Métodos Separativos - Clase 12 - Opciones de instrumentos

Buenas tardes. Espero que estén todos bien. Bueno, estamos asistiendo, estamos impartiendo la tercera clase de cromatografía gaseosa. En las clases anteriores vemos las generalidades de cromatografía, hablamos de distintas fases, de sus áreas, las características y componentes de un cromatógrafo de gases. Y vamos a ver en este caso, visto en detalle, las características de las distintas columnas, hablar de fase estacionaria y las características que definen la separación. Pico, nos referimos como resolución. Dentro de los distintos opciones instrumentales, una vez que nosotros definimos qué tipo de columnas vamos a utilizar, o sea, las características corazón del cromatógrafo de gases de separación, separación.

Esta clase vamos a ver los sistemas de inyección y los distintos tipos y características de cada uno, ventajas, desventajas y algunas aplicaciones o implicancias prácticas. Como recuerdan, en cromatografía gaseosa nosotros partimos de un sistema de muestra, muestreo. Como vimos acá, las muestras volátiles, entre otras cosas, pueden obtenerse a partir de la matriz que corresponda por destilación, por extracción en fase sólida, microextracción en fase sólida, ¿verdad? O por mediante extracción, sistema dispersivo líquido-líquido. Los inyectores que vamos a ver son de tipo "in column" o con divisores de flujo, "split", "splitless". Y las columnas, vamos a hablar, ya vimos que los sistemas pueden ser una columna única con el horno, puede haber más de una columna conectada, ¿verdad? Y otro tipo de aplicaciones. Y luego, en las próximas clases, vamos a ver detectores, siendo los que están acá abajo los más utilizados en términos generales, si bien hay muchísimos más.

Esta imagen lo que muestra es lo que es el sistema de inyección desde el punto de vista físico, digamos. Se trata exclusivamente de un sistema en el cual se produce la inserción de la muestra al sistema cromatográfico, que implica el ingreso a la columna separativa. Si vemos un corte transversal, aquí vamos a ver que hay sistemas de cierre, ¿verdad? Mediante una septa, esto es decir, un material que se va a deformar por el proceso de inyección mediante una jeringa y luego va, por un cierto número de inyecciones, a retomar su forma original. Sistemas de cierre o sellos. Y aquí vemos lo que se llama el "liner", es decir, en el cuerpo metálico del ingreso de la muestra, tenemos un cilindro que es donde se produce la vaporización si inyectamos muestras líquidas o la homogeneización de las muestras gaseosas. Caso muestras sólidas, ya dijimos que tenemos que tener una precámara donde se produce la subida de la muestra sólida, o sea, que no se muestra. Es este tipo de inyector, pero vamos a referir a esto, ¿verdad? Y ese "liner" es donde se produce entonces la vaporización de la muestra, ya sea líquida o gaseosa, para entrar a través del impulso de la fase móvil a la columna.

Bueno, aquí vemos un esquema. Tenemos las jeringas, el inyector, el puerto de inyección, los cierres, los sellados, ¿verdad? El ingreso, ¿verdad? De la fase móvil, la columna, los sistemas de detección, todo como dijimos. Además, zonas que son termostatizadas en forma diferente. El volumen "index" va a depender de la columna que utilicemos y la resolución que deseemos. Ya habíamos en este caso de la importancia de no solamente la naturaleza de la fase estacionaria, sino también lo que sería el proceso de selectividad, sino también su capacidad, o sea, la cantidad de fase estacionaria en la columna y la resolución que va a estar dando justamente por el número de platos teóricos en el largo de esa columna con ese espesor de fase estacionaria de una determinada naturaleza.

Sistemas de inyección. Como dijimos, podemos inyectar muestras gaseosas, líquidas y sólidas, y el inyector va a contemplar estas características y además permitir que la muestra, ¿verdad?, esa muestra que extrajimos de la correspondiente, pueda ser introducida en forma rápida y cuantitativa. Vimos adelante, cuando hablemos de cuantificación, en realidad, nosotros vamos a ver que más que inyectar cuánto inyectamos cuantitativamente, qué volumen inyectamos, nos interesa más que la relación de componentes que están presentes en la inyección, la muestra que tomamos, que son, suponemos, representativa de la matriz en la cual estamos, la matriz en la cual estamos trabajando, gaseosa de la matriz en la cual estamos trabajando, ¿verdad?, mantenga que sus componentes se encuentran en las mismas proporciones relativas durante todo el proceso.

Como en esta clase vamos a hablar prácticamente solo de columnas capilares y el sistema, perdón, el sistema de inyección más frecuente, que es el que utiliza un sistema de división de flujo, este "split", que en inglés, que nosotros utilizamos como todo el mundo lo conoce, o "splitless", que es sin división, que es sistema. O sea, que la inyección de columnas capilares puede haber por una vaporización clásica, o sea, en cualquiera de estas formas, con o sin divisor de flujo, en forma directa. Si no existe el divisor de flujo, eso se utiliza fundamentalmente en columnas de tipo capilares, pero "wide bore", o sea, de diámetros de 0.54 y no las vamos a, con mucha capacidad, no las vamos a considerar aquí. Ahí no hay divisores de flujo y tampoco las "packed", que tampoco vamos a tratar.

También podemos tener sistemas de inyección donde se produce la programación de temperatura del inyector, de la misma manera que se programa el horno, se puede programar la temperatura del inyector. Y aquí se puede usar en todas estas variables de inyección. Y también puede haber inyección "on column", ¿verdad? Con o sin retención previa. Vamos a ver ejemplos de todo esto, pero nos vamos a centrar, centrar en la inyección, digamos, por vaporización clásica.

Y qué significa entonces en columnas capilares por vaporización clásica es que la muestra es volatilizada, es decir, pasa a fase gaseosa antes de transferir a la columna. Y esto ocurre en una cámara de vaporización que va a estar caliente, una temperatura diferente a la columna, por encima, bastante por encima. Y ese lugar, esa cámara de vaporización, usualmente es lo que llamamos "liner". Es un cilindro de cuarzo que se utiliza para inactivar la inyección "split", o sea, con divisor. Solo una pequeña parte del gas va a entrar a la columna y el resto se va a eliminar. Cuando tenemos muestras muy concentradas, es la técnica de elección, ¿verdad? Así también para el análisis de gases y de gases, ¿verdad? Tanto en gases como GC se requiere un volumen importante. Si la muestra de lo que nosotros tenemos está muy concentrada, nos, digamos, diluirla implica inyectar mucho solvente, que vamos a, que no es lo ideal. Una técnica práctica producir una división de flujo donde una parte, como dice aquí, de la que inyectamos, una vez pasó a fase gaseosa, se va a incorporar a la columna, pero una parte mucho mayor se va a ventear, o sea, se elimina del sistema cromatográfico. Ahí es donde empieza a ser importante que en toda la los diseños, la geometría, la forma de trabajo de los inyectores, la proporcionalidad relativa de cada uno de los componentes se mantenga, tanto en lo que se inyecta, o sea, lo que se vaporiza, como en lo que ingresa a la columna y en lo que se elimina. O sea, no nos interesa cuánto inyectamos, sino que las proporciones relativas de los componentes se mantengan en cada una de las etapas.

En la inyección sin división de flujo, "splitless", toda la muestra gaseosa prácticamente entra al inyector, desde el inyector a la columna, el "liner", la columna, ¿verdad? Y se utiliza también como "split" o "splitless". O sea, el hecho de que sea "split" o "splitless" depende solamente de una válvula que se abre para permitir, ¿verdad?, que la fase gaseosa, una parte sea eliminada del sistema. La inyección "splitless", ¿verdad?, sin divisor, se utiliza fundamentalmente en sistemas traza, lo cual es bastante lógico, porque nosotros lo que hacemos es ingresar toda la muestra a la columna. Y suponemos que ya no podemos concentrar más, por eso utilizamos. En el caso de las inyecciones directas, todo el la fase gaseosa entra a la columna, ¿verdad? Y no hay, no se utiliza un "split". Generalmente, como decía, son para columnas de tipo mayor diámetro. Recuerden que las columnas normales son de 0.1 a 0.25, 0.32 de diámetro interno, o para columnas empacadas, no las vamos a ver.

Los inyectores de temperatura programada, es una técnica más nueva, tiene algunas ventajas que vamos a ver después. O sea, es la promoción de temperatura del inyector y la sol, eliminación de solvente. Se utilizan generalmente para lo que llaman inyecciones de grandes volúmenes, en análisis traza. Y lo que se hace es preferentemente una técnica en la cual se elimina preferentemente la mayor parte del solvente. En general, en los sistemas de división de flujo es siempre lo que se busca, pero esta es una aplicación.

