Métodos Separativos - Clase 13 - GC: Análisis cuali-cuantitativo

Hola, espero que se encuentren todos bien. Esta es la última clase correspondiente al módulo de cromatografía gaseosa.

Si se recuerdan, hablamos de las características generales que tiene la cromatografía gaseosa en el marco de todas las técnicas de separación, una técnica de separación tan versátil. Hablamos de distintas, bueno, en primer lugar, de las reglas que la rigen, considerando el hecho de que toda la cromatografía, como he dicho, las reglas, las leyes de la cromatografía, la teoría de la cromatografía, ustedes la habían visto previamente con el módulo de cromatografía líquida. Y nosotros lo que vimos fue cómo eso se adapta o se vincula a la cromatografía gaseosa.

Hablamos de las columnas, de las columnas que se utilizan como elemento de separación, de las fases estacionarias, de las condiciones que se requieren para poder trabajar, tanto los parámetros instrumentales como las condiciones del equipo, en caso de que trabajemos con columnas capilares. Vimos también cómo hay una serie de parámetros operacionales que nos permiten a nosotros modificar sistemas de inyección, sistemas de división de flujo, programas de temperatura, las temperaturas del inyector, del horno, logrando enfocados en las cabezas de las columnas, en fin, una serie de cosas que nos conducen a saber cómo utilizar esta herramienta, habiendo conocido los elementos que están involucrados y las reglas genéricas que existen, así como también algunas opciones, como dije, parámetros operacionales que uno ajusta.

Ahora, ¿qué pasa con todo esto? ¿Qué podemos hacer para obtener un resultado? ¿Qué tipo de resultado podemos obtener? Es decir, ¿el equipo adivina lo que queremos y lo hace para nosotros, o nosotros tenemos que tener en cuenta algunas ideas, algunos elementos para poder hacerlo? Bueno, de esto se trata esta clase. Vamos a ver lo que son los análisis cuantitativos, o sea, identificar y cuantificar. Los sistemas de integración que se pueden utilizar, la relación entre tiempo de retención e identidad, como ya los hemos visto, y su vínculo con estos dos factores de identificación y cuantificación. Los métodos y las formas en las que se puede hacer una cuantificación en cromatografía gaseosa en forma particular. Y el fenómeno de guatiza, es decir, el para qué establece la cromatografía gaseosa como una técnica, la cual solamente puede ser utilizada para compuestos que son volátiles o que son factibles de ser volátiles mediante. O sea, que en cromatografía gaseosa, básicamente, este enfoque de hoy lo que está relacionado es cómo identificar y cuantificar.

Es interesante este símbolo, en realidad. Identificar y cuantificar son dos caras de la misma moneda, o dos formas de interpretar resultados, porque evidentemente todo parte de la obtención de un cromatograma, ese perfil cromatográfico con una buena resolución, con una buena forma de picos, en un tiempo razonable, donde no se produzcan cambios fundamentales en las áreas, ni se lleguen a solapar, ni tampoco tengamos problemas de línea de base, todo lo que discutimos hasta ahora. Sin embargo, algunos aspectos vinculados a la identificación, métodos cualitativos, nos permiten hacer determinadas cosas que no podemos, o sea, donde la tolerancia es menor para el método cuantitativo. En cualquier caso, como vemos, es necesaria una base mínima para poder lograr cualquiera de los dos procesos, y por lo tanto, es la razón por la que decimos que son dos aspectos del mismo problema.

El primer problema que hay que tener en cuenta cuando uno está pensando en procesos de identificación o cuantificación es el problema de la línea de base. La línea de base, como se muestra aquí, se trata de una señal eléctrica de fondo, donde, en el caso de la mayoría de los detectores, es una respuesta eléctrica de algún tipo que está siendo amplificada, y por lo tanto, hay una serie de deriva y ruido que nosotros tenemos que tener en cuenta en la detección. Entonces, se llama un mínimo nivel de detección, o sea, ¿cuál es lo mínimo que podemos ver? O ¿qué es lo que dentro de este ruido podemos decir que esto es ruido y esto es señal? No es menor, no es menor, sobre todo cuando veamos espectrometría de masas, vamos a ver que eso es bastante discutible en algunos casos, y vamos a ver que la línea de base tiene mucha información. En cualquier caso, en general, en cromatografía, la masa, el nivel de detección es la masa de analito, o sea, la cantidad de analito que genera un pico cuya altura sea tres veces la señal de ruido. O sea, tomamos este criterio. Si es el ruido, la amplitud de ruido, una amplitud tres veces superior al ruido, más o menos lo que ves acá, se toma como una señal, o sea, como una respuesta de un determinado componente al detector, a un determinado componente. Es decir, que eso es lo que inicialmente se toma como un eventual pico, o sea, como una respuesta de un analito de la mezcla al sistema de detección que estamos utilizando.

Entonces, nos vamos a centrar en lo que es el análisis cualitativo, básicamente lo que tiene que ver con el proceso de identificación. Su ser el primer paso, un examen, el examen de un cromatograma, la separación cromatográfica. O sea, lo primero que nos interesa es qué hay en la muestra, es decir, qué hay en la muestra en general, o si algunos compuestos en particular nos interesan, están en la muestra. En algunos casos, saber qué hay por completo, conocer todo el perfil cromatográfico hasta donde nuestra capacidad, tanto desde el punto de vista del instrumento como del conocimiento, como de información adicional que tengamos, por ejemplo, y poner estándares, nos puede permitir.

Y la otra pregunta, ya más concreta, es si algunos que nos interesan están presentes. O sea, nosotros sabemos que buscamos. En muchos casos, evidentemente, tenemos que contar con estándares para ese caso, o haberlos tenido previamente, para poder decir que efectivamente esos compuestos están, aunque para firmarlo requiramos, como vamos a ver más adelante, de alguna información adicional. En cualquier caso, los dos enfoques, total o alguno componente en particular, intentan identificar los componentes individuales de la muestra. Y ahí tenemos una parafernalia de herramientas, de aplicaciones instrumentales, de componentes instrumentales que tienen que estar, eso como cromatograma, la respuesta del equipo a la presencia de componentes que pasan por ese detector al ser separados. Y una respuesta. Ya vimos que los detectores son una cantidad importante. Nos pasa por ver en detalle los detectores de espectrometría de masa, pero ya vimos con bastante certeza que muchas respuestas de tipo, parece bastante obvio, pero la respuesta depende también del tipo de detector que se utilice. No es una contradicción, ya lo vimos con los detectores. Simplemente, lo que hacemos con los tipos de detectores es seleccionar una respuesta genérica, como el caso de ionización de llama, o una respuesta específica, como el caso de los detectores de captura electrónica o nitrógeno-fósforo.

El análisis cualitativo, o sea, el estudio de la composición, puede tener distintos objetivos. Como vimos, el análisis puede ser dirigido, es decir, se enfoca en el reconocimiento de analitos en la muestra, algunos compuestos que yo busco específicamente en la muestra, ya sea por sus características positivas o por sus características negativas, o sea, sean componentes de interés o porque sean contaminantes. O un enfoque no específico. En lugar de buscar un número limitado, el objetivo también puede ser la identificación de todos los. Es decir, eso es en general lo que se busca en algunos trabajos, ejemplo, tanto de investigación como de búsqueda, por ejemplo, en algunos casos de características de determinadas matrices para explicar, por ejemplo, su comportamiento o explicar fenómenos de transformación en el caso de frutas o alimentos durante el procesamiento, almacenamiento, en fin.

