucleoplasma verso il citosol? Ora, la ragione è probabilmente legata al fatto che vi è un gradiente di concentrazione di conformazione di Ran. In italiano, cosa vuol dire? Vuol dire che nel nucleoplasma è presente un'elevata concentrazione di Ran-GTP, e quindi il complesso, noi sappiamo che le cose, o meglio, le molecole, le specie chimiche, gli ioni fluiscono secondo gradiente di concentrazione, almeno. Quindi, GTP, anche se legato all'importina, non importa, vuole uscire perché qui nel nucleoplasma è in elevata concentrazione, mentre nel citosol è in bassa concentrazione, quindi fluisce. Questa è ragionevolmente un'ipotesi. Ora, Ran-GTP-Importina, però, non va bene, perché? Perché l'importina deve essere libera, deve essere libera per legare un'altra proteina, la prossima. Di conseguenza, interviene una proteina che si chiama Ran-GAP. Parlavo prima, Ran-GAP nel citoplasma, cosa fa? Si lega alla nostra Ran-GTP, che contiene il GTP, e cosa fa? Si lega, la spreme, e, ehm, probabilmente fa proprio questo, cioè la spreme, vi si lega e induce l'idrolisi, facilita l'idrolisi del GTP in GDP. Quando questo succede, però, quando Ran lega il GDP e quindi cambia conformazione, ora vediamo perché induce il rilascio dell'importina, la quale è presente nel nel nel citoplasma, e adesso vi si distacca anche, però, il nostro, ehm, la nostra GAP. Di conseguenza, nel nel citoplasma vi è una bassa concentrazione di Ran-GTP e un'elevata concentrazione di, di di Ran-GDP, diciamo. Ora, però, alcune molecole di Ran-GDP devono rientrare dentro il nostro nucleoplasma per riformare Ran-GTP, che è uscito. Di conseguenza, come avviene questo processo? Ran-GDP, non appena formato, viene legato da NTF2, una, un fattore di trasporto nucleare, e rientra nel nucleoplasma. Nel nucleoplasma, adesso, cosa succede? Succede che la nostra, eh, Ran-GDP lega, viene legata da Ran-GEF, fattore di scambio delle guanine. Questo che cosa comporta? Comporta lo scambio del GDP in GTP, esce il GDP, entra il GTP, e si forma la Ran-GTP. Cioè, Ran-GDP è stata importata grazie a NTF2, e adesso la nostra Ran-GTP è pronta a rilegare l'importina, indurre un cambiamento conformazionale, formare il dimero e rilasciare il nostro cargo.
Ora, un concetto biochimico. Come avviene il processo molecolare? Cos'è in realtà questa Ran-GTP? Allora, come tutte le piccole proteine G, presenta questa, è la guanina, questo è il ribosio, questo è il trifosfato, il GTP. E quello che probabilmente succede è che normalmente, ti dicevo, Ran, come Ras, come Rho, come come Rab, e come altre, sono piccole proteine G, le quali sono, ehm, se, diciamo, a diverse costanti, sono però soggette a un'idrolisi. Quello che capita è questo: un enzima, un un un aminoacido induce l'attivazione di una molecola d'acqua, la quale va a idrolizzare questo legame tra un legame fosfoester tra un fosfato gamma, l'ultimo, e l'ossigeno del fosfato in beta. Questo comporta che cosa? La conversione tra GTP e GDP. Però, ovviamente, comporta anche una modifica conformazionale, perché ovviamente adesso ho un fosfato in meno e di conseguenza la mia il mio enzima si riarrangia, gli aminoacidi si avvicinano, e questo comporta proprio a modificare la struttura tra il GTP e il GDP, e quindi tra Ran che lega il GTP e Ran che lega il GDP.
