Amilasa

Hola, hola a todos, ¿cómo están? Espero que se encuentren muy bien.

Bueno, en esta charla de hoy vamos a hablar un poquitito de cómo vamos a hacer la dosificación de la milaza en el práctico. Antes de entrar en lo que es el fundamento del método, me parece interesante hablar dos cuestiones bastante rapiditas sobre la amilasa y qué es lo que estamos midiendo cuando llamamos la cuando hacemos la técnica amilaza.

Primero que nada, nosotros tenemos que saber que en el cuerpo tenemos dos tipos de amilaza. Lo que nosotros vamos a medir es la amilaza total. Primero que nada, tenemos una milaza salival que está principalmente secretada por las glándulas salivales, principalmente por la parótida. Y tenemos lo que es la milaza pancreática, que como su nombre lo dice es secretada por el páncreas exócrino.

¿Cuál es el objetivo de la milaza? Es intentar escindir, cortar, hidrolizar estos hidratos de carbono que puede ser la molécula de glucógeno en moléculas mucho más pequeñas para que el intestino en definitiva pueda absorberlo y no tenga tanta complicación. Porque ven que acá el glucógeno es una molécula mucho más grande de lo que puede hacer la molécula de glucosa propiamente dicho.

Entonces, cuando nosotros estamos midiendo lo que es la milasa, estamos midiendo la actividad enzimática de lo que es la milaza salival y de lo que es la milaza pancreática, por supuesto que en sangre, ¿ya está? Entonces, ya podemos concluir que esta enzima no es muy específica de lo que es la el por lo que es la utilidad máxima que nosotros le damos en laboratorio, que es la lo que es la pancreatitis.

Entonces, cuando uno va, esto es lo que les comentaba, esto es lo que está el inserto, cuando va la significación clínica, le dice que la milasa es producida por el páncreas y por las glándulas salivales. Entonces, esto como les comento, es poco específico, está no es una enzima que nos hable específicamente del páncreas, sino que puede estar alterada también, por ejemplo, en lo que es la paratitis bacteriana o lo que son las paperas, ¿está? ¿Por qué? Porque vamos a tener un aumento de la milasa salival que va a contribuir al aumento de lo que es la milascemia total, ¿ya?

Y por otro lado tenemos que cuando estamos en frente a una pancreatitis, que es la máxima utilidad que se le da a la cuantificación de amilasa, cuando estamos frente a una pancreatitis, los valores de amilasa ustedes ven que se empiezan a elevar a las 24 30 horas del inicio del cuadro agudo de abdomen. ¿Ya? Entonces, ¿qué es lo que tenemos acá? ¿Y qué concluimos? Que es muy sensible esta enzima en lo que son las primeras horas. ¿Por qué? Porque ustedes ven que después, sin mediar tratamiento alguno, si yo dijo, si yo dejo la enfermedad a su libre evolución, me encuentro que la propia enzima vuelve a retornar a sus valores normales entre las 24 y 48 horas.

Entonces, si hacemos una en suma a esto, tenemos que la amilaza es la sumatoria de las actividades enzimáticas de la amilaza salival y de lo que es la amilasa pancreática. es poco específica porque justamente se encuentran estos dos órganos y eh es muy sensible en lo que son las primeras horas del inicio del cuadro.

Ahora sí, cuando vamos al fundamento del método propiamente dicho, se los trato de ejemplificar de de este otro lado. Primero que nada, tenemos que la milasa lo que hace es excindir todo este sustrato que tiene todo este nombre largo. Es el dos, cloro P, nitrofenil, alfa de maltrócido. Bueno, todo esto, ¿qué pasa? Esto es una molécula que dentro de su estructura tiene un colorante colocado. Entonces, esto es muy interesante porque cuando la amilasa excinde a este gran complejo, a este gran compuesto, lo que termina haciendo es liberándome este colorante que es el que yo voy a medir, el que va a absorber a 405 nanm y me libera también otras moléculas que en este caso no nos interesan mucho porque no contribuyen a lo que es la medición, pero sí quiero que quede bastante claro que el lo que nosotros estamos midiendo es la absorbancia de un colorante que se coloca en la molécula que va a ser utilizada como sustrato.

Cuando la milasa excinde a todo esta esta molécula, lo que termina haciendo es liberando esta molécula que es la que nosotros vamos a medir y empieza y libera también otros productos que, bueno, nosotros en este caso no nos interesa porque la que va a absorber a 405 nanm es este compuesto que es el dos cloropitrofenol, ¿está? Como ustedes ya podrán presuponer, si vamos a hacer la medición a 405 nanm, ya podemos presuponer que esta técnica es una técnica colorimétrica.

También nos dice que los reactivos, o sea, el reactivo provisto es un reactivo A que tiene justamente esta molécula, esta molécula acá gigante y también tiene cloruro de calcio porque esta enzima para funcionar necesita calcio y cloro como cofactor, entonces el reactivo nos la provee. E a diferencia de otras técnicas, este reactivo no hay que prepararlo, no tenemos la chance de hacer un reactivo único, sino que ya viene pronto para usar.