También se pueden comparar los perfiles de picos de diferentes muestras sin conocer la identidad de cada señal. Este, por ejemplo, podría existir interés en saber si determinado tipo de matriz, cualquiera sea, le ocurren transformaciones y ver si esa se repite. Y luego, trat, luego se debería identificar. O un caso más simple podría ser si comparo distintos materiales, por ejemplo, distintos aceites esenciales provenientes de cítricos de limón, bueno, a ver cómo son los aceites de limón de la zona, de las distintas fábricas, comparo fruta. Y para eso no necesito necesariamente saber cuáles son los compuestos. Yo lo que busco solamente es el fingerprint, la huella digital.

Clasifica la identificación del patrón general. Es una, generalmente esto no ocurre porque uno es curioso, entonces, por lo menos, por curiosidad, saber qué tipo de compuestos son los que están involucrados, o por lo menos cuáles son aquellos que nos interesa que varíen o no varíen, hace que uno busque realmente saber de qué se trata. Pero es una posibilidad. Bueno, el enfoque de perfiles se utiliza mucho en metabolómica, análisis petroquímico, alimentos, sabores, fragancias, o medicina. O sea, en todas las aplicaciones se puede utilizar el fingerprint. Insisto, normalmente lo que se hace es tener una idea de la identidad. En cualquier caso, pero bueno, es una chance para la primera etapa.

El primer paso para un análisis de identificación cualitativo es el cromatograma que tenemos hasta ahora. El cromatograma, que es el gráfico de la señal del detector a lo largo del tiempo, es lo que nos va a dar el punto de partida o el paso inicial necesario para poder hacer todo el trabajo. Como vimos, el tiempo de retención, para una determinada fase estacionaria, es característico para cada analito. Por otra parte, el principio de detección puede proporcionar información sobre el analito. Esto es lo que yo les decía. Si nosotros estamos trabajando con detectores que no son universales, sino que son específicos o, perdón, selectivos, como es el caso de nitrógeno-fósforo, detector de captura electrónica, azufre-fósforo, los de conductividad térmica, por su propio funcionamiento, nos permite saber que determinada respuesta está relacionada con la presencia o ausencia de un compuesto con la característica para el cual el detector es selectivo. O sea, si yo tengo un cromatograma gráfico, por ejemplo, en el cual, para tener una idea, tuviéramos muy pocos compuestos con muy baja presencia y compuestos importantes, el detector es un detector de captura electrónica. Bueno, sabemos que hay efectivamente elementos con la capacidad de interaccionar con electrones, y eso nos van a dar una respuesta específica, más selectiva, más intensa en este caso a ese tipo de detector. Y eso se refiere a esa afirmación.

El tiempo de retención, no hace falta aclararlo, lo hemos hablado hasta el cansancio. Pero como ya también hablamos y hemos visto la posibilidad de comparar tiempos de retención en columnas diferentes del mismo tipo, o sea, tenemos la misma fase estacionaria, mismo largo, mismo diámetro interno, mismo espesor de película, en muchos de los casos, no es fácil. Es decir, vimos ya que podemos tener corrimientos de acuerdo a la fase estacionaria que estemos utilizando. Y hablamos, por ejemplo, para un mismo programa de temperatura, un isotermo, que ustedes quieran, las diferencias por el tipo de interacción que se establece hace que los compuestos con baja polaridad o una polaridad interaccionen de una manera, y los que tienen polaridad media o alta, de otra manera. Además, está el fenómeno de volatilidad en el medio. O sea, todo eso hace que en una fase estacionaria poco polar, que se rige fundamentalmente casi exclusivamente por las presiones de vapor, los tiempos de retención sean mucho más repetitivos, más repetibles, que en el caso de las columnas con mayor polaridad, con fases estacionarias de mayor polaridad, donde el fenómeno de equilibrio que se establece por interacción con la fase estacionaria, donde la fase móvil, recuerda, no hay interacción, hace que los tiempos puedan variar mucho más en las mismas condiciones. Y eso hace que, como habíamos mencionado, en términos generales, se afirma que en las fases estacionarias poco polares, los índices de retención, que es una medida de tiempo de retención, pueden variar en más menos 10%, mientras que las polares varían más. Y es lo que se menciona acá. Se diferencia que la actividad de soporte, la edad, el uso de la columna, la variación, la comparación de la pared, es decir, que haya alteraciones, establecen diferencias. Por lo tanto, las tabulaciones de los tiempos de retención absolutos, el tiempo de retención medido directamente como saca el software de listado de picos que yo dije que tome en cuenta, no tiene mucho valor cualitativo. O sea, la variación es tan grande que, en definitiva, aún en columnas poco polares, con mejor respuesta, establecen problemas. Y hablar, cuando son del mismo fabricante, o aquí las condiciones en que si la columna es nueva, no es nueva, funciona, además, también afecta.

O un caso particular es el caso de espectrometría de masas con impacto electrónico, por ejemplo, parte de los casos, y cómo se llama, con donde hay análisis de cuadrupolo simple, otras configuraciones pueden ser utilizadas. Bases de datos. De hecho, todos tenemos bases de datos o hemos construido bases de datos, y se utiliza como herramienta adicional de identificación. Eso ya lo habíamos mencionado, pero como vamos a ver cuando hablemos de espectrometría de masa, la comparación de los espectros adquiridos con los espectros de las bibliotecas, la base de datos, no necesariamente la lista de resultados tiene el compuesto correcto. Primero, puede no estar el compuesto, y eso no quiere decir que está ausente, sino que tenemos un espectro de masa que la base de datos no posee, no reconoce. O puede ocurrir de que las condiciones en las cuales nosotros trabajamos hacen que la comparación no sea eficiente. Esto lo vamos a ver en espectrometría de masa, en las condiciones que tenemos que fijar para el equipo para que funcione. Pero una de las condiciones que les puedo decir es que el espectrómetro de masa es un detector muy flexible, en el cual, por ejemplo, uno le dice qué tipo de peso molecular, masa, registra el detector. Si nosotros decimos que estamos trabajando entre masas entre 30 y 400, compuestos volátiles de peso molecular mayores a 400 o menores de 30, no los va a registrar porque le pedimos que lo hiciera. Y eso nos haría perder pesos moleculares, otro tipo de información fundamental. Parece tonto, pero realmente es una limitación importante que luego vamos a discutir en detalle. Quiere decir que aún cuando utilicemos un sistema cromatográfico acoplado a detector de masa, no necesariamente podemos tener la información, aunque tengamos las bases de contraste, las bibliotecas de contraste adecuadas. Esto hablando con cuadrupolo simples, con otro tipo de sistemas de más, más fragmentación simultáneas o sucesivas, se puede lograr un poco más de información, pero la limitación va a estar. Y si no se pone un estándar, estamos en.

Por lo tanto, los tiempos de retención, la retención, la relación tiempo de retención, la altura de los detectores selectivos son realmente valiosas para ser empleadas. O sea, con esa información es importante. Por otra parte, toda reacción de degradación o derivatización selectiva pueden llevar a identificar señales desconocidas. Esto se refiere básicamente a que si yo tengo los tiempos, tengo el cromatograma, eso es lo primero que tenemos que tener. Tengo los tiempos de retención, tengo las relaciones de retención, estructura. Eso significa que tengo estándares o tablas, tengo otros sistemas de referencia relativos. Todo puede ser ayuda. Además, si yo sé, por ejemplo, en el caso de espectrometría de masa, las relaciones de degradación que son las fragmentaciones, o en el caso de otro tipo de compuesto para un detector genérico, tenga una derivatización selectiva, puede ayudar. Es lo mismo que ocurría en HPLC. O sea, información a lo que nosotros tenemos como una separación registrada por un determinado detector. Si yo tengo varias opciones como las que se mencionan acá, voy a poder tener más información.