Ora, vediamo una il processo, ma all'inverso, cioè vediamo come avviene il processo di esporto nucleare. Allora, ti dicevo che per l'importo nucleare, come abbiamo visto, avevamo bisogno di sequenze di localizzazione nucleare basiche, NLS, per l'esporto nucleare. Le sequenze di localizzazione nucleare basiche permettono l'importo di proteine riconosciute dalle importine. Le sequenze, invece, che permettono l'esporto di proteine che devono essere esportate dal nucleoplasma al citosol, ti chiederai, quali sono? Bella domanda. Allora, le le proteine che che devono essere esportate dal nucleoplasma al citoplasma sono le proteine che fanno parte dei complessi ribosomiali, per esempio, il complesso 40S contiene 33 proteine ribosomiali e una molecola di mRNA, schiamo 18S, e queste devono essere traghettate fuori dal nucleoplasma, dove sono state assemblate, verso il citoplasma. Oppure altri esempi: ecco, alcuni fattori trascrizionali, una volta che, per spegnere la risposta che loro mediano, devono essere sequestrati dal nucleo, dove agivano, verso il citoplasma. Cioè, ti dicevo, alcuni alcuni fattori trascrizionali sono detti costitutivi, che sono normalmente presenti nel nel citoplasma. Altri, però, eh, hanno un'azione fasica, cioè un'azione che è che segue delle oscillazioni. Di conseguenza, questo succede spesso nei linfociti T, per esempio. Un esempio è NFAT, che è un fattore trascrizionale dei linfociti T attivi, il quale, una soltanto quando vi è tanto calcio intracellulare, questo viene veicolato nel nel nucleoplasma, come nel processo che abbiamo visto un attimo fa. Quando, però, la risposta si spegne, quindi il calcio diminuisce di concentrazione, il citoplasma del linfocita T, quello che si è visto è che questi fattori trascrizionali dal nucleo devono essere esportati nel citoplasma. E come avviene questo? Viene così. Allora, il il la prima cosa che succede è che dobbiamo ricordarci che se esistono le importine, esistono anche le esportine. Le esportine sono delle proteine che hanno due siti di legame. Questa volta, non più uno, ma due siti di legame, perché succede questo? Allora, l'esportina viene subito legata da Ran-GTP nel nucleo, perché ti ricordo che Ran-GTP nel nucleoplasma, in elevata concentrazione, grazie alla presenza di questi GEF, che inducono lo scambio del GDP di Ran in GTP, quindi Ran-GTP è in elevata concentrazione e può legare facilmente la nostra esportina. Questo legame, però, c'è una modificazione conformazionale che espone un sito di legame per il nostro cargo, in particolare per la nostra sequenza di esporto nucleare, Nuclear Export Sequence, che è una sequenza idrofobica, ricca di leucina. Le leucina sono amminoacidi ramificati che sono idrofobici, ricchi di gruppi metilici, hanno due metili alla punta, e questo è importante, perché? Perché la domanda che potrebbe sorgere è questo: sì, ma scusami, ti chiedi, ma se io mi hai detto il mio fattore trascrizionale che ho appena portato nel nucleo, che ha questa sequenza di localizzazione NLS basica, ma chi mi vieta di di legarlo alle esportina? Niente, tranne la la, diciamo, la chimica di questa sequenza, perché? Perché la sequenza di localizzazione nucleare è m è è basica, mentre la, quindi quella che permette il flusso direzionale dal nucleo, dal citoplasma al nucleoplasma. La sequenza inversa, invece, cioè la la l'esporto, invece, è mediato solo per quelle proteine che nel nucleoplasma espongono questa sequenza di localizzazione nucleare idrofobica.