Esta es la molécula que vamos a medir y como siempre nosotros tenemos que ver si el reactivo es viable o está deteriorado. Ya el el inserto nos dice que puede llegar a tener cierta coloración amarilla el reactivo A, pero llevando el espectofotómetro con agua destilada cero y si está por debajo de 050 o de 05 debido óptico, yo lo podría utilizar. Ya cuando la absorbancia de este reactivo es mayor a 0500, ya me indica deterioro y por supuesto no lo podría utilizar porque estaría brindando resultados falsamente.

Cosas que me parece interesante aclarar que ya uno lo tendría que dar como implícito, es que cuando nosotros vamos a e pipetear la muestra, está eh es lógico que no podemos hacer esto que ustedes ven acá. Ya esto no lo tendría ni que explicar. ¿Por qué? Porque justamente la amilaza salival de este señor estaría contribuyendo aún más en lo que es la reacción en caso de que esto fuera el pipeteo de la muestra. Entonces esto en realidad eh se los traigo, pero lo voy a pasar rápido porque yo creo que está más que e más más que sabido esto que no lo podemos hacer. Y es lógico porque justamente si está, si hablamos de que en la saliva está la milaza salival y yo pipeteo con la boca, no tendría mucho sentido hacer la reacción sabiendo que voy a estar agregando más encima de lo que verdaderamente la muestra del paciente tiene.

Con respecto a lo que es la muestra, vamos a utilizar suero o plasma parinizado. También vamos a podemos hacer la dosificación de amilasa en lo que es la orina. El lo que tiene que ver con la muestra nos dice específicamente que si utilizamos suero debemos separar el coágulo lo más rápido posible. Esto es justamente para evitar la hemólisis y que no nos dé e no sea un interferente porque acá ustedes bien ven muy bien que las sustancias interferentes entre las que ya conocemos, por supuesto, está la hemoglobina, la bilutubina, los triglicéridos.

Esto lo de la hemoglobina a uno un eh se minimiza aún más cuando separamos eh rápidamente el suero de lo que es el coágulo y la parina este hasta que 50 unidades mililitr e no no estaría interferiendo, o sea, tenemos que superar esta cantidad para que la técnica se vea afectada. Por supuesto, como siempre les digo, si utilizamos plasma de parinizado, ya los tubos están con una concentración de parina que claramente no superan este nivel.

Me parece interesante destacar esto, este, con respecto a la orina, porque es una técnica que si bien no lo vamos a hacer nosotros en el práctico, el inserto lo especifica bastante bastante bien. Dice que en caso de utilizar a orina es una orina ocasional, o sea, es una orina de chorro medio, no tenemos que hacer la reconexión de 24 horas, sino que es una orina eh ocasional, como muy bien dice acá. Y y en caso de utilizar orina, tenemos que ver el punto de que acá se los traigo. ¿Qué pasa si nosotros no procesamos la muestra inmediatamente? De alguna manera el pH ácido que tiene la orina la inactiva a la enzima. Entonces nosotros lo que debemos hacer es mantener un pH aproximadamente de si con hidróxido de sodio, ¿está? Y como dice muy bien acá, a pH de7 se puede conservar refrigeradamente 10 días sin la pérdida de actividad si no existe contaminación bacteriana. Esto lógicamente porque si no me estarían interferiendo en lo que es la enzima y no se podría.

Ah, esto eh me pareció interesante traerlo acá porque e es la primera técnica que vemos que podemos hacer la dosificación en orina y bueno, por supuesto que también tiene su su conservación y eh está bueno está bueno saberlo.

El tema de las condiciones de reacción ya dijimos que es una técnica colorimétrica porque la vamos a medir a 405 nanm y el tiempo de reacción es de 2 minutos. Ahora vamos a ver si es de 2 minutos de manera continua. o si es de punto final.

Bien, con respecto al procedimiento, el inserto nos ofrece dos maneras de hacerlo, a 25 o a 30º o a 37. Nosotros lo vamos a hacer a 37º, pero ¿qué pasa? Vamos a tener que seguir la misma receta de cocina que aparece acá arriba con algunas alvedades que ahora se las voy a contar.

Primero que nada, lo que vamos a hacer es utilizar el reactivo A, que el kit ya lo trae. Vamos a colocar 2,000l. Y en el caso de la muestra nos dice específicamente que nosotros vamos a estar a 37, vamos a utilizar 50 microll de la muestra. Esto el inserto lo justifica porque la actividad justamente a esa temperatura es mayor y e no es necesario utilizar 100 microll, sino que vamos a utilizar 50 microll de la muestra, ¿no? Entonces, lo que vamos a hacer es colocar 2 ml de reactivo, vamos a hacer la reacción con 50 microllit de la muestra y vamos a tener nuestro desconocido.