¿Qué pasa si no? ¿Qué pasa si en realidad yo tengo la elución frecuente? Nosotros trabajamos con cromatografía gaseosa, tenemos detectores universales, o sea, detector de ionización de llama, y por otro lado, espectrometría de masa. Entonces, en primer lugar, vamos a analizar los elementos. Pero la espectrometría de masa la tenemos en lugares del año 95. Es decir, a cualquiera de ustedes le parece un montón de tiempo. A mí me pareció en su momento tocar el cielo con las manos porque no teníamos espectrometría de masa disponible en Uruguay, y por lo tanto, trabajar era realmente complicado. Había espectrómetros de masa, obviamente, pero esto es como seguir una serie en la televisión del vecino. O sea, lo podés hacer a medida que el vecino no te presta la televisión. Al mismo tiempo, te lo quiero prestar. O sea, disponer de los equipos en algún caso es la única manera de trabajar racionalmente cuando uno se interesa en un tema que requiere ese tipo de instrumentación.

Bueno, entonces, ¿qué pasa? ¿Qué pasa si vamos a analizar los distintos componentes que nos llevan a estas afirmaciones? Primero, el tiempo de retención absoluto es el tiempo que transcurre entre la inyección de la muestra y la detección del pico. Es decir, el pico que a nosotros nos interesa. No, eso es característico para cada analito en determinadas condiciones, es decir, para cada fase estacionaria, para cada programa de temperatura. El tiempo de retención ajustado es aquel en el cual se le resta el tiempo de retención, el tiempo muerto, que es el que transporta, que no tiene ninguna interacción con la fase estacionaria. Les comento, se utiliza, no se utiliza tanto, pero la teoría se habla mucho de esto, tiempo de retención y tiempo de retención ajustado. Nosotros hoy día no tomamos muy en cuenta, pero porque pasamos todo este tipo de cosas a interpretación, eventualmente por cromatografía acoplada a espectrometría de masa. Y luego, nos preocupa básicamente las relaciones de tiempos entre elución entre ellos, entre los componentes, y tenemos marcadores y demás. Pero digamos que el tiempo de retención ajustado forma parte de la teoría y cómo se ha desarrollado. Bueno, aquí vemos, recuerden que siempre la teoría es válida tanto para expresa como para volumen. Esto ya lo hablamos. Es decir, el pico es una campana, en definitiva, donde justamente es importante tener en cuenta estos parámetros, las tangentes que establecen los puntos de inflexión donde se produce cuando se desarrolla el pico, y obviamente el punto de altura máxima. Esto vamos a ver por qué. De esta manera es que se establece lo que sería el tiempo de retención. El tiempo de retención es el que corresponde al máximo del pico. Y a su vez, los sistemas de cuantificación trabajan naturalmente por, en una de las posibilidades, por variaciones de inflexión, punto de inflexión de la curva. Obviamente, como ya mencionamos, la presencia o tener picos que son asimétricos o deformados o demás, establece complicaciones, ni hablar cuando hay sistemas de coelución o la resolución no es adecuada. También fastidia. Eso lo vamos a ver también en la integración de la forma de integración.

Y una cosa muy interesante que quizás luego olvide es la siguiente. Ustedes recordarán, trabajan en cromatografía en capa fina, por ejemplo. Cuando uno corre las manchas, es frecuente que si yo tengo la misma muestra, misma tipo de muestra, pero en una de las muestras tengo mayor cantidad de un componente que de otro, o tengo, digamos, que todas las muestras están más concentradas, para hacer lo primero más fácil, una muestra uno es la misma muestra que la muestra dos, pero la muestra dos está más concentrada que la muestra uno. Vemos que el desarrollo de las manchas puede cambiar. Si las manchas son más grandes, los, lo que se llama tiempo de retención, ahí, que son los Rfs, que también se ajustan, cambian. Y esto cambia porque cuando yo tengo una concentración muy grande de un determinado componente, yo necesito de alguna manera mayor capacidad de fase para poder que haya interacción. Como la fase es la misma, el espesor de fase en sílica en capa fina es la misma para todo, entonces una concentración mayor, contenido mayor de un determinado analito, determina que se deforme todo ese, todo ese cromatograma en capa fina. En cromatografía gaseosa y en cromatografía líquida pasa lo mismo. Pero en cromatografía gaseosa, sobre todo porque la fase móvil es inerte, por lo tanto, si yo tengo mucha concentración, todo depende de la selectividad y capacidad de la fase estacionaria. Se acuerdan, por eso, si yo tengo una cantidad importante de un determinado analito, de varios analitos, va a haber una deformación alrededor de esos analitos, al punto tal de que, por ejemplo, algunos analitos que eluyen cerca van a quedar sobre, como un hombro sobre el pico ese grande, o sin que ocurra eso, puede haber que los picos que a continuación puedan tener algún tipo de formación en su forma.

La comparación de tiempo de retención ajustado de un analito desconocido con el tiempo ajustado puesto de referencia, un estándar, sería el enfoque más simple. Compuesto y así se ha hecho y se sigue haciendo en determinadas situaciones, básicamente donde, como vimos, se crean perfiles, en el entendido de que estamos trabajando con todo el sistema de preparación de muestra previo y sistema de inyección y todas las condiciones instrumentales, incluida las fases estacionarias y columnas, de la misma manera, de tal manera de, por decirlo de alguna manera, en forma repetitiva, verificamos si ese tipo, si el perfil es el mismo, si cambia de alguna manera. Insisto, es la forma más simple. Todos la hemos utilizado, no responde ni siquiera a la curiosidad humana natural, ni tampoco a un sistema de eficiencia, por lo menos en una primera instancia. Pero si se emplea un retorno específico y solo se utiliza el tiempo de retención, existe la posibilidad de que otro compuesto produzca al mismo tiempo de retención en la fase estacionaria. O sea, lo que hemos visto, o sea, todo lo que tiene que ver, toda la crítica que tiene que ver con el uso de simplemente un tiempo de retención sin otro criterio. El corolario es que la identificación debe ser confirmada usando un detector específico, por ejemplo, espectrómetro de masa, o analizando la muestra en una fase estacionaria con una polaridad diferente. O diría yo, lo que te piden es cuando vos estás trabajando en el desarrollo de un protocolo, sea para investigación, desarrollo o aplicación de validación de una técnica, es el uso de más de un sistema de identificación. Por ejemplo, trabajar con el tiempo de retención transformado en índice de retención lineal y con un detector de espectrometría de masa. Las dos técnicas ya comienzan a ser más aceptables, al inicio, por lo menos.

Por lo tanto, el resumen del análisis cualitativo sería que el objetivo central no ha cambiado, es decir, identificar compuestos presentes en una determinada muestra. Sí, en realidad, presentes en una muestra que representa una matriz. Como ya, todos los enfoques son básicamente dos: determinar el tiempo de retención de los picos presentes en la muestra incógnita y en los patrones, y asumir que si corresponde, corresponde la identidad, lo cual no es verdad por todo lo que hablamos. Pero porque además, esto lo mostramos en las primeras clases, hay compuestos que son muy similares o coeluyen, o sus órdenes de elusión pueden cambiar de acuerdo a la temperatura. Esto ya lo vimos. Pero en cualquier caso, yo les doy un ejemplo. Si nosotros trabajamos, por ejemplo, con una mezcla que tenga, el caso aceite esencial de eucaliptus es un caso paradigmático porque ha afectado enormemente también el comercio en su momento. Cuando se emitían certificados, un momento u otro, producía una cantidad muy importante. El eucaliptus se vende de acuerdo al contenido de un terpeno que se llama cineol. En una fase poco polar, hay tres compuestos terpénicos que coeluyen: el cineol, el para-cimeno y el limoneno. Y en algunos casos, también alfa-terpineol. Pero los tres primeros coeluyen. ¿Por qué coeluyen? Primero, porque tienen tiempos de retención muy cercanos por la presión de vapor. Segundo, porque el limoneno, que es el componente mayoritario normalmente, llega a actuar de envolvente de los tres compuestos.

