Transcription
Hola, espero que se encuentren muy bien. Mi nombre es Agustín Escalese, soy eh parte del grupo de del curso de hematología y yo le voy a andar comentando un poco sobre las metodologías diagnósticas en hematología.
Bueno, esta clase vamos a abordar los tres pilares fundamentales en diagnóstico de la hematología, ¿no?, que son la citometría de flujo, la biología molecular y la citogenética. Eh, más allá de que vamos a hablar y vamos a tocar los temas por separado, el objetivo es entender eh que toda la información que nos aporta cada una se utiliza en conjunto y se integran en la en la práctica clínica. Eh, hoy en día el diagnóstico hematológico no depende solo una herramienta, por lo tanto se necesitan múltiples herramientas, una combinación de las mismas eh para desarrollar diagnósticos precisos.
Bueno, la citometría de flujo que vamos a comenzar hablando es una técnica inmunológica en el cual utiliza anticuerpos monoclonales que están asociados a moléculas fluorescente y ellos se van a unir a diferentes estructuras a nivel de la membrana celular, a nivel intracitoplasmática, que nos va a permitir identificar y cuantificar las diferentes características fenotípicas y funcionales de la célula, ¿no? Por lo tanto, vamos a obtener datos sobre el linaje, si son células linfoides, si son células mieloides, el estado de activación, las aberrancias antigénicas, muy utilizado hematooncología y bueno, hay ensayos de viabilidad que se utilizan sobre todo más en investigación, pero también se pueden utilizar en la clínica. tener en cuenta que es una técnica multiparamétrica. Por lo tanto, eh vamos a analizar múltiples características de una una célula en simultáneo.
Esto que ven acá es un citómetro de flujo convencional que presenta eh tres tres sistemas muy importantes que nos van a permitir la detección correcta de esas células. El primer sistema que presenta el sistema de fluido. Y hay que entender que para que el análisis sea preciso es fundamental que las olas pasen de a una frente a los láser no la luz emitida por esos láseres y eso se logra eh mediante el enfoque hidrodinámico, ¿no? No. Y eso es gracias a que la muestra, nuestra suspensión celular, se inyecta en un flujo continuo de líquido envolvente o sheit fluid, que está a una diferente presión y genera una compresión en la muestra alineando las células de una en una pasando por el sitio de interrogación que sería este donde son impactadas por los láseres. Esto es muy importante y es clave para que las células pasen de a una y no pasen de a dos simultáneamente, ¿no? Porque eso va a complicar y va a generar errores posteriores en el análisis.
Posteriormente tenemos el sistema óptico. Entonces, cuando la célula atraviesa el as de luz eh emitido por el láser, se generan dos tipos de señales. Un tipo de señal que es la dispersión de la luz y la fluorescencia. En cuanto a la dispersión de la luz, no da información eh física de de la célula, ¿no? El tamaño y la complejidad. Far scatter, el tamaño y la complejidad, el size cutter. eh que con esa eh información ya podemos ir identificando las diferentes poblaciones celulares en nuestra suspensión celular. Por otro lado, la fluorescencia que se produce cuando los fluorocromos unidos a sus anticuerpos son excitados por el asre y emiten eh una luz a mayor longitud de onda, va a ser detectada, ¿no?, por los diferentes eh detectores, ¿no? Esto va a ser dirigido por filtro espejo hasta llegar a sus detectores específicos que posteriormente se va a transformar en señal eh una señal analógica, vamos a poder identificar. Obviamente esto es más profundo, ¿no? Pero la correcta selección de los diferentes fluorocromos eh es fundamental para evitar solapamientos eh espectrales y que confunda eh posteriormente la fluorescencia, ¿no?, en el análisis.
Por último, tenemos el sistema electrónico, que lo que hace es que las señales ópticas generadas eh por la emisión de la fluorescencia y la dispersión de la luz son transformadas en en señales eléctricas que generan un pulso electrónico, ¿no? Esto ser al uso de fotomultiplicadores o fotovolvíodos eh que van a convertir esos fotones en electrones y van a generar un pulso que está correlacionado con el nivel de intensidad tanto de fluorescencia con los tamaños celulares y la complejidad celular. Por lo tanto, cada célula genera un evento que queda registrado con valores numéricos eh para cada parámetro analizado.