En la inyección "on column", la muestra líquida, en este caso muestra líquida, la entrada de la columna, una precámara termostatizada en el horno, o sea, entra la columna o en una precámara. Y después hay técnicas de trampa, retención con precámara para, hablamos de esto, los "gaps", para evitar el ensanchamiento de la banda, el solvente y los analitos, también por el tema de impurezas de solvente o precámara. En una precámara con una salida de vapores, se llama "solvent exit", se elimina la mayor parte. Se utiliza para inyecciones grandes, para transferencias "online". Este tipo de, acá lo que sería la inyección "on column", ¿verdad? Aquí tenemos los sistemas, aquí, perdón, sistemas de precámara de retención que habíamos visto como sistemas de protección de las propias columnas, pero también se pueden utilizar para enfocar la el solvente. Fíjense que aquí la precámara tiene un diámetro mayor que la columna cuando se utiliza con este objetivo como técnica de trampa retención. Y también tenemos este sistema que es muy, muy sofisticado, en el cual, en la precámara, se inyecta y se elimina la mayor parte del solvente y luego a la columna. Este tipo de técnicas se utilizó mucho en algún momento y hoy ya no tanto. O sea, vamos a dedicarnos a la inyección de gases directa, formación de gas, ¿verdad? Que se utiliza en columnas. Si es en columnas empacadas en "megabore", aunque no lo vamos a ver, lo que ocurre directamente, no hay "split". Esta la septa, entra el carrier, se vaporiza y va a la columna, ¿verdad? Aquí están los distintos componentes, pero nosotros en columnas empacadas no vamos a trabajar, ¿verdad? Básicamente lo que ocurre es esto. Lo que sí vemos es de nuevo la jeringa, todo el sistema de soporte metálico, el inyector, donde digamos hay un "liner" también aquí, vidrio, cuarzo, y va directamente a la columna. No hay sistema de división. En "megabore" existe exactamente lo mismo. O sea, recuerden aquí los diámetros internos pueden de las columnas, ¿verdad?, son de, como se dice, de milímetros. En el caso de "megabore", estamos hablando con columnas de diámetro interno 0.54, como se muestra aquí, y tampoco se utilizan divisores de flujo. Y son columnas de gran capacidad, son capilares, pero de gran capacidad.

Las características de los inyectores para cromatografía gaseosa. Asumamos que estamos trabajando con columnas capilares directas normales. Todo normal. Primera, la contribución tiene que ser baja o nula al ensanchamiento de la banda. O sea, el inyector no puede provocar un ensanchamiento de la banda. Si nosotros inyectamos, suponer, siempre necesitamos una muestra líquida, se produce el pasaje, la vaporización, y debe, no debemos por eso provocar que los componentes entren en forma de bandas anchas, sino que lo vamos a tratar siempre es una banda lo más fina posible, es decir, lo más delgada posible, para que entre a la columna y sea la columna la que haga la separación. Que se introduzca la muestra en forma homogénea, representativa. Hablamos hasta ahora no de generar discriminación por diferencia de los analitos, ya sea por punto de ebullición, que es una forma, la volatilidad, por polaridad o por concentración. O sea, cuando se produce la vaporización en el "liner", el inyector no debe provocar diseminación de tal manera de que, de nuevo, esa banda que se forma al ingreso de la columna, donde se vuelve a condensar, recordemos que la temperatura son mucho más altas que las de la columna, se produce el enfocado, que vamos a ver más adelante, donde efectivamente se forma una banda estrecha, que es la que por acción del programa de la temperatura en la columna es que se va a producir la separación estrictamente por las características de interacción con la fase estacionaria. Evitar degradación térmica catalítica. La degradación catalítica es bastante razonable en el sentido de que los "liners" son de cuarzo y están silanizados, desactivados para evitar que los sitios silanoles puedan de alguna manera degradar o catalizar degradaciones. Y la degradación térmica solamente la tenemos que tener en cuenta en el sentido de que es el compromiso. Si yo tengo compuestos térmicamente lábiles, voy a tener que ver si puedo trabajar en condiciones de inyección tal que se produzca la vaporización, pero que no haya una degradación. Yo di un ejemplo de eso que ocurría en algunos casos. En los inyectores, tiene muy buena exactitud y precisión en un amplio rango de concentración de analitos. O sea, se puede trabajar con un rango dinámico bastante importante, donde el inyector se comporta razonablemente bien, o sea, que es predecible.

Aquí lo que mostramos es la anatomía del inyector, los componentes del inyector. Bueno, la jeringa, la aguja de la jeringa, la septa, es decir, un tapón de un elastómero que lo que hace es que una vez que es perforado, o sea, primero resiste la temperatura, la parte inferior del inyector está debajo, no todo el proyecto. Segundo, permite que sea perforado. Las agujas, como vamos a ver de cromatografía gaseosa, no son como las que se utilizan en HPLC. Estas no son de punta roma, sino que son diseñadas como en cuña, de tal manera de que perforen pero sin llegar a provocar un agujero. Estas son las septas, están roscadas, con un sistema de aprete tal que se pueden ir apretando para evitar, por un cierto periodo de tiempo, que los agujeros que se han formado en el elastómero no recuperen el cierre. Una idea, en unas septas comunes se habla entre 100 y 200 inyecciones, más o menos promedio, para poder cambiar. Eso depende si trabaja con forma manual, forma automática. En forma manual es un poco más al azar, donde uno inyecta, donde uno perfora. Inyectores automáticos es prácticamente siempre por debajo de la aguja. En el inyector, lo primero que sigue es un "liner" con un sello, de tal manera de que no, cuando nosotros ingresamos la fase móvil, no tengamos pérdidas. Y luego tenemos la columna. Fíjense la columna capilar que está sellada, el ingreso desde el capilar, desde el "liner", el cuerpo inyector al horno donde está la columna. La columna es lo que da el elemento de continuidad. Se sella de tal manera con un sistema de tornillo de aprete con un "ferrule", que es una pieza normalmente grafitada, que se deforma por acción del tornillo que aprieta, de tal manera que en forma cónica sella la columna sin romper. Y aquí arriba lo que tenemos son dos cosas. Una, lo que se llama la purga de septa. Recuerden esto, es decir, esto es del gas que entra, de todo el gas que entra, una parte a la columna, pero una parte siempre va a ir a purgar la septa, es decir, evita que en esta parte superior, si hubiera o se produjera un volumen muerto, no quede adherido a la septa ni se condense en ella, de manera de evitar en inyecciones sucesivas, que se produzca la aparición de picos donde no debería haberlos. El flujo se maneja normalmente en orden de 4 ml por minuto, es fijo y no se cambia. Pero fíjense que hay otra salida, que es la que llamamos la, donde se encuentra la válvula del divisor del "split". Es decir, que la mayor parte de la fase móvil se va a eliminar. Como estamos trabajando con "split", por esta parte, en realidad, fíjense que se trata de una válvula de tres vías que conecta 4 ml para acá, algo para aquí y todo para acá, y yo la puedo girar de tal manera de que si yo cancelo esta salida, girando la válvula, en realidad la fase móvil solamente puede salir por la purga de septa y por esta parte. Se imaginan que gira por aquí. Lo vamos a ver más en detalle. O sea, que estos serían los componentes básicos de un inyector.

Entonces, en resumen, nuevamente, la introducción en columnas capilares. El inyector puede ser de volúmenes muy pequeños, nanolitros, o sea, menos de microlitros, muy, muy pequeños. Y la inyección se hace en forma "split". Si introducimos volúmenes mayores de muestra, o sea, 10, 3 veces mayores, microlitros, la división se va a hacer con. Y vimos que hay otros dos tipos que vamos a considerar solamente al final como ejemplos.

Sistema de inyección "split". Generalmente se trabaja en este rango, 1:10, es decir, que por cada parte que entra a la columna se eliminan, se dividen, sean 10 a 200 partes. Entonces, uno de los problemas siempre implícitos, aunque dijimos que tienen que cumplir con esto, son los fenómenos de discriminación de componentes por punto de ebullición, por volatilidad. ¿Qué quiere decir esto? De que puede ser que cuando se produce la volatilización en la cámara del "liner", los compuestos menos volátiles van a quedar, a pesar de que son arrastrados por la estacionaria, un poco menos, un poco más retenidos, no en términos de lo que corresponde a todo ese tránsito en tiempo, un poco más retenidos y, por lo tanto, no entren junto con esa banda que decimos que se debe formar en condensación a la cabeza de la columna para que se inicie la separación en la columna. O sea, que algunas veces esto no puede ser. Hay casos en que no puede ser utilizado. Vamos a ver algún caso final.

En todos los casos, la jeringa tiene que ser apropiada. Y en general, nosotros inicialmente trabajamos con jeringas de 1 microlitro. Son jeringas donde el émbolo es un pelo de acero, pero luego vimos que no eran como entendimos que no teníamos que medir los volúmenes que inyectamos, porque la idea es, justamente, lo que dijimos, no nos interesa. Entonces, decidimos trabajar y trabaja todo el mundo con jeringas de 10 microlitros, donde inyectamos desde punta de jeringa, que es alrededor de menos de microlitros, a un o dos mililitros, de acuerdo. Hay un criterio útil en la selección de que es el volumen sea por lo menos dos veces mayor que el volumen a ser inyectado. Y nosotros trabajamos con volúmenes que son a veces 10 veces más. Lo logramos, pero es mucho más cómodo y es menos problemático. Lo mismo se aplica, obviamente, para sistemas de inyectores automáticos, donde en realidad, eh, lo que se utiliza, pues se tiene que tener un volumen que esté disponible, que no puede ser menor de 100 microlitros de donde se tome la muestra. Normalmente, el olor de 1 microlitro, pero eso es para que hagamos el inyector automático. No puede hacer lo que hacemos nosotros con un vial, que es maniobrar el vial para poder tomar. El inyector automático normalmente, dentro de los viales que se colocan, llevan unos insertos, que son como unos tubitos cónicos que llevan 100 microlitros, que es donde efectivamente se toma la inyección, ya digo, normalmente de microlitros.