Pero el problema es que si un aceite, en aquella época y hoy también, pero casi no produce, si un aceite esencial de eucaliptus tiene 6% de cineol, se llama aceite normal de eucaliptus. En cambio, si tiene 75% de cineol o más, es un aceite rectificado, es decir, que fue sometido a una concentración de cineol por destilación fraccionada o por otro tipo de técnicas, y vale mucho más. En consecuencia, era muy frecuente, muy frecuente, que la industria vendiera aceite de eucaliptus como aceite tal cual, crudo, y con un contenido de cineol de 72%, muy cerca del rectificado, incluso a valores similares. Se lo rechazaban sin haber hecho rectificación. Entonces, a través de una cantidad de líos, la facultad estuvo involucrada, nos estuvimos involucrados en todo esto. Le demostramos, utilizando columnas polares, que esos tres picos se podían separar y obviamente con estándares en primera instancia, pero fundamentalmente por espectrometría de masa, les demostramos claramente que lo que tenían el aceite con 60-6% de cineol, estándar normal, y el resto que llevaba 72 o más, era la suma de limoneno, para-cimeno. Es una cosa tonta, tan tonta como eso, era un escándalo comercial. Entonces, el enfoque de usualmente determinar tiempos de retención y comparar estándares no es suficiente.

En lo que sí se puede hacer es cuando uno tiene una técnica validada para una muestra que es siempre la misma, como vimos, y bueno, se tiene un registro de funcionamiento de determinada manera. Pero en cualquier caso, cada tanto se debe verificar la identidad de los componentes por otras técnicas. O sea, que el otro enfoque es usar, agregar datos que proporcionen información estructural de los analitos por espectroscópicos: espectrometría de masa, infrarrojo, resonancia. Todo eso. ¿Qué es lo que se hace efectivamente hoy día? Básicamente, todo con espectrometría de masa. Si bien la resonancia se utiliza mucho, el infrarrojo ya no se utiliza tanto. Y como decía, para tener resultados confiables, por lo menos cuando se está desarrollando los protocolos, es importante información de por lo menos dos fuentes diferentes, o sea, estándares, datos adicionales, para tener certeza de lo que se está haciendo.

Una técnica muy aplicada que es lo que yo decía, adición de estándar. Si yo tengo un componente X y tengo el estándar que supongo que puede ser X, le agrego y si coinciden, el pico crece de manera exponencial, pues tengo una buena certeza. Y si se divide, se deforma o lo que sea, no es el, no es este compuesto el analito que a mí me interesa, no es el estándar interno. Entonces, esto ayudó mucho en su momento, pero, y yo insisto, hay compuestos que coeluyen. Y es algo que hay que tener muy en cuenta. Una técnica que se utilizó, se utiliza mucho, obviamente está, es una buena práctica, es trabajar, trabajar con una muestra de concentración razonable, mirar todos los picos que tenemos y luego diluirla muchas veces. En la dilución, por ejemplo, con el ejemplo del eucaliptus, al diluir muchísimo se puede lograr a veces ver hombros que indican que hay más de un componente presente. Pero no es, no es certero.

Bueno, aquí es básicamente los tiempos de retención. Vemos la forma en que yo tengo una muestra y el compuesto de referencia, el estándar, en este caso, no que incide es básicamente lo. Pero vemos que en este caso el tiempo de retención tiene una serie de condicionantes que son las que más o menos resumen lo que vemos hasta ahora, que hace que pueda haber variaciones. Entonces, el objetivo es utilizar, sacarle el mayor provecho posible al cromatograma, sin antes de incorporar otra técnica adicional. O sea, vamos a aprovechar al máximo el instrumento que tenemos, la técnica que estamos aplicando. Si tenemos un detector como teníamos nosotros, universal, o detectores específicos, pero que no nos ayudaban para unos componentes que nos interesaban comparar al tiempo de retención, ya lo vimos la parte complementaria. Pero en la comparación de tiempo de retención podemos incluir los índices de retención. Ya lo vimos, no vamos a repetir. Esto como se definió, se definió para isotermas, como se utiliza ya para programas de temperatura, sin ningún tipo de problema, es lineal, no es complicado. Lo único que uno debe tener es estándares de alcanos, de alcanos, de uno en uno. Esto se vende, no son caros, se pueden comprar mezclas o se pueden comprar uno a uno, y realmente es, debe tenerse para cuando se trabaja en identificación de analitos, no cuando uno recibe una técnica ya desarrollada. Esa es la técnica que se debe utilizar. No hay nada que hacer.

Se deben considerar muchos factores. En cualquier medida de retención, la capacidad para la temperatura de columna, portador, por si bien dijimos que la temperatura es la que manda todo el proceso de cromatografía gaseosa, ya se explicó por qué eventualmente el flujo de gas es importante en algunas condiciones, sobre todo trabajando con determinadas seleccionando determinados tipos de split, en fin. ¿Por qué puede afectar esto al tiempo de retención en forma más fuerte? Se afirma que un cambio de temperatura de aproximadamente 30 grados cambia el tiempo de retención un factor dos. Ya si yo cambio los programas de temperatura, tengo que tener en cuenta que para una determinada elución, un cambio de 30 grados, si yo estoy trabajando a una determinada temperatura, cambié el programa porque quiero hacerlo más rápido, tengo que tener en cuenta que los factores de retención, en términos generales, pueden cambiar de esa manera. Por lo tanto, para mantener una repetibilidad del orden del 1% en las medidas de retención, la temperatura de la columna debe estar dentro de más menos 0.3 grados. Hay que hacer las cuentas, créanme. Así funciona.

¿Qué quiere decir? Que los hornos actuales funcionan perfectamente. Pero cuando yo trabajaba y cuando yo comencé a trabajar en cromatografía gaseosa, las inercias térmicas eran muy fuertes, tanto para el calentamiento como para el enfriamiento. Las resistencias ya tenían una buena reproducibilidad, la forma en que se transformaba la emisión de calor, pero más menos el 0.3 grados era un desafío. También, por otro lado, un cambio de 1% en el flujo del transportador afecta el tiempo de retención aproximadamente 1%. No es mucho, pero recuerden que si yo estoy comparando perfil a perfil, o sea, perfil de estándares, el perfil del problema, cualquier corrimiento de este tipo lo puede afectar. En consecuencia, la recomendación que nos daban y dábamos en su momento era: bueno, hay que trabajar con, por dejábamos los hornos cuando estaban en condiciones ya de poder tar la temperatura y en condiciones de poder arrancar, dejábamos 5 o 10 minutos antes de iniciar las corridas para que estar seguro que el horno estaba estabilizado y ahí lanzamos el programa. Tratábamos de largar programas que no fueran demasiado bruscos en sus cambios, para que, sobre todo cuando aparecemos las mesetas de temperatura, viene calentando a 4 o 5 grados por minuto y aparece una meseta, la hacíamos generosa de tal manera de que no era necesariamente se mantenía y luego se mantenía esa temperatura, se pasaba un poco, en fin. Y se trataba de evitar programas bruscos. Programas de 15 grados todavía hoy son complicados, pero hoy no hay ningún problema, se recupera bien. Programas que calientan a 5, 20 grados centígrados por minuto, 30 grados, normalmente se utiliza muy poco. Se utilizan para llegar cerca a un desarrollo, una purga, porque se producen muchas variaciones.