Entonces, una vez eh procesada esa muestra, adquiridos esos datos, generados esos datos, se va a crear eh un archivo llamado flowitometry estándar o FCS que va a contener la información multiparamétrica de cada célula. Por lo tanto, vamos a tener eh que cada evento registrado va a tener un tamaño, una complejidad y una expresión de marcadores específicos.
¿Y cómo podemos visualizar estos datos que que obtuvimos? Bueno, una manera de visualizarlo es utilizando eh análisis monoparamétricos como el histograma que representa la distribución de una única variable. es muy utilizado para evaluar la intensidad de fluorescencia, la positividad o negatividad para los diferentes marcadores, los niveles de de expresión antigénica, ¿no? Como pueden ver acá hay un histograma en el cual estás evaluando a nivel de los linfocitos T cuáles son CD cu positivos, ¿no? Tenemos en el eje acá cuanto más se desplaza hacia de la derecha es mayor la positividad para ese marcador, ¿no? Aquí tenemos uno que cae sobre la negatividad y tenemos uno que cae sobre la positividad. Por lo tanto, si seleccionamos estas células, estamos hablando de linfocitos TC CD4.
Otra manera de visualizar los datos es realizando un análisis biparamétrico, utilizando tot plot, eh, en el cual representa dos parámetros simultáneamente, en donde cada punto que se observa acá, ¿no?, cada puntito representa una célula y esto es muy utilizado y es el uso fundamental que tiene es la identificación de las diferentes poblaciones celulares, el análisis coexpresión de marcadores y aplicar las estrategias de gating para caracterizar esas células, ¿no? Como pueden ver, acá estamos enfrentando un parámetro de dispersión con un parámetro de fluorescencia, ¿no? Eh, complejidad con C3. Y aquí obtenemos unas células que son muy poco complejos, muy poco complejas, perdón, con una alta expresión de C3 y la C3 es un marcador que expresan los linfocitos T maduros. Por lo tanto, podemos seleccionar y podemos determinar que estas células son linfocitos T. Luego se pueden caracterizar estos linfocitos T, ¿en cuál son? CD4, ¿cuáles son CD8, doble negativo y doble positivos, enfrentando dos parámetros de fluorescencia como CD4 y CD8?
Otra manera de realizar una visualización de los datos de datos es utilizando density o control plots. Esto es muy utilizado cuando tenemos un gran número de células o realizar eh análisis más eh profundos. Eh, como pueden ver acá nos facilitan la identificación y la delimitación de las diferentes poblaciones, ¿no? Estas herramientas son muy importantes muchas veces cuando no podemos delimitarlas como esto, cuando hay una separación a nivel de de un marcador.
Voy un poquito para atrás y explicarle eh gating. La estrategia de haing es proceso secuencial en cual vamos a ir seleccionando e identificando las diferentes poblaciones de interés, ¿no? Como esto ventan que se hace acá es un gate, ¿no? Y utilizando diferentes gates podemos seguir caracterizando las diferentes células. Esto que les muestro acá es un software que se utiliza en la clínica que permite realizar las generaciones de gates de manera eh muy fluida y seleccionando varias veces a la vez, eh, ¿no? Varios marcadores a la vez para poder caracterizar esas poblaciones, ¿no? En este caso se están seleccionando por eh baja complejidad, bajo tamaño y expresión fuerte C45, los linfocitos. Posteriormente, por negatividad de C3 y positividad de C19 y CD20 se le seleccionan los linfocitos T y luego se evalúa la clonalidad de los mismos, es decir, la expresión de cadenas livianas, capa y lambda.
Bueno, ahora vamos a hablar un poco sobre algunas técnicas de biología molecular que son muy importantes actualmente en diagnóstico y la estratificación progóstica en hematología. Vamos a comentar un poco sobre la PCR convencional, la RTPSR, la QPCR o PCR en tiempo regalo o cuantitativa NGS, que sería la secuenciación masiva de nueva generación.