En el ecosistema de modalidad por divisor de flujo, la muestra se vaporiza en un inyector a alta temperatura, prácticamente en el "liner". Estamos viendo lo mismo. Lo único que aquí estamos viendo es que tanto en la purga de septa como en el divisor de flujo, puede haber válvulas. De hecho, hay válvulas de restricción. La muestra se va a dividir, no para que solo una parte conocida de la muestra entre a la columna, sino con una relación de separación. Y de nuevo, la relación normal se utiliza, están de 10 a 1 a 200 a 1. O sea, una parte entra, 200 afuera. Una parte entra, 10 afuera. Y el operador, la relación de la regulación de flujo, la regula muy fácilmente con una válvula. Eso se controla a través del software. Si yo controlo los valores de flujo y mediante el software controlo los pasajes selectivos de las válvulas solenoides, yo logro los divisores de flujo que me interesan. Antes, y eso quienes hagan el práctico lo van a ver, se medían los flujos mediante un tubo graduado con un con jabón, no colocando con una manguerita, colocando la salida del detector, medía el volumen salía la columna. En realidad, se desconecta la columna del detector, se mide ahí el flujo y lo mismo se controla el divisor. Incluso en una primera instancia, los divisores de flujo eran fijos, la relación 1:10 o 1:20 o 1:1, lo que fuere. Y se trataba de un tubo, una espiral, un tubo en espiral, semicapilar, que lo que lograba de esa manera era que forzaba, siendo mayor el diámetro de la columna, a que por diferencia de presiones pasara una parte a ese buffer que tenía un volumen determinado y el resto se acabó. Eso no queda tranquilo, nadie sufra este tipo de problema.

Bueno, ¿cómo es el mecanismo de inyección en "split" con divisor de flujo? La válvula divisora, o sea, tenemos todo el esquema ya. Y la válvula divisora se abre durante la inyección. La aguja de la jeringa perfora, la muestra entra a la zona calentada del "liner", la muestra líquida se volatiliza y el plasma gaseoso queda contenido en el "liner" de cuarzo desactivado. Acá, luego el gas carrier arrastra la muestra a través del "liner", ya sea dentro de la columna o entre el "liner" y esta zona, el "liner", la parte inyector, y sale por el "split". El porcentaje de muestra que llega a la columna va a depender de la relación de flujo entre la columna, yo quiero lo que tengo fijado en la columna y el divisor de flujo. O sea, que yo tengo, necesito un ingreso mayor de fase móvil que voy a regular por una parte por la purga de septa, de la cual no vamos a hablar más, pero acá sabemos que siempre va al torno de 4 o 5 ml por minuto. Eso lo fijamos nosotros. Luego decimos qué volumen queremos en el, qué flujo queremos, velocidad lineal, presión o flujo, flujo dentro de la columna capilar. Y si vamos a usar un divisor, quiere decir que todo el resto se tiene que ir por ese divisor. Es decir, que yo tengo la válvula solenoide abierta de una determinada forma. Es una aguja que deja transpasar un determinado volumen para tener esa relación de flujo que a mí me interesa.

¿Cuál es la ventaja de utilizar inyecciones "split"? Es muy fácil de usar, es muy robusto, las bandas analíticas son estrechas, son buenas bandas, protege a la columna de componentes no volátiles de la muestra. Esto, en realidad, es porque asumimos que en esa división de flujo, aquello que no sea volátil, va a quedar, va a quedar en el "liner". Se puede utilizar muestras sucias, para lo cual en el "liner" se coloca lana de vidrio silanizada, que lo que hace es que el "liner" lo que hace es que fuerza a que el líquido se volatilice, vaporice, antes, de tal manera que solamente pasa la fase gaseosa y aquello que no sea gaseoso no atraviesa el "liner". Esto lo que hace es mantener la limpieza del "liner" a un cierto nivel y eventualmente facilita que no se forme tanto carbón en el "liner" que queda retenido en la lana y hay que revisarlo. Y los sistemas de división de flujo son muy fáciles de automatizar. De hecho.

¿Cuáles son las desventajas de usar un divisor de flujo "split"? No es aplicable para el análisis traza, porque evidentemente, al no entrar toda la muestra en la columna, yo tengo una porción de muestra, una porción que va hacia afuera. Con lo cual, si yo tenía, a mí me interesa mantener la proporción relativa de los componentes que estaban en la muestra en la fase gaseosa, en lo que entra de la columna, que sale de la columna, es probable que si el número de moléculas es muy bajo, realmente ya si estaban en trazas, se me haga muy difícil detectarlos. Sufre discriminación, es decir, la división de flujo, los compuestos con alto peso molecular se pierden preferentemente, por qué, porque al ser volatilizados, vaporizados, el "liner", el tránsito a través del "liner" va a ser más lento y, por lo tanto, más fáciles de ser arrastrados hacia fuera del sistema que entrar a la columna. Y también hay discriminación debido a aguja de jeringa caliente. Es decir, ¿qué ocurre? Nosotros cuando inyectamos, la jeringa, las agujas son de acero y se calientan en el "liner", de tal manera de que si yo no dejo que efectivamente se produzca un calentamiento de la aguja que asegure que todos los compuestos pasen a fase gaseosa, puedo provocar perdidas de algunos compuestos. También puedo tener problemas de que compuestos se degraden. Por eso el consejo es introducir la aguja y antes de inyectar, es decir, antes de empujar el émbolo y meter ingresar la muestra al "liner", esperar unos segundos, que se produzca el calentamiento. Y lo mismo después que se inyectó. Obviamente, con los inyectores automáticos no se puede hacer. Se puede asemejar, pero en algunos casos hay que revolver. Depende de la geometría del "liner", o sea, todo el sistema. O sea, que esto ha evolucionado mucho de tal manera de que hay sistemas que ya no pueden ser utilizados para digamos exprimir de la mejor manera posible esta técnica. Y obviamente, los analitos son susceptibles de degradación térmica. Esto es inevitable considerando todo el trayecto que esta.

De nuevo, aquí nos muestra un poco dentro de lo que es la anatomía del inyector, de vuelta el flujo total, sistema de sello, las septas, el divisor de flujo, el "liner", y la columna que tiene que estar sellada para que no se pierda muestra fuera del "liner". Pero fíjense ustedes. Bueno, aquí tenemos la lana de vidrio, que se pone en la posición de la lana. El "liner" depende mucho del tipo de muestra que estemos analizando. Se trata de compuestos con solventes volátiles, se mezcla muy volátil, normalmente está más arriba o más abajo. También hay que tener en cuenta que yo tengo que poner una distancia tal de que la jeringa, la aguja quede por encima, no puedo atravesar si no tiene sentido. Y bueno, acá se ve el movimiento de los compuestos altamente volátiles y los menos volátiles, y se ve cómo se produce ese fenómeno de discriminación.

¿Cuáles son las etapas del proceso de inyección? Tenemos la jeringa, tenemos la aguja, gas carrier, se produce la septa, tenemos el "liner", por fuera está toda la parte calentada del inyector, tenemos la cámara de vaporización, puede estar por acá, y se produce la muestra de la jeringa con o sin evaporación parcial dentro de la jeringa. La aguja, habíamos hablado de lo que se produce como discriminación por aguja caliente. O sea, nosotros queremos que todo se elimine, pero si en lo posible no que se vaporice totalmente dentro de la jeringa, porque no sería muy difícil eliminar todo. Es arriesgarse a guardar muy poco tiempo, inyectar la muestra y luego esperar a que se evapore toda la muestra. La muestra debe ser evaporada antes de alcanzar la entrada de la columna. Y los sistemas de división o no división de flujo, a transferir en la columna toda o parcialmente, según las tres etapas de la inyección. Una jeringa con aguja al caliente, la evaporación de la muestra en la jeringa caliente, de manera que no queda condensación en las paredes, en la aguja. El líquido moja las paredes y lo enfría por la evaporación del solvente. O sea, que esta es la otra posibilidad, y que quede líquido, fluido por evaporación parcial. O sea, que nosotros en estas tres etapas, o sea, lo que tenemos que tratar de hacer es justamente comenzar la evaporación en lugar de lo que podía haber quedado, esto de lo que cuando tomamos la muestra, ingresamos la muestra y luego guardamos, que se produzca toda la ilusión en fase gaseosa. Se entiende. Yo normalmente, como trabajo, tengo una idea, cuento tres, seis. Coloco la jeringa, mientras que la coloco se produce el calentamiento de la aguja. Yo con la mano, manual, todo esto no se produce, y empujo el émbolo, introduzco la muestra y aguardo contando hasta cinco, seis, a que se produzca este fenómeno en el "liner". O sea, dentro del inyector, el vapor se forma a lo largo de toda la pared interna, se presuriza en el centro, la parte líquida se va evaporando por presión, y de tal manera que el líquido sale violentamente y se forma la neblina dentro. O sea, esto es como funciona la aguja. O sea, que fíjense que incluso en la aguja, la forma, nosotros importante.