El tamaño de la muestra que inyectamos también juega un papel importante. Esto ya lo hemos discutido, pero vamos a verlo en este enfoque. Si la muestra es muy grande, en la columna, de acuerdo al diámetro y carga, o sea, estamos hablando de capacidad de fase estacionaria y espesor, aparecen distorsiones en los picos. Los picos más grandes, estos picos están distorsionados de modo que el tiempo real del pico cambia a tiempos más largos, depende de cómo se deforme, pero en general, por aumento de, está cerca de la capacidad de la columna para esos picos, esos componentes, analitos que están en mucha concentración, mucho contenido. Así, generalmente se deforman de este tipo. El efecto del tamaño de la muestra, el tamaño de lo que se está inyectando en el tiempo de retención en la columna, en primer lugar, no está sobrecargada. De arriba vemos aquí, en la segunda está ligeramente sobrecargada, o sea, que se está empezando a deformar el pico, y aquí aparece lo que se llama el fronting, una de las formas de fronting, en el cual la columna está severamente sobrecargada. Por lo tanto, hay una interacción lenta, desequilibrio con la fase estacionaria hasta que deje de interaccionar. Pero los algoritmos del software le cuesta muchísimo determinar el tiempo de retención, altura máxima y por otro lado el concepto para integración de pico normalizado. Pero bueno, ya estamos en la parte de tiempo de retención.

Por lo tanto, el factor más importante en el análisis cualitativo de identidad en cromatografía gaseosa es la recopilación de la mayor cantidad de información posible sobre la muestra antes de comenzar. O sea, por ejemplo, nosotros fuimos muy agrandados a decirle a la gente que nos planteaba el problema, "aceite, se resuelve muy fácilmente". En realidad, veníamos con el conocimiento bajo el brazo, ya sabíamos lo que estaba pasando y suponíamos que lo podíamos explicar. Por lo tanto, es necesario conocer todo lo que se está indicando ahí, tanto la forma de lugar de muestreo, la matriz o no tener estándares. Y como hablamos siempre, cuando ajustar espacios insolventes, no sea blanco solvente, significa que, por ejemplo, inyecto que el propio solvente puede ser el causante de todo el lío. Por ejemplo, hablamos del tema del agua, la formación de película sobre la fase estacionaria, impidiendo que haya interacción. En fin, solventes que no son muy volátiles y salen muestras antes que el solvente, quedan dentro del solvente. Solventes que digamos, forman, pueden tener por estar en mucha cantidad, este tipo de formas, por lo tanto, alterar toda la elución de los compuestos que siguen. Ese tipo de cosas también hay que tener en cuenta. Los famosos artefactos, picos fantasma, no los que picos que aparecen que se originan por descomposición de la muestra por almacenamiento, lixiviación, lo que sea, en condiciones bajo las condiciones cromatográficas. Es decir, el manejo de las muestras tiene, entre otras cosas, el hecho de cómo se almacenan las muestras previamente a su almacenamiento. Esto para nosotros es muy frecuente, porque cuando hacemos, y ahora que podemos trabajar con detectores automáticos, automáticos que trabajan con muchísimas muestras, y digamos, tenemos necesariamente la etapa de preparación de muestras, pasa a ser el factor determinante, el punto crítico. Todo el tiempo que llevan los análisis, nos encontramos que tenemos que almacenar, tenemos que preparar en frío las muestras ya concentradas, prontas para inyectar, y muchas veces nos afecta los niveles de evaporación de solventes, por ejemplo, y genera algunos problemas. Si el solvente que mezcla compuestos volátiles, que se están perdiendo, también compuestos volátiles. Pero además de eso, puede haber algún tipo de degradación por contacto con los. Y esto es obvio que es especialmente importante en el área de análisis de trazas, por ejemplo. Tanto se habla de análisis de trazas, la gente tiene que pensar que trabajando con contaminantes, residuos. Es cierto, la mayor parte, decir que el 80% de las aplicaciones hoy día vienen por ahí. Pero para los que trabajamos en mezclas buscando la compatibilidad biológica de los componentes, el aroma y sabor, o sea, el papel que tienen cada uno de sus componentes dentro de la mezcla individualmente, nos interesa muchísimo. De unos compuestos que se encuentran en bajísimas concentraciones, pero que tienen lo que generamos un umbral de percepción de olor muy alto, es decir, a bajas concentraciones se percibe. Y por lo tanto, para poder explicar algunas notas, algunos olores, algunas áreas defectuosas, lo que fuera, necesitamos trabajar también en traza. Y es frecuente, de hecho, lo que uno define muchas veces, impas, pueden ser la cantidad de componentes traza que se analizan. Lo interesante es que impureza, todo aquello que no nos interesa. O sea, si yo estoy buscando componentes, ya sea porque es un contaminante, ya sea que yo estoy buscando aquello que explica un determinado aroma, sabor, en fin, el resto de los compuestos en realidad me está fastidiando, pero está presente. Entonces, hay que tener en cuenta que esto tiene que ver fundamentalmente con lo que habíamos hablado en el caso de cromatografía gaseosa, el diseño de los programas de temperatura, los sistemas de inyección seleccionados y demás, de tal manera de poder dar una buena resolución y en un tamaño de pico que yo pueda, que supere, que sea un pico que supere la relación señal-ruido, para poder realmente conocer la identidad de eso que me interesa.

Cuenta ideal desconocido puede con facilidad ocurrir. Lo cuento como anécdota, un poco para darle color y vida a lo que estamos hablando, que incluso estamos viendo. Nosotros trabajamos en este momento en colaboración, colaboramos con un grupo bastante importante, no por el financiamiento, pero importante en cuanto a los resultados, en cuanto a que estamos trabajando con vinos. Y un problema que está en todo el mundo es el hecho de trabajar con variedades resistentes a hongos, fundamentalmente ataque de hongos de distintas viñas, resistentes a hongos, para por dos lados, un por un lado evitar problemas de pérdidas de calidad, pero fundamentalmente por el hecho de que los tratamientos con agentes fungicidas y demás en los viñedos son bastante importantes, y por eso se quiere trabajar bajando esa contaminación, ya sea orgánico, por productos orgánicos, o en términos genéricos. Pero lo que ha ocurrido es que trabajando entonces con desarrollo de variedades resistentes, que son entrecruzamientos, se encuentran que aparecen defectos aromáticos, no necesariamente que sean desagradables, pero que no aparecían en gente que no está acostumbrada. Entonces, estamos trabajando, han invitado a trabajar, intentar identificar qué tipo de compuestos son estos y dónde, en qué parte del metabolismo de la planta están, para ver si eso se puede, si es una señal que se puede evitar, si es un proceso que tiene que ver con una maduración temprana, lo que sea. Y eso implica justamente, puesto que nosotros tenemos un detector que se le llama olfatometría, narices detector, y encontramos los aromas que nos dicen que son problemáticos. Estuvo gente del exterior trabajando con nosotros acá, y la parte de identificación está dura. O sea, es un interesante ejemplo de este tipo de cosas. Obviamente, con contaminantes pasa todo el tiempo. La ventaja que tiene la gente que trabaja con contaminantes es que normalmente lo que sabe lo que busca. Nosotros no tenemos ni idea de lo que buscamos, pero muchas veces los residuos también en algún momento están en esa situación. Lo importante para trabajar con esa retención es justamente la relación que hay con las fases estacionarias, porque dijimos que para trabajar retención, trabajamos con alcanos, y también esto nos da una idea del comportamiento de los alcanos. Los alcanos, y cuando son luego ya avanzados, pueden ser ramificados, pueden ser insaturados, formar ciclos. Su retención depende.