Bueno, actualmente tiene un rol muy importante, como le comentaba, en la matología, eh, y se están utilizando muchísimo estas técnicas y cada vez más porque tiene una alta sensibilidad, eh, y al clínico le permite realizar una confirmación diagnóstica, una trastificación pragnóstica, también un monitoreo de la enfermedad mínima residual, ¿no? cuando pacientes eh hematológicos, hematooncológicos están culminando con su tratamiento y se quiere valorar si aún presentan células eh malignas con una alta sensibilidad eh y también obviamente para la sección terapéutica, ¿no? Entonces podemos determinar y detectar diferentes tipos de alteraciones como mutaciones puntuales, inserciones de lesiones, arreglos génicos y fusiones génicas que pueden estar asociados o no a, por ejemplo, sitios blancos de interés para eh una selección terapéutica o eh mutaciones puntuales para realizar monitoreo de esas células eh con alta sensibilidad.
Bueno, vamos a hablar un poco sobre la técnica madre de la biología molecular, ¿no?, que es la reacción en cadena de polimerasa o PCR, eh, que es una técnica de biología molecular que nos permite amplificar de forma exponencial un fragmento específico de ADN, ¿no?, con una alta sensibilidad y una alta especificidad. Por lo tanto, eso significa que vamos a eh vamos a partir de una cantidad mínima de material genético y podemos generar miles de millones de copias, permitiendo así su detección, ¿no? Para lograr eso se realizan eh diferentes ciclos de temperatura de manera repetitiva, ¿no? Cada ciclo presenta tres eh etapas que una de naturalización, una alineamiento y una extensión. Pero antes de eso, necesitamos saber qué componentes eh usar para generar esta reacción, ¿no? Para ello vamos a utilizar el ADN molde que contiene la secuencia de interés, ¿no?, que queremos amplificar, los primers, ¿no?, que son pequeñas secuencias cortas de ADN que se van a eh unir de manera complementaria y van a delimitar la la región amplificar. una enzima ADN polimerasa, que tiene que ser termoestable, ¿no? Para que no se degrade con la de naturalización, que va a sintetizar las nuevas cadenas de ADN y obviamente los nucleótidos que se van a ir agregando de manera secuencial por la eh polimerasa.
Entonces, ¿cómo son estos ciclos? Eh, ¿cómo son estas etapas de los ciclos de la PCR? Bueno, se comienza con la desnaturalización. Eh, en esta etapa lo que se busca es la separación de las dos cadenas, dos hebras que componen el el ADN bicatenario. Eh, y esto se logra llevando a una temperatura alta cercana a los 100 gr, lo que va a causar que se rompan esos puentes de hidrógeno que las unes entre sí y va a dejar expuestas esa secuencia que va a ser copiada posteriormente. La segunda etapa de los ciclos de PCR eh es es eh alineamiento, ¿no?, en donde se da las unidades específicas de los primers con sus secuencias complementarias. Esto se da a una temperatura baja donde se e se logra que se formen esos fuentes de hidrógeno y se unan, pero solo en sus regiones específicas, ¿no? Modificaciones de temperaturas pueden dar inespecificidades y uniones que no son las que realmente queremos que se den. Estas secuencias, pequeñas secuencias denominadas primer son los que nos dan la especificidad de la PCR, ¿no? Van a delimitar y van a eh se va a amplificar fragmentos de interés. Son secuencias muy específicas. Por último, tenemos la extensión, que es la es una fase en donde la ADN polímerasa comienza a sintetizar la nueva cadena ADN agregando nucleótidos en dirección CCO prima a tres prima. Esta eh enzima va a detectar el extremo del primer y va a comenzar a realizar la extensión de ese fragmento. Estos ciclos se repiten generalmente entre 30 y 40 veces, por lo tanto, partiendo de una única molécula de N, podemos obtener miles de millones de moléculas. Por eso son denominadas técnicas muy sensibles y que generan una amplificación exponencial.