Entonces, ¿cómo se hace con inyector automático? Bueno, automático, en realidad, si ustedes lo ven actuar, van a ver que produce una inyección rápida, neta, cuando ingresa, atraviesa la septa y luego aguarda y retira la aguja. Aquí lo que nosotros vemos entonces, de nuevo, fíjense, tenemos en verde la fase móvil, las moléculas y el solvente, triángulos, moléculas que nos interesan, son analitos. Las moléculas. Cuando tenemos el sistema abierto, no estamos en una inyección, vemos que el flujo va a purga de septa, un problema, entra al "liner", una parte va a ingresar, dependiendo entonces de las relaciones de división "split", una parte con una, y el resto se elimina por el sistema de "split". Aquí un poco se ve cómo cómo se están, cómo debería ser el sistema de con la jeringa, eventualmente con algún tipo de espaciador si es necesario para evitar que la jeringa penetre mucho, la aguja penetre mucho y demore todo el fenómeno de vaporización. En realidad, esto no se hace, pero en algunos casos, tengan en cuenta que es posible, o también optimizar esta parte.

Aquí está el juego de flujos. Entonces, ¿qué nos interesa? ¿Qué es lo que nosotros tenemos que fijar? En primer lugar, primero la purga de septa. La purga de septa, en este caso, es 2 ml por minuto. Tenemos un restrictor, una solenoide acá, tenemos el divisor de flujo, una solenoide acá, tenemos la conexión y el otro punto. Una vez que fijamos la purga de septa, fijamos cuánto queremos, 1 ml por minuto. Entonces, cuando nosotros entramos, por ejemplo, 49 ml de flujo total, yo 2 lo estoy perdiendo, o sea, que tengo 47. 47 entran al "liner", pero yo tengo 1 ml por minuto, o sea, que se va a ir 46 con esta relación de este flujo. Yo tengo un sistema 46 a 1 con un flujo, una purga de dos. Okay. La purga es permanente, el flujo es permanente, pero esta válvula la voy a regular de tal manera de tener estas condiciones de ingreso. Por lo tanto, el regulador de presión del tanque, flujo, siempre va a estar regulado por las condiciones de ingreso, purga e ingreso de la columna. Todo esto se puede regular, todo automáticamente.

Entonces, ¿cómo se ajusta? Primero, la relación de "split" es la relación de gas cargador y los analitos que están presentes entre el flujo que ingresa a la columna, por ejemplo, 1 ml por minuto, y el flujo que sale por el divisor. Ese es el "split", obviamente teniendo en cuenta los valores de purga fija. Y entonces, esto que está aquí, desde Chrom Academy, pone los valores que yo quiero de "split", me da como se dice, los flujos correspondientes acá y acá, y me calcula cada uno de los valores de "split" teórico y el calculado, el real. Chrom Academy tiene muy buena utilidad. Todo esto se saca de la...

El divisor de flujo. La relación de división de flujo representa la fracción de volumen de muestra que ingresa a la columna. De vuelta, aquí se habla de 1:1 a 50:1, porque en realidad yo puedo, en la práctica, vimos que no es tan así, sino que hay relaciones de flujo. Las más utilizadas, como dije, son 1:10, 1:200. Cuanto mayor es la relación de divisor de flujo, o sea, cuanto más sale por aquí, menor es la cantidad de muestra que ingresa a la columna. O sea, recuerden que yo aquí tengo un flujo prefijo, aquí. Y fíjense si habla de 0.5, yo les dije 1. Eso es lo que se utiliza. Entonces, si yo aumento la relación de divisor de flujo, por lo tanto, para una determinada inyección, lo que a un flujo fijo de la columna, la mayor parte se va a ir. Y por lo tanto, el flujo, la cantidad de muestra que ingresa es menor. Esa es la idea. Yo estoy trabajando con muestras concentradas, que normalmente están muy concentradas en solvente. Ya tiene mucho solvente. Yo no lo diluyo. Si lo concentro, está muy concentrada. Si lo diluyo, tengo mucho solvente fino y un compromiso a cumplir ahí. La división de flujo también la relación evita la sobrecarga en la columna, es decir, evita saturar la columna, superar la capacidad. También evita el "fronting", que es los picos en los cuales se produce, en lugar de la campana, se produce una subida muy rápida y una bajada, lo cual hace que sea muy difícil medir las áreas, o sea, es mal reproducida. La capacidad de la columna depende del espesor de la fase estacionaria, del diámetro interno de la columna y la polaridad de la retención. Todos esos elementos son los que yo tengo que tener en cuenta cuándo calculo los divisores de flujo en función de la mezcla que tengo que analizar de analitos. Fíjense que también los analitos están en distinta concentración, o sea, que es una mezcla compleja. Yo tengo que tener en cuenta no solamente el que está en mayor concentración, sino también los que están en menor concentración. O sea, que esto, en realidad, es en una primera etapa, ensayo y error. Obviamente, la versión de "split" más alta dan picos más agudos, o sea, la separación es más eficiente, mejor resolución. Por qué, porque al tener muy poca cantidad de analitos en la muestra, yo logro que la eficiencia que tengo en platos teóricos la pueda utilizar para menores cantidades de analitos y, por lo tanto, logro una mejor separación de acuerdo a la capacidad de la columna, fase estacionaria. Pero evidentemente, esto me limita a poder utilizar ese criterio cuando yo tengo mezclas que tienen compuestos en concentraciones relativamente similares. En nuestros casos de trabajo, que tenemos relaciones 1000 a 1 o más, o 100,000 a 1, eso es un poco más complicado y, por lo tanto, el ensayo error es el nuevo camino.

El efecto del flujo. Aquí tenemos el mismo ejemplo que está calculado. Y a medida que el flujo del "split" aumenta, el flujo del "liner" aumenta. O sea, si yo tengo mayor salida a un, imagínense esto es una cañería, una tubería, esto es una tubería de menor diámetro. Entonces me entra un determinado caudal, flujo. Yo tengo una salida restringida, por lo tanto, la salida preferencial va a ser la del divisor de flujo. Quiere decir que si yo aumento el flujo, aumento la relación de "split", también aumenta el flujo dentro del "liner". O sea, que el flujo de "liner" es una combinación del flujo de columna y el flujo de divisor. Las muestras gaseosas son referidas más rápidamente a la columna. Sistemas de divisor, por esto mismo que estamos diciendo, de acuerdo al divisor de flujo que yo tenga aquí, el tránsito puede ser mayor o menor, cosa que yo también puedo desear o no, según sean más o menos volátiles, más fácil de pasar o no a fase gaseosa, seleccionando las relaciones. Neto es una. O sea, ¿qué pasa? Perdón, porque es si son gaseosos, son referidos más rápidamente, porque lo que es la banda que yo quiero formar, el anillo de muestra total que ingresó la columna, que se condensa al entrar a la columna, porque recuerden que el "liner", el inyector, el "liner" a temperatura más elevada, o sea, que yo, por ejemplo, paso de líquido a fase líquida en la muestra, a fase gaseosa en el "liner", y al entrar a temperatura más baja en la columna, otra vez paso a fase líquida, o sea, que se condensa. Y la tracción del programa de temperatura hace que los compuestos se vayan volatilizando y, por lo tanto, también ayuda a la separación. Eso más adelante vemos que se llama enfocado por solvente, porque el solvente es el componente mayoritario, por lo tanto, el primero que se volatiliza, se vaporiza, el primero que se condensa, por lo tanto, y me va a salir como trampa de los analitos para formar esa banda estrecha en la cabeza de la columna, de modo de nuevo, insisto, en aprovechar al máximo la performance de la columna en términos de separación. Por lo tanto, el resultado neto es una disminución del ancho de banda del pico. El ancho de banda de todos los picos, de todos los analitos, en la cabeza de la columna, la banda de los analitos se dispersa durante la elusión, o sea, durante el proceso de elusión en la columna, o sea, se va produciendo el programa, todo el fenómeno de separación, pero el ancho de banda inicial tiene impacto sobre la eficiencia de pico, o sea, digamos, sobre el ancho de pico. Cuanto más estrecha sea esta banda, por lo tanto, yo voy a utilizar mejor la columna para la separación y ahí va a depender de mi habilidad para generar un programa de temperatura, elegir la fase estacionaria adecuada y demás. Pero si ya empiezo mal, es difícil corregir. Por ejemplo, aquí se ve el efecto del flujo de "split" en la forma del pico.

Entonces, ¿qué hicieron? Se trabajó con n-alcanos, alcanos lineales en hexano. Entonces se vio de que la cómo se producía la recuperación de acuerdo al número de carbonos en "split". Entonces se ve que a medida que el número de carbono es mayor, la recuperación es menor, o sea, se produce una discriminación de 37 en el caso de 37 carbono, que no hay ningún problema hasta unos 20 carbonos. Se pierde algo, pero 20 carbonos, 18, 20 carbonos, y luego aparecen problemas. Esta discriminación debida a diferencia en los puntos de ebullición, que está relacionada también con el peso molecular. En el caso de compuestos que forman series homólogas, es decir, que aquí lo único que hay es aumento de un carbono en cada compuesto. Y esto es lo que es una inyección con divisor de flujo de una solución conteniendo cantidades iguales de n-alcanos en hexano, es decir, solución. Una situación ideal para producir. Fíjense que en cualquier caso, la forma en que se produce la discriminación aumenta. Y a medida que aumenta la discriminación, quiere decir que demora más en atravesar el "liner" y, por lo tanto, cuando llegan a la columna, ya se empezó a producir el hexano, evidentemente, ya se volatilizó y los analitos comienzan a avanzar en la columna cuando están llegando los de mayor peso molecular, los de mayor punto de ebullición, lo cual significa que van a venir más atrás en la columna. Vean que estos son compuestos que no tienen interacción con la fase estacionaria, con ninguna fase estacionaria, porque es una polar, una fase poco polar o una fase polar, no va a hacer diferencia. Pero esto es lo que muestra, por eso muestra claramente que se produce el ensanchamiento de los picos.