Vieron que acá no tenemos estándar, entonces ustedes ya podrán presuponer de que si yo el estándar lo utilizo para hallar el factor y no tengo estándar, es porque el fabricante me va a dar un factor. Nosotros lo que vamos a hacer es hacer estas dos mediciones. ¿Por qué dos mediciones? Porque justamente me dice que debo mezclar lo que es el reactivo con la muestra y medir la absorbancia al un al minuto y a los 2 minutos. O sea, voy a tener solamente dos absorbancias que voy a determinar la diferencia. Ya vieron que no me da para hacer promedio, por eso no me aparece lo que es el el promedio, sino que solamente me dice determinar la diferencia. Y por supuesto, como toda diferencia, vamos a utilizar este cuadrito y después vamos a utilizar la fórmula que se las traigo a continuación.

Este cuadrito es el que siempre nos ha ayudado en todos estos este estas prácticas. Me parece bastante bueno para Se ve se ve bastante bien y es fácil de de realizar, lógicamente. Y eh nada, como siempre, a una lectura le restamos la anterior. Acá nos tenemos una una diferencia de absorbancia de 02.

Y después cuando vamos a utilizar e la la fórmula, tenemos que utilizar un factor. Y vieron que tenemos cuatro factores. Nos vamos a parar acá donde dice 37º, porque justamente es la temperatura que vamos a llevar a cabo la reacción. Del reactivo A. Nosotros vamos a utilizar los 2 ml y dijimos que la muestra en vez de 100 vamos a utilizar 50. Entonces, nos quedamos en este renglón y nuestro factor a utilizar, el cual vamos a multiplicar por esta diferencia es de 3,178.

Cuando nosotros hacemos estos cálculos, obtenemos que la actividad enzimática es de 635 unidades internacionales. Como siempre nos tenemos que preguntar, ¿este valor supera la linealidad de la técnica? Y acá se las traigo específicamente el inserto nos dice que la técnica es lineal hasta 2000 unidades internacionales. Hasta 2000 unidades internacionales la absorbancia es directamente proporcional a lo que es la concentración y yo no tengo que hacer ningún tipo de ilusión, salvo que justamente la absorbancia supere cierto valor, no me encuentre con curva, no tenga este donde poder extrapolar y de alguna manera sí voy a tener que hacer una dilusión para poder hacer la determinación nuevamente y no me tengo que olvidar de multiplicar por el factor de dilusión.

Bien, para ir terminando vamos a hacer una enuma y tenemos que entonces la técnica de la milasa es una técnica que es colorimétrica porque se mide 505, es enzimática porque justamente participa a la enzima milasa que es la que yo quiero medir, es de monitoreo continuo porque tenemos que monitorizar la reacción midiendo la absorbancia en dos en dos oportunidades al minuto y a los 2 minutos. Y es una técnica creciente donde justamente vamos a se va a determinar la absorbancia de este de esta molécula es el dos clorop nitrofenol que va a ser directamente proporcional a lo que es la actividad enzimática de la enzima.

Como siempre terminamos con un caso. Se realiza la cuantificación de amilasa de un paciente. El valor obtenido es de 10000 para un límite superior de 150 unidades internacionales. Como siempre, las mismas tres preguntas. ¿Qué opinión le vere ese resultado? ¿Qué causas de aumento conoce? y eh cuál es la utilidad clínica de esta enzima. Pongan pausa si quieren, así después pueden razonarlo y ven la respuesta.

Bien, el paciente estamos todos de acuerdo que presenta una elevación de lo que se está encima de lo que es la amilasa. Causas de amilaza, acá les e coloco varias etiologías. La pancreatitis, cuadros de origen biliar, puede aumentar levemente lo que es la milasa. Eh, habíamos hablado también de cuadros e lo que tiene que ver que generaen paperas, ¿no? La lo que es la inflamación de la glándula parótida, la irritación peritoal, la insuficiencia renal, porque justamente tengo un menos clearance de lo que es la milaza, entonces me queda la me queda la milaza en sangre y yo la encuentro, pero claro, la encuentro no por un cuadro justamente pancreático, sino que e tengo un problema de que no la puedo eliminar eficientemente.

¿Cuál es la utilidad? encima que contribuye al diagnóstico de la pancreatitis, nosotros sabemos que para el diagnóstico de pancreatitis necesitamos dos de estos tres pilares. El clínico, es decir, que el paciente venga con un relato que a uno le haga pensar una pancreatitis imagenológico y serológico, que acá es donde nosotros este cuantificamos lo que es la mila, ¿está? Entonces, les pongo acá que constituye uno de estos tres pilares.

Y después tenemos otra enzima que es la lipasa, que la lipasa es otra enzima que se puede medir, que tiene más sensibilidad y especificidad de lo que es la milaza, pero bueno, en los laboratorios actualmente lo que tenemos es la más eh más estandarizado, mucho más utilizado lo que es la medición de la de la milasa que la lipasa, pero bueno, son dos enzimas que cualquiera de las dos contribuyen a lo que es el diagnóstico de de pancreatitis.

Así que bueno, chicos, nada, espero que les sirva. cualquier cosa, como siempre, me mandan mail, mensaje, lo que ustedes quieran, lo discutimos. Y bueno, nada, sería eso. Nos vemos en la que viene. Saludos para todos.