Esto sería una PCR eh tiempo final o convencional, ¿no? Donde nosotros obtenemos ese producto de PCR. Eh, después que terminan sean los ciclos, ¿no? Que estos ciclos no comenté, pero se deben de realizar esa mix con el agregado de ese molde. Se ponen a incubar en esto que es una representación de un termociclador. Luego que que terminan todos los ciclos, obtienes el producto PSDR y se va a correr un gel de agarrosa, ¿no? Acá se pone ese producto de PSR, se corre con una corriente eléctrica y va a migrar y vamos a obtener diferentes eh bandas. que van a estar asociadas a estos productos de PCR. Obviamente esto va a ser comparativo con un marcador de peso molecular y debe caer obviamente con eh los pares de bases adecuados para esa región que que amplificamos.
Bueno, en cuanto a la RT PCR es una variante de la PCR que permite trabajar a partir de ARN en lugar de ADN. Esto es fundamental porque nos permite en hematología eh detectar transcriptos de fusión, por ejemplo, que se generan y se expresan a nivel de ARN como el BCRABL1 asociado a la milide crónica o PML error alfa asociado a la leucemia promilocítica aguda. Eh, a diferencia de la P recondcional, en este caso se eh agrega un paso extra que es la transcripción reversa, ¿no? en donde se utiliza una una enzima tasa reversa con DNTPs, ¿no? Amplió y con los primers adecuado para generar un ADN copia complementario a la secuencia de RN. Por lo tanto, este ADN complementario va a reflejar los genes que eh estaban siendo expresados. Una vez que obtenemos esa N complementaria, podemos realizar una PCR convencional o podemos realizar eh una QPCR real time.
Ahora vamos a hablar un poquito sobre la QPCR, la PCR en tiempo real o la quanti quanti PCR, ¿no? PCR cuantitativa, eh, que es una evolución de la PCR convencional, el cual no solo podemos detectar en sino que podemos cuantificar y en tiempo real eh estas secuencias de interés. Para lograr esto se utilizan sondas o eh intercalantes de ADN fluorescente, ¿no? Sondas que están compuestas, como en este caso es una secuencia pequeña de nucleótidos que tiene una molécula fluorescente o pueden ser intercalantes como el Sgreen. Eh, estos a medida que se van intercalando, se van uniendo al ADN, van emitiendo fluorescencia. Entonces es proporcional, va generando una fluorescencia proporcional con la concentración de los fragmentos de interés. Entonces vamos a ir viendo a medida que pasan los ciclos que se va formando una curva sino idea como esta en donde se genera una fase exponencial, ¿no? Plató al final eh que va a superar umbral, que es umbral va a ser denominado CT, ¿no? Que es cuando la la concentración superaus umbral. Y nosotros vamos a poder correr en simultáneo, ¿no?, eh calibradores o concentración conocida para poder cuantificar eh el número de copias que presentaba eh este caso esa muestra de un paciente.
Entonces, eh podemos decir que la PCR convencional detecta esos fragmentos de interés. La RT PCR permite estudiar transcripto de fusión y expresión eh del RN y la QPCR. Vamos a cuantificar esos fragmentos de interés. Obviamente estas técnicas no compiten entre sí, sino que responden a distintas preguntas clínicas y eh de ello depende su correcta elección, ¿no? En el contexto del paciente.
Ahora vamos a comentar un poco sobre la secuenciación, ¿no?, que es una técnica que nos permite determinar el orden exacto de los nuclétidos en una molécula ADN, ¿no? Por lo tanto, nos va a decir eh cómo está escrita la información genética. Mientras que la PCR no eh amplifica, nosotros eh si utilizamos una técnica de secuenciación, vamos a leer esa información. Por lo tanto, gracias a ella vamos a poder identificar mutaciones, variantes y alteraciones genéticas que están asociadas a muchas enfermedades eh genéticas y hematooncológicas en este caso o hematológicas.