Fundamentalmente de la presión de vapor. Aquí se muestra en cualquier fase. No, aquí se muestra un poco cómo son los elementos que hay que tener en cuenta en todos los compuestos, además de su funcionalidad. De hecho, las cíclicas deben ser visualizadas como funcionalidad. Si estamos hablando de compuestos y está ahí, ¿verdad?, la como cualquier modificación. Por ejemplo, si tengo una F unara, eh, poco polar o no polar, es eh los el orden de retención, tiempo de retención de los insaturados va a ser menor que los saturados. O sea, que los insaturados eh quedan eh, ¿cómo se llama?, eh, salen antes que los saturados. Pero con las polares, social, revés. Y bueno, ahí se ve todas las posibilidades. Esto, simplemente para tener en cuenta cómo la modificación de una molécula analito, ¿verdad?, puede efectivamente eh, modificar sí la eh, los tiempos de retención. O sea, hay que tener en cuenta también, como vimos hasta ahora, la naturaleza química estructural del sonito. ¿Se entiende esto? No. El ejemplo este, ¿por qué? Simplemente para explicar, primera, por las dudas. En con cuando las fases estacionales son poco polares, los hidrocarburos este insaturados son más volátiles que los saturados, o sea, salen antes. En las fases polares, los insaturados, o sea, los dobles enlaces son una funcionalidad y algo van a van a interaccionar. Por lo tanto, a pesar de ser más volátiles, vence, ¿verdad?, la interacción con la fase estacionaria y, por lo tanto, van a eluir primero los saturados. Los insaturados, los tiempos de retención aumenta con el número de carbono, según. Y aquí vemos, lo demás son, digamos, las conclusiones que se han sacado de trabajar con compuesto. De nuevo, insisto, eso determina, como último punto, de factor tiempo retención, determina la forma que una estructura compuestos, ¿verdad?, decir, influye o determina e los tiempos de elución, tiempos de retención.