En resumen, trabajando con inyección en modalidad "split" y divisor de flujo, es la que se utiliza por defecto como vaporizador. Todos los inyectores, es decir, todos los inyectores de cromatografía gaseosa.

A menos que uno pida lo contrario, son split, splitless, y por defecto están la válvula de splitless. La válvula no está cerrada. O sea, que está, está en sistema de división. Deu se utiliza fundamentalmente de análisis volátiles, volátil que no se encuentra como trazas. O sea, como vimos, no es bueno para trazas por el sistema de pérdida de moléculas de analito. Eh, requiere considerar cuidadosamente los flujos de gases, particular el flujo de split. Y, o sea, fijar el flujo de la columna, fijar el flujo de split, y no olvidar nunca el flujo de purga de septa en el cálculo que se está haciendo.

Un aumento en el flujo split, como vimos, provoca mejora la forma del pico porque te atraviesa más rápido. Disminuye la carga de la columna, es decir, no ingresa como una banda, ¿verdad? Todos los compuestos como una banda que luego, en primer lugar, avanza el solvente que tenga ninguna interacción con la estacionaria y luego los analitos. Pero de tal manera de que no se, no se colapse esa columna. Y el flujo evita que la capacidad de la columna sea saturable. O sea, la cantidad de analitos que se incorpora, número de moléculas y la concentración, no nos interesa el momento y no cuando la concentración. Por qué nos interesa, nos interesa el número de moléculas que entra la fase estacionaria que son arrastradas por la fase móvil. Por lo tanto, lo que tenemos con el divisor de flujo es disminuir esa carga a la capacidad propia de la columna, que es algo que compramos. Eh, obviamente, disminuye el divisor de flujo, trabajar en split disminuye la sensibilidad analítica. Es la misma razón por la cual trazas, es decir, pierdo analitos en el sistema. Disminuye el tiempo de residencia lineal. Ya vimos por qué, con lo cual también se produce una reducción de posibles degradaciones térmicas. Y siempre debemos considerar el efecto de discriminación, como vimos, por, eh, ya sea por el tema de elevado punto de ebullición, o sea, menos menos volátiles. Y eso hay que tener en cuenta tanto en las temperaturas del liner como en los flujos que se utilizan. Discriminación en mezclas de una enorme diversidad de compuestos, como la que hacemos nosotros, es importante. Por lo tanto, ventajas: muy fácil de usar, diseños muy robustos, tienen bandas estrechas en el eluto en la columna que produce, ayuda a una buena resolución, protege la columna de compuestos muestra, y es muy fácil de automatizar. No se puede aplicar a trazas, sufre de discriminación. La geometría es importante y puede producir degradación térmica. O sea, lo que ya vimos, lo reafirmamos ahora con un poco más de fundamento.

¿Qué pasa en splitless? O sea, cuando no hay divisor de flujo, ¿qué ocurre? Aquí, como otra otra forma de inyectar la muestra para columnas capilares, la técnica splitless, la cual es particularmente útil para muestras muy diluidas, dado que en este caso el sistema concentra la muestra en la entrada de la columna. O sea, partimos de la base de que nosotros tenemos una muestra que está tan diluida, tan diluida, que si seguimos evaporando, nos quedamos sin muestra. O sea, seguimos eliminando solvente, nos quedamos sin muestra. Por lo tanto, vamos a concentrar la muestra a través de un sistema de ingreso total de la muestra a la columna. Aquí se muestra un ejemplo, otra vez un cálculo, ¿verdad? Yo tengo, eh, toda la, lo que vimos antes, un flujo de 1 ml por minuto. Esto no cambia, ¿verdad? Una purga de septa, este caso, en este ejemplo, de 3 ml por minuto. Y para lograr esto con 104 ml por minuto, ¿verdad?, tenemos que hacer tener un split. O sea, yo quiero un split de un 100, tengo que tener 104. Esto es en los, por eso el calculador de cromac está bueno. Puedo decir por dónde yo empiezo. Bueno, hay cosas que tengo que fijar, como dije, la purga de septa y el flujo de columna. Luego quiero saber qué dilución de split voy a utilizar y, por lo tanto, voy a tener el flujo de ingreso. ¿Verdad? Todo eso, eh, se calcula a través del software.

Bueno, esto es lo que estamos viendo en este. Como vimos, cómo ocurre en un inyector de tipo split, split con split funcionando perfecto. ¿Qué pasa con en splitless? Lo que está pasando es que esta parte está cerrada, esta válvula está cerrada. Entonces, en la realidad, yo, en el mismo ejemplo de hoy, yo lo que tengo es una, yo quiero que esto esté cerrado, ¿verdad? Quiero 1 ml por minuto, quiero 2 ml en la columna, 2 ml por minuto en la purga, y lo quiero cerrado. Entonces, ¿qué va a pasar? Yo tengo que, de los 49 ml por minuto, ¿verdad?, dos acá, uno acá, me quedan 46. Pero tengo el split cerrado, o sea, que no pierdo muestra. En este caso, todo se va recorrido a través de la purga de septa. Y como este es un restrictor que no me deja que pase más de 2 ml por minuto de salida, todo el resto se va por acá. Okay. Ahora, aquí hay un pequeño punto a tener en cuenta. ¿Cuál es el flujo en el liner en esta situación? El flujo en el liner es de 1 ml por minuto, porque todo el, esto se está yendo por acá arriba. O sea, que no llega a entrar al liner 1 ml por minuto. Es extremadamente lento. O sea, que en algún momento, ¿verdad?, yo tengo que abrir la válvula de split para lograr barrer todo lo que está en la cámara de inyección, el liner. Y eso se hace en segundos. Normalmente, las aperturas máximas están en el de los 60 segundos. Splitless, no más de 60 segundos de split. Y luego se abre la válvula automáticamente y permite que todo el resto de la muestra que haya quedado aquí, si hubiera algún tipo de discriminación, fíjese que por punto aquí sería muchísimo mayor. Por lo tanto, cerrado. Se entiende. O sea, en este caso de splitless, yo ingreso toda la muestra. Pero el problema que pienso tener es que como no tengo flujo atravesando el el liner que no sea aquel que va directamente a la columna, porque el resto se va por acá arriba, ¿verdad?, yo tengo un flujo muy lento a través, transporte de los analitos muy lentos. Por eso nosotros a los 5, 10, 15 segundos abrimos, ¿verdad?, la división, el divisor de flujo, de tal manera que, ahora sí, pasa todo por acá, aumenta normalmente el flujo, ingresa toda la columna, ¿verdad?, y en esos segundos es lo que tratamos de que no se produzca el ensanchamiento de las bandas. Eso también se regula por acción de la temperatura en los programas de la.

Bueno, aquí se ve exactamente lo que ocurre. No lo voy a, no lo voy a repetir. Los números son otros, ¿verdad? Es decir, yo quiero 1 ml por minuto en la columna, quiero 3 ml por minuto en la purga. El restrictor lo va a mantener 3 ml por minuto. O sea, que yo para lograr esto, ¿verdad?, tengo que tener una salida por encima, ¿verdad?, de 50 ml por minuto. Y esto de 50 ml por minuto lo pongo porque después tener un split 51. O sea, fíjese aquí, yo tengo 1 ml por minuto y este, ¿cómo se llama? Al estar cerrado todo por arriba y acá solo tengo uno, yo al contrario, cuando abro el split, tengo 51 ml por minuto. ¿Verdad? Uno se va a la columna y el resto entra. Una aceleración. ¿Se entiende? Es el secreto de split. No se cambia. Una vez que se ha ingresado, pero en splitless, solo se, solo se inyecta una fracción de tiempo y luego se abre para mantener esta, ¿cómo se llama?, un tránsito rápido de todos los analitos que hayan quedado. ¿Verdad? Aquí, si ustedes se fijan con un poco de detalle, aquí hay una trampa, que es que la mayor parte de la inyección de cualquier tipo de inyección, sobre todo en estas que son muestras muy concentradas, ¿verdad?, la mayor parte es solvente. Entonces, si yo hago este juego durante 30 segundos, por ejemplo, voy a tener que en el liner, con el tránsito es muy lento en el liner, yo voy a tener mucho solvente y analitos. Hablo el split, empezó a entrar en la columna algo de solvente y analitos. Pero cuando abro el split, la mayor parte de lo que se va a eliminar, ¿verdad?, va a ser algo de analitos también, pero va a ser solvente. ¿Por qué? Porque es el componente mayoritario. ¿Entienden? También es una forma de concentrar los analitos. Este es un juego muy delicado porque trabajando con trazas, para todo esto tiene que ser regulado en forma óptima y depende, óptima y depende sobre todo de la, digamos, de la composición de los analitos, su volatilidad, ¿verdad?, o diferencia de volatilidad entre ellos y el solvente. O sea, que la elección del solvente también es muy.