La primer técnica que se desarrolló fueer, que que solo permite analizar una región eh por vez. lo que la hace limitada, ¿no? Para ello utiliza eh un una mix, ¿no?, de nucleótidos y desóxidonucleótidos asociados a moléculas fluorescentes con terminadores. Por lo tanto, una vez que se van dando ciclos de amplificación, ¿no? Se utilizan reacciones de amplificación. Una vez que ese eh que la polimerasa agarra un un disóxido sciado a molleculas fluorescente con un terminador, corta la reacción y se sabe que en este lugar porque no va a segir la reacción hay una guarina. Así se hacen miles de ciclos, bueno, miles de ciclos se hacen miles de amplificaciones y vamos a poder determinar el orden exacto de cada uno de los nucleóticos que comparen esa secuencia. Es ideal para confirmar mutaciones específicas.
¿Qué es la NGS? La NGS es la eh secuenciación de nueva generación y representa una evolución muy importante en cuanto a la secuenciación y nos permite analizar múltiples regiones del genoma de una sola corrida, ¿no? Eh, en lugar de analizar una sola secuencia como el Sanger, el NGS fragmenta el ADN en múltiples partes y realiza secuencias en paralelo a cada uno. Luego la reconstruye y la información que obtenemos se realiza mediante un análisis bioinformático que actualmente eh dada a la cantidad de información que se obtiene con estas metodologías está bastante automatizado. Entonces podemos detectar variantes con una muy baja frecuencia, ¿no? Una frecuencia alélica, incluso menor al 1%. Eh, podemos tener una alta profundidad de lectura, que esto significa que en una misma región de ADN se se secuenció y se analizó muchas veces, lo que aumenta obviamente la confiabilidad de lo que estamos secuenciando. En hematología el NGS se utiliza mucho eh o se está utilizando mucho en enfermedades complejas como las leucemias melodid aguda, el síndrome melodisplásico, donde hay muchas puntaciones y que influyen tanto en el diagnóstico como en el pronóstico como en el tratamiento también. Entonces, eh cada vez se está utilizando más, pero obviamente es una técnica que no es muy barata y no está al alcance de todos los pacientes.
Ahora vamos a pasar a la última parte de la presentación donde vamos a hablar un poco sobre la citogenética. Y la citogenética es una rama de la genética estudia los cromosomas, ¿no? Evaluando del número de la estructura y el comportamiento de los mismos. Eh, a diferencia de la biología molecular que analiza cambios a nivel de una secuencia, a nivel eh molecular, pequeños cambios, ¿no?, la citogenética permite estudiar eh alteraciones a mayor escala, ¿no?, a nivel cromosómico. Entonces, nos va a permitir detectar alteraciones numéricas de los cromosomas, alteraciones estructurales como pueden ser eh traslocaciones, que es el intercambio de material genético entre cromosomas, que es muy importante. Por ejemplo, en la traslocación 922 asociada a gen PC BCRABL1 que está asociada a lación milid crónica de lesiones que son eh pérdidas de material genético como de lesión 5Q asociada en síndrome miolid clásicos y también eh otro tipo de alteraciones como las inversiones y y anepleudidas, por ejemplo. Estas técnicas que se utilizan en la citogenética son el catotipo y el fish y son fundamentales en diagnóstico de enfermedades hematológicas, en enfermedades eh oncológicas y síndromes genéticos.
El cariotipo es la técnica clásica de de la citogenética y que nos permite desorbar eh los cromosomas en metafase, ¿no? Eh, eso, significa que cuando están los cromosomos más condensados y son visibles a nivel de microscopio. Esto se realiza una técnica de bandeo que se denomina que se hace consa que nos va a dar un patrón de bandas y eso lo vamos a poder detectar, como mencioné anteriormente una vez que lo visualicemos en el microscopio. Por lo tanto, vamos a poder eh ver con de manera completa el genoma, pero con una baja resolución, ¿no? Y esta técnica, a diferencia del fish, requiere células en división, por lo tanto debemos realizar un cultivo celular. Eso que conlleva a que se lleve a cabo en más tiempo, ¿no? No es una técnica rápida. Se se realizar un cultivo celular quizás unas eh 72 horas, por ejemplo, y posteriormente se realiza el cariotipo, por lo tanto, no es una técnica que se puede sacar en un día.