Bien, el segundo enfoque, de la otra cara de la moneda del cromatograma. O sea, yo tengo un cromatograma que es un perfil donde tengo un gráfico de picos, donde asumo que cada pico debería ser un compuesto puro separado, ¿verdad?, logrado, logrado resolver, separar. Pero como vimos, eso tiene limitaciones. Pero bueno, asumamos que tenemos ya conocidas las limitaciones, trabaja. Vamos a hacer la parte cuantitativa. Es esto, es es como este concepto que está aquí. Es eso, como que uno se para frente a un cromatograma y dice, "Qué lindo perfil, qué lindo que le quedó". O sea, logré que se separaran, que todos los picos, qué bonito, en un tiempo razonable, sin ensenamiento ni deformación, fenómeno. ¿Qué hago con esto? Y bueno, yo tengo por un lado el eh, el orden en que salen, que eluyen, o sea, es el tiempo de retención de cada uno. Pero por otro lado, tengo un área de pico. Y esa área de pico sabemos que la podemos correlacionar de distinta manera, dependiendo del tipo de detector de que se trate, pero la podemos correlacionar con la cantidad de ese componente que se encontraba presente en la muestra que se inyectó. O sea, después de responder la pregunta de qué hay en la mezcla, siempre se ese saber qué cantidad hay, ¿verdad?, de alguno o de todos o varios. Eh, esta segunda pregunta, o sea, que que que cuánto hay, ¿verdad?, se ve respondida por análisis cuantitativo. Apunta a la determinación de la concentración o masa de un analito de una muestra. Un requisito básico para una cuantificación confiable es el desarrollo de un método analítico optimizado. O sea, F cada cada este tema que trat, cada enfoque que tratamos dentro de lo que sería ese perfil, ese gráfico de picos, viene siempre condicionado por lo que vimos anteriormente en la elección de un método analítico, método a aplicar. Hay algunos factores a tener en cuenta. Primero, ¿qué información queremos y qué información no suministra el método? El método involucra toda la parte de preparación de muestra, o sea, selección de muestra, preparación, instrumentación, detector, todo lo que vimos hasta ahora. Entonces, ¿cuál es la información que me da el método? ¿Cuál es que yo quiero? Yo quiero cuantificar. Hay que ver que la información que me da el método seleccionado me permite hacer la cuantificación. Y qué información voy a obtener, aunque estoy hablando de cuantificación. Y eso vamos a ver, vamos a ver por qué. Si hay ventajas y desventajas de la técnica que yo uso en comparación con otros métodos. Esto se llama, eh, ¿me acepta resultado? No me acerca resultado. Si yo tengo un dato que no está eh, o tengo un dato de contenido de un determinado componente o todos los componentes, los componentes que no cumple con determinadas eh requerimientos mínimos para eh, que esa información sea utilizable, o sea, ya sea académicamente o desde el punto de vista productivo o lo que fuere, será o no será aceptado. Y luego, eh, también tenemos en cuenta si es reproducible. ¿Qué tan exacta es? ¿Cuántas muestras se necesita? Esto lo hablamos en principio. Eh, ¿cuál es el nivel de detección? ¿Cuánto? O sea, ¿qué tan analito puede ser detectado? ¿Qué tipo de muestra se puede analizar por el método seleccionado? O sea, ¿todo tipo de muestra? ¿Algún tipo de muestra? Eh, hay hay limitaciones. Las muestras tienen componentes que puede interferir el análisis y cuantificación. También discutimos artefactos, descomposición, en fin, compuestos no volátiles. Y eh, otros factores a considerar son la velocidad, la conveniencia, el costo y la disponibilidad. Es decir, velocidad de análisis para ver cuántas muestras puedo analizar por ese método. La conveniencia es decir, se refiere a si no hay un método que después de que yo hice todo el trabajo, bueno, bueno, lo hago por espectrofotometría y se acabó. Si ves, o sea, no voy a usar eh, un tanque pancer para matar hormigas. O sea, no está muy eficiente. Se puede usar, pero no está bueno. Bueno, debe ser divertido. Eh, el costo. Bueno, si tanto para lo que es mi trabajo de investigación como para lo que es mi trabajo de desarrollo o su aplicación, determin hay un costo asociado. Que si yo puedo tener el método y puede tener el costo y puedo tener el fracaso si estoy este intentando justificarlo de ese modo. Y disponibilidad es si yo encuentro de que mediante la cromatografía graciosa copada, un sistema triple cuadrupolo con inyector automático, o sea, no lo tengo o me falta una de las piezas, no voy a trabajar a intentar eh, plantearme, ¿verdad?, las condicionantes para ese método cuando el método no está disponible o no está disponible para quien yo le estoy desarrollando. Esto es bien interesante. Y si ustedes se fijan, es algo, son como dos caminos que que a veces este eh, se se se se enfrentan. No es una misma, una misma, ¿cómo se llama?, una misma calle en el cual está flechada para para para los dos lados, pero simultáneamente no se puede ir en los en los dos sentidos. No. Eh, muchas veces nosotros este tenemos un desarrollo fantástico eh, y lo publicamos. En la publicación, normalmente, cuanto más sofisticado sea el método, o sea, por eso cuando vos tenés un equipo nuevo y es nuevo para todo el mundo, normalmente la gente saca cuatro, cinco, seis publicaciones inyectando cualquier cosa adentro porque nadie lo tiene. Entonces, o muy poca gente lo tiene. Los resultados ayudan al resto del mundo a familiarizarse con esa técnica, con esa técnica. No. Entonces, pesa muchísimo la sofisticación, la novedad y todo lo demás. Por lo tanto, eh, por ejemplo, lo que se ve hoy día es el top de la espectrometría de masa, que son los orbits. Eh, si trabajas con orbit, so. En cambio, en las aplicaciones, ¿verdad?, es exactamente la ruta contraria. Es decir, vos necesitás como base que tenga un costo accesible. Por lo tanto, la sofisticación va en el arte de utilizar herramientas que no son top of the art, que sea realmente necesario. Esto muchas veces en área de residuo, en lo que nosotros hacemos también. Pero bueno, no tanto que sean top of the art para poder el tope de lo que hay para poder desarrollarlo, sino que lo que se busca es básicamente que vos en un equipo con una duración razonable de vida útil, vos puedas sacarle el mayor provecho en cuanto a la información que obtenés. Eso es bien interesante. Y es algo que este, bueno, solamente para repasar un poquito las características analíticas son la exactitud. Eh, y ahí hay distintas formas, errores absolutos, relativos. Todos los métodos exacto contar un, dos, tres y a veces te olvidas, contiene errores. Entonces, ahí hablamos de errores aleatorios o sistemáticos, ¿verdad? Todo el mundo quiere tener errores sistemáticos. Eh, el algo es este que centrados en la media, repetí la muestra. Y el sistemático este muestran una diferencia definida del valor. O sea, eh, uno tiene que trabajar entonces tratando de trabajar con errores sistemáticos. Si tiene errores aleatorios, está en un problema. Y es divertido, pero es es un problema. La precisión, grado varía una siguiente. Fíjense cuando teníamos instrumentos, hablábamos del efecto de programa, temperatura o flujos en los tiempos de retención. Fíjense con los equipos que teníamos, esto precisión era un problema, ¿no? Bueno, y ahí tenemos lo que todo el mundo conoce. Tenemos baja exactitud, baja precisión. O sea, no solamente no le pego al centro, sino que este no logro agrupar los datos. Baja exactitud, no estoy muy cerca del valor ideal o real, pero tengo muy buena precisión. Alta exactitud, le pego al centro, pero muy baja precisión, me cuesta un montón repetirlo. Y lo que realmente todo el mundo quisiera en cromatografía. Eh, por otra parte, se toma en cuenta también lo que se llama el rango dinámico, que se refiere al rendimiento del detector. O sea, eh, bastante intuitivamente, el rango dinámico se refiere a eh, una zona en la cual yo puedo trabajar teniendo datos para ese sistema de detección, ¿verdad?, que cumplen con los requisitos que estábamos mencionando. Eh, dos rangos dinámicos de detector podemos definir. Un rango dinámico tal cual per se, y el rango dinámico lineal. El rango dinámico per se es el rango de concentración de analitos, solutos, so el cual el detector continúa respondiendo a los cambios de concentración. Es decir, yo sigo, agrego, voy agregando cantidades crecientes y el detector sigue respondiendo. No, no importa la forma en que responde, sigue, hay una respuesta a un aumento de concentración. Va desde la concentración el mínima detectable, o sea, el límite de detección, hasta la concentración de la respuesta ya no aumenta con aumento de la concentración. Ese es el rango dinámico. Pero luego hay un rango dinámico lineal, no, en el cual eh, hay una relación lineal entre lo que uno inyecta, la cantidad que inyecta y lo que da respuesta del detector para ese analito. Y va desde la concentración mínima detectable, o sea, límite de detección, esto es común, hasta hasta la concentración de la respuesta es mayor o menor que los límites de linealidad definidos, o sea, donde deja de ser lineal. Vamos a verlo gráficamente. Ese es el rango dinámico del detector. Yo tengo la señal del detector y la concentración, ¿verdad?, de que estoy testeando. Y hay un valor mínimo de detección, por debajo del cual este ya tengo problemas. Sigue el rango dinámico, hace que yo siga agregando analito y siga viendo respuesta, pero la respuesta se está haciendo, pasa a ser logarítmica. Entonces, defino lo que es el límite superior del rango dinámico, un superior del rango lineal, ¿verdad?, y el nivel de detección. Y en la zona donde tengo respuesta lineal, defino el rango lineal, en el cual voy a intentar trabajar. Y entonces se determina el límite de cuantificación y el límite de linealidad. Límite de cuantificación no tiene por qué ser el límite de detección, ¿verdad?, pero definiendo la relación señal-ruido, que en este caso se define más que tres. Puedo ver, defino un pico como se ve el ruido, tres. Aquí se subió a diez para cuantificar, para estar más seguro. Entonces, vemos cuáles son las condiciones de trabajo para ese detector y ese analito en particular. En el análisis cromatográfico, la señal aumenta en la mayoría de los casos linealmente con la concentración o masa, y es la base, la base cuantitativa. Para cuantificar un analito, se debe establecer la relación entre la magnitud de la señal del detector, es decir, cuál es la magnitud, el área o la altura del pico, o sea, el tamaño del pico está formado por, ya digo, altura y área, y la concentración del analito o masa del analito. Que en el mayor de los casos se realiza mediante el análisis de compuestos de referencia, o sea, con estándares. La magnitud de un pico cromatográfico se expresa de dos maneras: la altura del pico y el área del pico. O sea, yo puedo trabajar cualquiera de los dos factores, ¿verdad?, y ambos van a estar relacionados con el nivel de contenido del analito en cuestión. Entonces, la para establecer, me quedó la figura, no la he mejorado, para establecer estos criterios se establecen todo esto que ya hemos visto: altura, área, línea de base, la nosotros hablamos, inyecta para respuesta del detector, la forma de inyección, los tiempos de retención ajustados o no, la eh, la altura y el área del pico. Y vamos a ver que la línea de base, comportamiento de la línea de base, que ya hemos discutido, eh, es muy importante. Pero en cualquier caso, el objetivo o los enfoques pueden ser el cálculo de componente, la cantidad de componente deseado, concentración por altura o de pico o por área de pico. Problema, primer problema es la forma de integrar. Eh, la forma de integrar se puede hacer si en este caso, ¿verdad?, se está calculando sobre la línea de base. Tengo estos problemas acá, ¿verdad?, o acá, son diferentes. O sea, hay distintas maneras de integrar, pero la cada vez que nosotros integramos, terminamos. Por ejemplo, si yo esto lo que se está haciendo es integrar a línea de base en todos estos casos. No, fíjense cómo se considera mayor o menor cantidad de pico de acuerdo a cuándo está funcionando la línea de base. V, B, se base a base. En este caso, la línea de base. ¿Qué quiere decir? Que de acuerdo al movimiento de base, si yo entrego base a base, que significa que lo que estoy viendo es que donde se produce el punto de inflexión, se integra, ¿verdad? Entonces, donde coinciden ambos, hay se establece la diferencia. Pero este pico sigue hasta acá, sigue hasta acá, ¿verdad? Me estoy comiendo un pedazo en cada uno. Y en una línea de base de este tipo, afecta de determinada manera. Si yo tomo línea a línea de base, en este caso, por ejemplo, aquí sería prácticamente lo mismo. Aquí no. Y si lo tomo valle a valle, ¿verdad?, es decir, de acá acá, de aquí aquí, aquí me funciona, aquí no. O sea, hay que tener en cuenta cómo se comporta el analito en cuanto a su resolución. Exp que este la resolución siempre se establece entre dos picos y cómo está funcionando, cómo se comporta la línea de base. El sistema más simple de cuantificación, ¿verdad?, supongamos que quiero cuantificar este, este y este. Este, este y este son tres situaciones distintas. Este está bastante bien resuelto, este no, y este está bastante an. Pero lo que hago es lo que hago es, tengo las áreas y sumo las tres áreas. En este caso, sí, A, C y eh, o el área de todos los picos como se quiera y lo expreso como valor relativo, porcentaje de área. Ya vimos que el área está afectado por este tipo de problema. Pero además, eh, ¿cuántos picos tomo para identificar, para cuantificar? Todos. Aquí parece sencillo. Y estos piquitos chiquitos, o sea, hay variaciones. Este piquito acá, hay variaciones. Entonces, normalmente este método no es válido porque se asume que cada pico tiene el mismo factor respuesta en el detector. O sea, este factor que vemos acá puede no ser y a eso viene el tema, puede no ser una consecuencia de una mala resolución o de tiempos largos, sino que puede ser también consecuencia, ¿verdad?, de que la respuesta del detector no es buena y cada, cada analito tiene una respuesta diferente que nosotros asumimos como uno acá, que todos tienen la misma respuesta. No siempre es así. Por lo tanto, aquí aparece el problema de si no sabemos qué compuestos son, no sabemos si tenemos estándares y necesitamos estándares para conocer los factores de respuesta. Y se asume que las áreas y los picos considerados representa el 100% del área que yo decía. Y los piquitos estos de acá y este piquito, si lo integro, y esto de acá, o sea, bueno, diferenciando, son sí, son mínimas, pero son un valor que este afecta claramente al eh, ¿cómo se llama?, al numerador, al denominador, perdón, y por lo tanto, al valor. Entonces, eh, aquí este método se utiliza muchísimo todavía, eh, porque en algunos casos, ¿verdad?, el error eh, introducido por el uso de estándar puede ser muy grande. Por qué, porque el problema es que uno tendría que tener una factor de respuesta, se calcula bastante obvio, ¿verdad?, variación de concentración en función de respuesta, que es el área para cada compuesto, factor respuesta es la el, ¿cómo se llama?, la tangente, el ángulo, eh, perdón, la pendiente, quise decir, eh, y tenemos que tener todos los estándares. Nosotros trabajamos con 100 compuestos, 1000 compuestos, eh, es un problema. Entonces, en ese caso, estoy aceptando como primera medida, una para tener una idea de las entidades, la importancia relativa de cada del cada compuesto, valor de compuestos de una mezcla. Se puede utilizar porcentaje de área, pero en la mayor parte de los casos no, cuando vos estás midiendo algo que interesa porque querés saber el nivel de de ese compuesto, eh, por contaminación o como yo decía, para tener una idea de si está por debajo, por encima, se puede producir olor o no sabor, dependiendo de la que se encuentra, supera o no el umbral de percepción. Entonces, es necesario cuantificar y este método no funciona.