Ora, si forma quindi, abbiamo capito questo complesso ternario, questo sì, questo complesso ternario tra Ran-GTP, che ha legato l'esportina, che ha indotto l'esposizione di un sito di legame per il cargo, per la NES del cargo, Nuclear Export Sequence, e adesso questo complesso ternario felicemente si lega alle sequenze di fenilalanina, arginina, e esce poi alla fine nel citoplasma. Questo dobbiamo fare, citoplasma, e permettere il distacco di questo complesso ternario. Ma per permettere il distacco di questo complesso ternario, e ci va ancora un attimo, perché? Perché abbiamo il complesso Cargo-Esportina-Ran-GTP. Ma adesso cosa succede? Succede che la nostra, interviene che cosa? Ran-GAP, la quale lega la nostra Ran-GTP, ne induce l'idrolisi, ok, facilita l'idrolisi del GTP in GDP. Di conseguenza, quando però Ran-GTP viene idrolizzata, quindi quando il GTP viene idrolizzato in GDP, si ha che cosa? Una modifica conformazionale. Guarda, cambia proprio la forma, e questo cosa comporta? Il distacco dall'esportina, la quale, però, a sua volta, cambia conformazione, perché la sua, e quindi si chiude il sito di legame per il cargo. Il cargo esce. A questo punto, si ha il distacco dal cargo, si ha il distacco delle esportine, del Ran-GAP. A questo punto, però, Ran-GDP è libera, e adesso viene importata dentro, grazie a NTF2, nel, ehm, nel nucleoplasma, dove riavvia il processo. Mh, come prima, un processo ciclico, in cui Ran-GDP viene legata da Ran-GEF, si forma Ran-GTP, lega l'esportina, espone il sito di legame, e a questo punto si lega la NES, la sequenza sul sul cargo, quindi il complesso ternario viene esportato, e il ciclo continua. Wow, ce l'abbiamo fatta!
Quindi, questo è sono i due processi che avvengono tra il nucleoplasma e il citoplasma, in cui, per capitolare, che cosa succede? Per nel processo di di importo, si ha l'azione delle importine, le quali, l'importina lega la sequenza di localizzazione nucleare ed entra attraverso il legame transiente, saltatorio, di fenilalanina, glicina, nel nucleoplasma. La barriera di diffusione viene proprio spiazzata grazie a queste interazioni idrofobiche che si formano tra le importine e questi domini non strutturati idrofobici. Ora, cosa succede? Succede che, però, una volta nel nel nucleoplasma, dobbiamo rilasciare il cargo. E come facciamo? Ran-GTP, che è in elevata concentrazione nel nucleoplasma, lega l'importina. Il legame induce un cambiamento conformazionale dell'importina, che espone, che diciamo, che espelle, più che espone, il il nostro cargo. Si forma un complesso dimerico, un complesso binario tra Ran-GTP e importina, alla quale deve uscire dal dal nucleoplasma nel citoplasma. Come facciamo, però? Qual è il problema che dobbiamo risolvere adesso? E dobbiamo rilasciare l'importina nel citoplasma, perché adesso deve legare un'altra, un'altra proteina da importare. E come facciamo? Ecco, abbiamo ancora il complesso binario Ran-GTP-Importina. Ora interviene Ran-GAP, che lega Ran-GTP, induce l'idrolisi del GTP in GDP, e induce il rilascio dell'importina. A questo punto, però, cosa succede? Ran-GTP viene importata dentro di nuovo, grazie a NTF2, fattore di trasporto nucleare. E a questo punto interviene un Ran-GEF, la quale induce il, o il quale induce il, la fuoriuscita di GDP e l'ingresso di GTP. Il processo continua. Per l'esporto, il processo è molto simile, solo che l'azione di Ran-GTP è diversa, perché se prima era quella di indurre il rilascio del cargo legando l'legando l'importina, in questo caso la sua funzione è quella di legare il cargo, permettendo l'esposizione di un sito di legame sull'esportina. Spero sia chiaro. Ora, quello che succede è che si ha l'esposizione di questo sito di legame grazie al legame, primo, di Ran-GTP su esportina, il complesso Cargo-NES, con la sua sequenza di di di esportazione nucleare, fuoriesce. Per rompere questo complesso ternario, tenuto insieme alle interazioni deboli, abbiamo bisogno di un cambio conformazionale. Questo è mediato da Ran-GAP, la quale induce l'idrolisi, il GTP, il distacco, quindi dall'esportina, il distacco dal cargo, e il nostro Ran-GDP viene portato dentro il nucleoplasma.