Bueno, ¿y cómo es el proceso técnico para realizar un cereotipo? Se comienza realizando el cultivo celular para obtener esas células en división. Eh, posteriormente se hace un bloqueo de la metafase, ¿no?, con colchicina, eh, para que no se sigan dividiendo esas células y sigan eh, cambiando. Luego se hace un choque hipotónico que permite que los cromosomas se dispersen facilitando su su observación. Luego se fija, se hace una extensión y una tinsión coninza y bueno, posteriormente se hace una herencia microscópico y se evalúan las alteraciones. Ten en cuenta que la calidad del cariotipo siempre depende de la calidad del cultivo celular. Si es de mala calidad, el cariotipo no va a ser muy bueno, no vamos a poder evaluar correctamente esas alteraciones. Y bueno, acá vamos a observar una representación de un cariotipo, ¿no? Porque se ve más lindo así. Esto es una talción 922 en donde uno de los cromosomas 9 pierde el material genético y se trasloca a nivel de cromosoma 22. Esto genera ese gen denominado BCRl, que es un transcripto de fusión que está asociado a la ilusión de amiloide crónica, ¿no?
En cuanto al fish, que es otra de las técnicas utilizadas en citogenética, eh esta técnica utiliza sonda fluorescente, que es una regiones específicas de del ADN, ¿no? Por lo tanto, nos permite detectar eh alteraciones cromosómicas de manera más sensible y de forma dirigida a diferencia de los cariotipos, ¿no? En este caso también, a diferencia del cariotipo, no requiere una división celular, por lo tanto podemos realizarlo en celulares de interface sin necesidad de realizar un cultivo celular. Por lo tanto, es una técnica que eh conlleva menos tiempo que las el cariotipo. En el fish se pueden utilizar diferentes tipos de sondas en donde la sonda de fusión es la más utilizada para detectar translocaciones específicas o las locus específicas que eh se quieren evaluar regiones concretas del genoma, ¿no? Este era un fish de un paciente de una miloide crónica donde se detectó la traslocación 922 para que eh se conforme ese gen BCRBL. Acá podemos ver un fish de de un paciente con mieloma en donde se observa una traslocación 111 eh que se pierde material genético a nivel del cromosoma 11 y se trasloca a nivel del cromosoma 14. Y bueno, esto es un fish para ir detectando lo mismo.
Estas son las diferencias eh principales que tiene el cariotipo contra el fish. Obviamente el alcance del carotipo es global. El fish es una técnica dirigida. La resolución del carotipo es baja, como mencionamos anteriormente. Eh, la del fish es alta porque utilizamos ondas que van dirigidas a la región que queremos estudiar. Eh, el cariotipo requiere división, por lo tanto requiere la realización de un cultivo celular. En cuanto a eso al tiempo, obviamente es una técnica más lenta y el fish es lo contrario, no requiere división celular, no requiere la realización de un cultivo celular, por lo tanto es una técnica eh más rápida, ¿no? Tener en cuenta que obviamente estas técnicas no compiten, sino que se complementan, como todas las técnicas que mencioné anteriormente, el catotipo nos va a dar una visión global, mientras que Fish nos permite detectar alteraciones específicas con mayor sensibilidad. Eh, muchas de estas alteraciones detectadas por citrogenético, luego se estudia a nivel molecular y se integran todos estos datos para eh realizar la estratificación pronóstica del paciente, para realizar eh niveles de riesgos. Es es importante, ¿no?, que la sumatoria de toda esta información para los clínicos que puedan analizar correctamente esos pacientes. Aunque actualmente estemos en la en la era de la biología molecular, hoy en día la citogenética sigue siendo fundamental y porque aporta información que las otras técnicas no pueden reemplazar. Entonces, eh siguen siendo técnicas muy importantes a nivel de diagnóstico.
Y bueno, esto fue todo. Espero que les haya gustado la clase y muchas gracias. M.