Bueno, esto acá es lo que se explica, o sea, cómo funcionan splitless. Primero, esta válvula aquí, este pasaje está cerrado, pero pasa, eh, a través de este sistema, la válvula. Esto en realidad no es una cruz, debería ser una T, ¿verdad?, en la cual está cerrada el pasaje, la salida por el divisor, pero no la salida desde la purga. Utiliza el mismo principio de inyector split. La diferencia incluye que el estado inicial de inyector splitless, ¿verdad?, está el flujo split está cerrado por la válvula de tres vías, por la T, ¿verdad? Todas las muestras, este, inyectadas, ingresan. Todas las muestras inyectadas ingresan a la columna. La muestra gaseosa queda atrapada en la cabeza de la columna por, eh, temperatura, solvente. Pero al mismo tiempo nos encontramos con ese tránsito, es muy lento, ¿verdad? O sea, que, eh, tenemos que programar la temperatura, obviamente, adecuada nuevamente para iniciar elución y en algún momento, segundos, luego la transferencia a los, la columna, el split se vuelve a abrir para vaciar el liner, ¿verdad? Y es diseñado para análisis de trazas, trazas. Pero además, yo les indico que jugando con las temperaturas en el liner y con los tiempos de apertura y cierre split, yo puedo eliminar preferentemente solvente. Que los pasos a seguir. Aquí vemos, se cierra la válvula de split, o sea, que este se requiere la purga de septa, o sea, se mantiene, se inserta el inyector, la jeringa, y se, eh, de 5 segundos, lo de siempre, se inyecta lo que corresponda. Pero no son mililitros, son microlitros. En la columna, este que está, ¿verdad?, y se abre la válvula 45 segundos. En realidad, en realidad, entre 10 segundos es lo que uno tiene que decidir. Y luego el flujo pasa a ser, eh, 30, 50 ml por minuto, lo que está entrando en el liner. Y este se inicia el programa de elución en el horno, justamente para facilitar que lo que yo entré la banda sea estrecha, retenga todos los analitos por el barrido que estoy produciendo, apura. Y al mismo tiempo, como y le dije, con un poco de, eh, se puede eliminar la mayor parte del solvente.

¿Cuáles son las ventajas de splitless? Alta sensibilidad, más del 95% de la muestra entra la columna. Aquí entendamos por muestra dos cosas. Una cosa es son los analitos que nos interesa, pero dentro de la muestra también está el solvente. Ustedes vieron que jugando también con esas aperturas, cierre divisor de flujo y con las, con la volatilidad relativa, ¿verdad?, del solvente frente a los analitos, eligiendo solvente, yo puedo eliminar preferentemente solvente, ¿verdad?, que va quedando en el liner. Mayor concentración, un poco más de concentración, es reproducible. Y el efecto solvente, que es lo que yo les decía, es lo mismo que ocurre en el split con bandas iniciales angostas, el enfocado.

¿Cómo es el flujo de gas en splitless? El flujo a través debe ser igual a la columna. La etapa, les decía, si yo tengo cerrado el divisor de flujo, ¿verdad?, la mayor parte se va por encima, el recorrido por la purga no pasa por el. Como yo fijé flujo que sea 1 ml por minuto en la columna, ese va a ser el flujo en el liner. Es lento. O sea, el analito le puede tomar minutos, ¿verdad?, para llegar a la columna. Por eso yo tengo que abrir para lograr barrer con flujo alto todo lo que está. Si no se toma ninguna acción, los picos cromatográficos serán de un ancho inaceptable. Es decir, van a quedar lentamente entrando la columna, no se produce la banda estrecha y se va a producir todo un ensanchamiento. Es decir, bandas en la, cada pico, la verdad, como consecuencia de este, esta discriminación. La respuesta es enfocar los analitos y el solvente de la cabeza de la columna utilizando la técnica de enfocado térmico y por solvente, de acuerdo. O sea, que yo voy a trabajar con la temperatura en el liner, con la temperatura en el programa de la columna y con los flujos que me hagan factible trabajar con, digamos, con enfocando con solvente. Por lo tanto, las condiciones deben ser muy bien estudiadas para cada muestra. Y en realidad, eh, siempre nosotros empezamos trabajando en split y luego nos vamos pasando por una de las cosas que nos ocurre, además trabajando con splitless, es que si en nuestro caso, por ejemplo, como les decía, muestras muy complejas, más de 100, 200, 300 compuestos, los compuestos pueden estar en relaciones de concentración, contenido muy variable, y puedo tener relaciones de 100,000 a 1. Y eso hace que si yo no cuido esto, se produzca una saturación del detector. El detector se satura, no logra medir todos los analitos para un determinado pico o más. Y por lo tanto, en la etapa de cuantificación, yo pierdo información. A menos que lo haga a propósito para esas condiciones y los compuestos mayoritarios los mida de otra manera, que es algo que también se hace. Error, pero permite acceder a más información.

¿De qué se trata el enfocado térmico? La regla de oro dice que la temperatura inicial del horno debe estar 10 grados Celsius por debajo del punto de ebullición del solvente, por lo menos. O sea, yo tengo un gradiente de temperatura entre los bloques del inyector y la columna que atraviesa. Lo que le da continuidad, ¿verdad? Este es el liner, está el cierre del liner, la columna capilar que se continúa por el horno. Yo tengo un gradiente de temperatura entre la temperatura de la columna dentro del horno, 40 grados, por ejemplo, y de 250 grados en el inyector. Esto es un gradiente importante de temperatura. Por lo tanto, yo lo que puedo hacer en este caso es, eh, condenso la mayor parte del componente de toda la muestra que es el solvente. Y el solvente, al condensarlo aquí en la primera parte de la columna, en el horno, lo utilizo también como trampa para los analitos. O sea, yo pasé de fase líquida, el solvente disolvía los analitos, a fase gaseosa, todos pasaron a fase, vaporizar, pasaron a fase gaseosa. Vuelvo a comenzar y como el solvente es el componente mayoritario, logra formar una banda de solvente al inicio de la cabeza de la columna en el horno, unos, eh, lo más estrecho posible de acuerdo a esta diferencia de temperatura. Y de esa manera, los analitos se van a disolver en el solvente, ¿verdad?, para luego el solvente se reevaporar rápidamente porque es mucho más volátil. Y los solventes se van evaporando, se van volatilizando lentamente en orden de volatilidad y en orden de interacción con la fase estacionaria, si es que tienen interacción. Fíjese qué interesante, como jugando simplemente con temperaturas, ¿verdad?, se puede lograr una mejora en la resolución, justamente porque por ese fenómeno de enfocado permite una banda total estrecha donde el componente es el solvente, que yo puedo eliminar primero el solvente. No lo voy a cuantificar, así que yo puedo eliminarlo perfectamente de toda la consideración de picos integrados, ¿verdad? Y aquí es el tema de solvente. Nos muestra la misma temperatura, todo lo mismo. Aquí tenemos el fin de solvente, los analitos quedan retenidos, se disuelven nuevamente, ¿verdad? Y si la temperatura del orden del horno inicial fuera de 40 grados, 40, yo tendría, ¿verdad?, para alcanos en disulfuro de carbono, fíjese que utilizamos solvente extremadamente volátil, ¿verdad?, eh, veíamos que se produce este tipo de fenómenos donde los primeros componentes que eluyen, ¿verdad?, esto no importa la fase estacionaria, la estacionaria son alcanos, no tienen interacción, interesa el punto de ebullición. Fíjese que a 70 grados, una temperatura relativamente alta, los primeros componentes no se resuelven bien porque no se formó esa banda. Decía, mientras que a 25 grados de temperatura, un tratamiento especial del horno, digamos, posible, yo podría, ¿verdad?, bajar y ver una excelente resolución. Y asumamos que esto pudiera ser el solvente, fíjese que prácticamente se logra, ¿verdad?, se supone que todos estos compuestos están más o menos en la misma concentración, o sea, se logra, ¿verdad?, una mejor respuesta si el ancho de los picos es más parecido, lo cual el área, eh, bajo bajo el pico, ¿verdad?, que son similares. Aquí se complica un poco, ¿verdad?, justamente por ese fenómeno de diseminación que ensancha el pico. Es decir, la combinación de temperatura y solvente es lo que ayuda justamente a que esto funcione bien. Okay.

Eh, volvemos a a repetir lo mismo. En este caso, la importancia de solvente. Fíjese que los picos en este caso, bueno, el solvente, fíjese lo que es. No solvente, a nosotros nos interesa, sigue siendo mayoritario. Por más que hayamos logrado eliminarlo mayoritariamente, los picos está bastante bien, pero hay algunos que están muy bien enfocados, ¿verdad?, por el efecto atrapado en frío. Una está 40 grados, otro está 250 grados. Y de cualquier manera, hay una forma no adecuada de los picos, ¿verdad? Sí, eh, debido a falta de coincidencia de la polaridad entre el solvente de la muestra y la polaridad de la fase estacionaria. ¿Qué quiere decir que también, ¿verdad?, tenemos que tener en cuenta la polaridad del solvente y de la columna? Es decir, que el solvente que yo estoy utilizando, que es muy volátil, que va a quedar retenido en la en la columna y luego se va a evaporar, tiene que tener, eh, una polaridad similar, ¿verdad? O sea, disolver los analitos y tener un comportamiento similar con la de la columna, de tal manera de que no haya, no se produzca que los analitos, ¿verdad?, queden más retenidos, ¿verdad?, de lo que debieran. ¿Se entiende? O sea, igualar polaridad de solvente, la columna. O sea, que el solvente que se utiliza.

Bueno, lo que vemos acá, la optimización del tiempo de purga, o sea, el tiempo en el cual se produce la salida, se produce la apertura del split. Perdón. Entonces, acá lo utilizo un pico de elución temprana, ¿verdad?, no de estos de los que primeros que eluyen, para determinar el tiempo de transferencia. Acá vemos que el área del pico es, ver, área versus tiempo de retención splitless, ¿verdad?, del carbono 9, como función del tiempo split. No, si este es el carbono 9, fíjese que yo voy logrando, a medida que aumento el tiempo splitless, logro, ¿verdad?, que el área aumente, o sea, la mayor transferencia. Y luego, o sea, hay un valor ideal de luego, cual la transferencia ya no es buena. O sea, que el tiempo aquí estaría entre 3.5 y 4 segundos como óptimo para calcularlo para C9. ¿Qué si no lo, no lo hacemos de esa manera? Si fuera el tiempo es muy corto, ¿verdad?, se pierde, eh, ¿verdad?, pérdida de analitos de alto punto de ebullición. O sea, perdemos algunos. Si lo calculamos para C9, va a andar bien, pero para el resto podemos perderlo justamente, ¿verdad?, este, porque vamos, vamos a arrastrar rápidamente hacia afuera. No logramos. Si el tiempo de splitless es muy largo, el pico de solvente va a ser muy ancho y, eh, o sea, no vamos, vamos a tener el tiempo muy lento de tránsito, va a pasar mucho solvente y, eh, algunos picos que pueden quedar montados sobre el solvente. ¿Entienden? O sea, si el tiempo ese de apertura que se acá se calculó, ¿verdad?, se calculó de esta manera, eh, por, digamos, para tener idea de que hay valores que deben ser optimizados. Eh, si ese tiempo de, digamos, el split está cerrado y luego se abre, ese tiempo muy corto, el problema que tenemos es que podemos llegar a perder por discriminación algunos, lo de mayor punto de ebullición, porque efectivamente no llegaron a entrar a la columna cuando se abrió. Se está hablando siempre de compuestos trazas. Salieron, se perdieron. Mientras que si es muy largo, es mucho solvente el que va a ingresar. Se parece un romp es, pero efectivamente lo que está diciendo simplemente es que de acuerdo a la velocidad y la temperatura en la cual los compuestos atraviesan el liner, dependen, ¿verdad?, de cuánto tiempo yo tenga abierto el divisor y cuánta muestra estoy introduciendo. Si yo trabajo con muestras que son concentradas, hago una división constante, o sea, tengo el split abierto, una relación que yo fijé, ya vimos cómo, teniendo en cuenta la purga, teniendo en cuenta el flujo de la columna y después calculando qué divisor me sirve, ¿verdad?, para optimizar que no se, este, que se una buena resolución sin saturar la capacidad de la columna. Por el contrario, cuando trabajo muestras muy poco concentradas, ¿verdad?, muy, muy poco concentradas, yo tengo fundamentalmente solvente. Entonces, lo que yo quiero es ingresar toda la muestra a la columna, de tal manera de aprovechar, hacer la, poder determinar en concentraciones extremadamente bajas. Pero tengo mucho solvente. Entonces, lo que tengo que lograr es primero conocer la composición de mi mezcla, ¿verdad?, de tal manera de saber si hay compuestos con punto de ebullición diferente. No hay otra forma que hacerlo, a menos que sea rutina y ya lo tenga validado. Una vez que tengo esa información, yo lo que tengo que hacer es ajustarlo de tal manera de que no sea, y muy largo, de acuerdo a que se determinó para, de, en primero, se puede determinar para otros, pero de tal manera que el tiempo no sea ni muy corto ni muy largo para evitar o pérdida de analitos o problemas con.

Entonces, en splitless tenemos algunas desventajas, o sea, que optimizar muy bien las condiciones. El riesgo de backflash, que es lo que vamos a ver ahora. Y obviamente, con los tránsitos son muy lentos, puede haber degradación térmica. Pero como ventaja es muy fácil de usar, excelente para trazas, es, este, discrimina mucho menos analitos que el modo split, porque la discriminación con la optimización se logra sobre todo para el solvente. Y es muy fácil de automatizar. Eh, bueno, aquí lo que vemos, este, exactamente lo mismo pero más explicado. No lo voy a leer, ¿verdad? Trata de explicar más detalle qué es lo que ocurre en cada una de las situaciones, ¿verdad? Lo mismo que vimos adelante, hoy en las previas, tiempos cortos, tiempos largos, 5 minutos, un minuto. El máximo está alrededor de 30, 60 segundos para la mayor parte de los casos, pero también obviamente depende de la composición de las. Los tres pasos de inyección split son: inyección, almacenamiento temporal de vapores, es aquí de la muestra está cerrado, se que todo, todo se va por la purga aquí arriba y costado, luego entra la columna, se abre y se logra barrer todo el.

Bueno, aquí de vuelta está la, las, como funciona de inyección directa, hay split con split, el uso de lana de vidrio, ¿verdad? Este es [Música] una una tontería, pero dice que la lana de vidrio tiene que estar silanizada, ¿verdad? Para este caso, para los pesticidas. Para los cálculos de flujo, ¿cómo ocurre? Recuerden que acá hay un reductor, una purga reductora de flujo que fija esa purga y no permite salir más. O sea, que si yo no tengo es abierta, eh, si la válvula que se vio en la válvula, si la válvula está girada para que por aquí no salga nada, va a salir todo por acá arriba. Y tengo que fijar, trabajar cuando vuelve aquí el flujo por minuto. Recuerde que lo que fija el flujo de entrada es la columna, la y luego la relación que voy a utilizar desde inicio. Bueno, los sistemas de reguladores, lo mismo, sistemas de inyección. Se vuelve a explicar: purga abierta, split, purga cerrada. Así como funciona la válvula de tres vías, ¿verdad?, con un regulador para que el flujo de la purga no cambie en todas estas manipulaciones.

Bueno, el problema de la saturación. Esto nos conduce cuando la muestra que estamos inyectando se vaporiza en un volumen mayor del liner, ¿verdad?, que es entorno de 5,000 litros, más o menos de 5,000 litros. Entonces, ocurre que puede retroceder contrapresión, puede retroceder, eh, por acción de la, esa expansión tan rápida de solvente a un retroceso, es lo que se llama backflash, que ahora vamos a ver.

Bueno, eh, más ejemplos que muestra la eficiencia de un sistema y el otro. Aquí se nos muestra esta banda que yo les mencionaba. Esta es la banda adecuada. Esta es muy ancha, ¿verdad? Y las razones por los cuales se busca que sean estrechas y no anchas. Todo el tema luego de la separación, eficiencia. Aquí se muestra solvente, los. O sea, que yo tengo la, la muestra que ingresó, ingresando toda la columna, solvente, analitos. Sin embargo, en solvente siempre va a ingresar volátil, por lo tanto, van a ingresar primero a la columna, van a quedar atrapados nuevamente, se condensa, los analitos quedan y el solvente, ¿verdad?, parte rápidamente de acuerdo a la temperatura que estamos utilizando. Riesgo aquí, como dijimos, discriminación por. Vamos a abrir el split rápidamente para tratar de eliminar la mayor parte del solvente y tener el mismo juego.

Bueno, ¿cómo se produce ese sistema, ¿verdad?, en el cual la fase móvil, ¿verdad?, logra enfocar, luego enfocar la cabeza de solvente, el vapor de solvente, cómo se van produciendo los mayor o menor, de tal manera que lo que se va a producir luego es que la banda de solvente sale con los más volátiles y los otros quedan. Y aquí juega de nuevo los dos conceptos, dependiendo de la naturaleza de analitos, que es la interacción, eh, con una fase polar muy baja o muy alta, dependiendo también de la naturaleza de estos compuestos de bajo punto de ebullición, que se mueven muy, retenerlo solo puedo hacerlo a través de la interacción con la fase estacionaria.

Bueno, ventaja de splitless, para insistir en esto. Transferencia lenta de la muestra, se evita consumo de tiempo. Hay que enfriar muy bien el horno para jugar. Hoy día esto no es un problema. El tema aguja caliente, la jeringa es el mismo problema. Y si los compuestos son termolábiles, tendemos problemas de de composición potencial.

¿Qué es el backflash? Cuando un solvente líquido se transfiere al inyector caliente, se expande al volatilizar, al evaporarse, se expande. Si el volumen del inyector no es lo suficiente grande como para contener toda esa expansión, es una expansión muy rápida. Puede ocurrir el problema llamado backflash, es decir, donde hay retroceso de solvente. Si la masa se expande tanto que puede alcanzar la zona de purga de septa y parte de la masa se puede perder a través de la purga de septa o, peor, se puede condensar en la parte más fría del inyector, por ejemplo, en la entrada de las cañerías de gas, fase móvil, se condensa y se volatiliza lentamente, o sea, pico fantasma por todos lados. Entonces, pasa todo este problema. No hay que tratar de evitar ese problema, no.

Bueno, esto está repetida aquí. Está ver cálculo de determinación del volumen óptimo depende de todo esto. Volumen de expansión depende. Este es un calculador de Chrome Academy. Depende del tipo de solvente, la temperatura del inyector, la presión del de la fase móvil y, eh, depende el backflash, ¿verdad? O sea, el volumen de expansión depende de esto. El backflash depende del tipo de liner, o sea, el volumen del liner, del volumen como expande ese líquido a vapor y lo que se inyecta, obviamente. Los liners pueden ser distintos tipos. Estos son para distintos tipo de aplicaciones. Y fíjese qué ocurre. Se acuerdan que habíamos hablado de separadores, pero también ocurre el problema de si la aguja es muy corta, se produce también retroceso de la vaporización, se produce muy alto en el liner y por lo tanto se puede perder algo por, por más que la purga se produzca, ¿verdad?, va a aparecer ese problema de qué parte se puede ir. Por lo tanto, también hay que tener precaución. Que la geometría, los solventes expanden en distintas cantidades. Por ejemplo, fíjese el agua, un microlitro expande 14 veces. O sea, que si yo inyecto un microlitro, ya tengo 1 ml ocupado. Si inyecto dos, casi 3 ml. O sea, que posiblemente ya acá nadie va a inyectar 5 microlitros, pero en 2 microlitros ya estoy cerca de ocupar todo el volumen de determinado tipo de. Lo mismo se ve para el carbono, para el diclorometano, para el hexano y para el etano. O sea, que es un elemento. En este caso, inyector 250 grados, ¿verdad?, es lo que ocurre. O sea, que el volumen de expansión tenemos que tenerlo en cuenta y, por supuesto, cuánto inyectamos.

Bueno, en la solución, esto es un, lo que llama troubleshooting, solución de problemas en las fases, ¿verdad? También hay que tener en cuenta que puede ocurrir degradación térmica. Eso se relaciona con la, con la temperatura de inyector. O sea, recuerden que, como vemos aquí, como vemos aquí, ¿verdad?, la columna es lo que le da continuidad entre el liner, ¿verdad?, y la propia, es decir, luego el horno de separación. Quiere decir que si yo trabajo con, eh, cómo se llama, trabajo con temperaturas muy altas en el en el inyector, en el liner, parte de la columna está ahí, puede tener descomposición de fase, que da comportamiento errático. O sea, que lo que se sugiere es usar 250 grados, eh, como por defecto para probar. Esto depende de la muestra, obviamente. Pero bueno, para tener una idea, van a ver después cuando de detectores, el detector normalmente está a no menos de 30 grados por encima de la temperatura del inyector. Esto para asegurarse que todo lo que eluye efectivamente pase por el detector. Eh, la problemas que pueden aparecer. Esto es lo que yo llamaba fronting. O sea, fíjese que el pico ya no es gusano, sino que aparece, ¿verdad?, más agudo, más vertical. La primera parte es asimétrica. Esta asimetría se da por problemas de discriminación. Y esto es porque el liner puede estar reteniendo selectivamente algunos compuestos, o sea, compuestos de tal manera que lo va liberando lentamente, se produce ensanchamiento, pero además un ensanchamiento irregular. Por lo tanto, los liners desactivados no dan problemas de la.

Sangrado de septa, ¿verdad? En splitless se ve muy bien, ¿verdad?, este tipo de sangrado que en split se ve de esta manera, ¿verdad?, digamos, mucho menos concentrado. Eh, cuando hay problemas, este es por problema de sangrado, quiere decir que la septa no es la adecuada para estamos trabajando y se descompone. También puede haber fugas en la septa, o sea, que la septa está perforada. La primera, lo dicen, no son, tienen flujo cabeza, pero digamos que en cualquier caso, no movíamos una cosa normal. Esto es un aumento de flujo, es decir, que está ingresando más flujo, cambia la línea de base, o disminución de flujo, cambia la línea de base hacia abajo. Es decir, esto ocurre, se comienzan las corridas, ¿verdad? Es decir, en cualquiera de estos casos tenemos problemas con las septas. O sea, que las consideraciones sobre los problemas es cuáles son los límites de temperatura. Las septas vienen de acuerdo a su uso con de temperatura, encima de las cuales no se puede trabajar. Que la forma y tamaño, muchos son como taponcitos, otros son como un disco plano. Qué material, muchos son, o sea, tienen distintas capas de material. Siempre la idea es que sean perforables, o sea, romas, ¿verdad?, y el elastómero debería volver a cerrarse. Y puede estar prep perforada, prep perforada como el caso de esta, en el cual no es que esté aguja, sino que hay una prep perforación que es lo que guía las agujas con los inyectores automáticos. Nosotros manualmente tenemos tendencia a inyectar en cualquier parte, pero con los inyectores automáticos, más de 100 empieza a haber problema. Las tomas, uno aprieta, ¿verdad?, la tuerca que que lo que está por fuera para que se l más, pero un cierto tiempo también.

Para finalizar, vamos a hablar de los inyectores de temperatura programada. ¿Qué significa más y menos que eso? El inyector, ¿verdad?, se se programa para la temperatura de calentamiento de 999 grados por minuto. Se llaman calentamientos balísticos, ¿verdad? Y de esta manera, lo que yo logro es que se logra en el liner una expansión violenta, ¿verdad? Y en algunos casos permite, ¿verdad?, que se logre una discriminación importante. Por ejemplo, yo siempre un ejemplo trabajando con residuos de pesticidas en aceite esencial. Nosotros lo que hacíamos era inyectar el aceite neto, sin solvente, de tal manera que al programar el tránsito 999, en este tránsito, ¿verdad?, se producía una evaporación, eh, mayor de los componentes del aceite esencial, que son mucho más volátiles que la mayor parte de los residuos que analizábamos en aquel momento. Por lo tanto, el se comportaba como un solvente, se perdía mayoritariamente por el split y entraba a la columna, atravesaba la columna, ¿verdad?, y luego, eh, actuando como solvente y luego, ¿verdad?, avanzaba y se lograba la resolución de los, eh, residuos que nos interesaba. Sí. Bueno, aquí es como se ve, ¿verdad?, este y cómo funciona, ¿verdad?, los vapores de inyección y la muestra durante el periodo sin división. Este PTB con división de solventes, o sea, utilizando en este caso aceite esencial, inyectando splitless, lográbamos, ¿verdad?, eliminar el aceite y además que lo pueda quedar. Este no es un buen sistema. La inyección manual, ¿verdad?, lo que parece aquí. Tenemos cómo cargar una jeringa. Fíjese, las jeringas son biseladas, agujas tienen forma de cuña, son biseladas. No vamos a entrar en detalle, hay muchos tipos de jeringas, pero todas tienen esta forma que perfora la septa. En HPLC no hay septa, pero fuera de la septa y se retira de tal manera de no retirar, que no actuar como sacabocado, no saca el pedacito de, sino que lo vuelve a cerrar. Por eso el concepto de las. Bueno, no se puede hacer directamente la muestra de la parte roja, inyectando la muestra directamente. Se puede colocar aire arriba. Esto es lo que normalmente hacemos, ¿verdad?, con lo cual no tiene ni idea del volumen real, porque la aguja tiene un volumen. El agente eluyente, ¿verdad?, pone aire arriba y ahí debajo, de tal manera de que es el volumen inyectado y tengo un aire que desplaza todo lo que queda dando la jeringa. O sea, el concepto de facilitar la discriminación en aguja. Y quien ya son, pueden poner algo de solvente arriba y así sucesivamente, logrando entonces un enjuague de la jeringa, ¿verdad?, con el solvente. La incisión con aguja caliente, ¿verdad?, ayuda a eliminar el fenómeno de discriminación. Eso ya lo vimos, ¿verdad? Tirar el émbolo hacia arriba, la muestra se desplace arriba la jeringa, jeringa a continuación se precalienta el inyector durante varios segundos. Yo cuento, ¿verdad?, y, eh, y luego inyecto y dejo también segundos. O sea, todo 5 segundos. Los inyectores se ensucian acá, acá, o sea, aquí es en la zona de la septa, en la zona del ingreso del liner, en la parte superior, en la parte inferior del liner, y también en la columna. ¿Por qué sucios? Es decir, si nosotros cuando instalamos la columna, ¿verdad?, este, acuerdan que hay que cortarla y demás, tenemos los, están engrasados todo el tiempo. Se ve como es una corrida en blanco y como es una de papa frita. O sea, que el tipo estaba comiendo, fantástico, a mí me encanta, pero el problema que tenemos es que, eh, podemos correr este tipo de riesgos si no purga las columnas.

El líquido, el tipo limpito se lavaba las manos, pero fíjense todo el tipo de compuestos, sobre todo volátiles de aroma, que hay en un jabón líquido. Bien, finalizar está. Yo insisto, como insiste Danilo, como insiste Bruno, como insiste Guillermo, como insistirá Natalia y Laura, ¿verdad?, en el hecho de que Chrome Academy es fantástico. Aquí está mi usuario, Power, ¿verdad? Llevo unos años, yo tengo 63 años hoy, llevo unos años, ¿verdad?, utilizándola, así que doy fe de que funciona muy bien. Esto es todo. Eh, nos está viendo. Gracias.