La normalización de área mediante factor de respuesta es lo que estábamos hablando. O sea, para cada compuesto yo determino, veo que fíjense, A, B, C. Por más que eh, tuvieran el mismo tipo de eh, de forma de pico, pudiera ser que todos tuvieran el mismo tamaño y las concentraciones fueran distintas porque el factor respuesta es obviamente diferente. Las pendientes son claramente diferentes. Sí, o sea, yo multiplico el área por el factor de respuesta y tengo, puedo tener este realmente que áreas muy diferentes tengan, representan el mismo contenido, concentración de analitos. ¿Entienden? Eh, por otra parte, también no eh, determina que estas picos que tengan distinta forma, ¿verdad?, que la respuesta del detector sea distinta, los factores son distintos, ¿verdad? El factor respuesta de C, por ejemplo, es mucho mayor que el resto y, por lo tanto, explica por qué tengo un pico de esta de esta magnitud, de esta magnitud. Factor respuesta es una respuesta, ¿verdad? Aquí está el cálculo con factor respuesta y sin factor respuesta para cada determinación, porcentaje de área, cómo se haría un cuatro y aquí cómo se haría con el factor respuesta correspondiente, o sea, corrigiendo cada área por su factor de respuesta correspondiente. Okay.

Eh, bien, otro sistema. Ese sistema más simple, ¿verdad? O sea, tratar de sacar directamente la información que tengo el cromatograma, que es traducida en un área y utilizar directamente esas sumatoria de áreas o este por otro lado, ¿cómo se llama?, utilizar el factor de corrección de respuesta del detector. Para otro sistema de trabajo es el de estándar interno, básicamente en HPLC, ¿verdad?, y se utiliza picos de referencia, referencia. Hay que hacer calibración y requiere reproducibilidad de la inyección en cada muestra. Problema, automático, útil, pero no está en cromatografía HPLC. ¿Por qué? Porque recuerden que en cromatografía gaseosa no tenemos. Nosotros pasamos, supongamos que hacemos una, tenemos una muestra líquida, volátiles en solvente o esencial que son volátiles, propio solvente. ¿Qué pasa? Yo paso de una fase líquida a una fase gaseosa en el liner. Del liner tengo divisor de flujo. El divisor de flujo eh, separa su fuente proporcionalmente de los componentes, los analitos, entre lo que ingresa. Representa sus relaciones entre sí se mantiene con lo que sale. Las mismas relaciones que lo que ingresa es lo que sale. Después pasa a fase líquida, o sea, se produce la condensación en cabeza de columna para luego pasar a fase gaseosa y se produce todo el intercambio. En todo ese proceso, ¿verdad?, incluye nuevas variables, ¿verdad?, o nuevas fuentes de error, para decirlo mejor, que hace que este sistema en el cual se considera una corrida externa, una corrida que uno guarda y va utilizando, no se considera como método conveniente. Entonces, lo que más se utiliza es estándar interno. ¿Verdad? Preparar, inyectar la muestra, ya se prepara con interno. Y aquí este aparece el famoso problema de que uno debería usar interno, este, ¿cómo se llama?, lo más parecido al compuesto de interés. Esto fue un problema durante mucho tiempo. Entonces, en general, lo que se hace es inyectar uno o más estándares internos que cumplan con los requisitos que se solicitan, que ser, tiene que ser un agregado externo a la muestra para poder medirlo. Obviamente, hay que hacer la mezcla con, calcular la relación de áreas y de determinar relación de concentraciones y los valores de respuesta a partir de calibración. Entonces, normalmente lo que se hace y problema, lo que se hace cuando se quiere cuantificar solo un solo componente, problema, un estándar interno. Siempre se utiliza las mismas condiciones, como ya mencionamos, con el tiempo de retención, se utiliza el mismo estándar interno y se refiere a ese. Ningún problema. Pero en una mezcla compleja, 100, 200, 300 compuestos, si estoy refiriendo a una a una este estándar, todas las concentraciones de vuelta, me estoy comiendo todos los factores de respuesta de cualquier manera, ¿verdad? Es la técnica que más se ha utilizado y se sigue utilizando a veces en cromatogramas muy largos, como los nuestros, nosotros colocamos más de un estándar interno porque los picos se van este ensanchando y por lo tanto, lo colocamos en distintos lugares. Estándares internos y lo cuantificamos según la zona. Los requerimientos de un estándar interno son: estándar interno debe ser un compuesto puro. Bien, los picos deben estar bien resueltos en las condiciones, ya lo hablamos, por tiempo de retención. El compuesto estado está interno nunca debe estar presente en la muestra a analizar. Es decir, si tengo la muestra a analizar y agrego, entonces estoy haciendo un agregado de un determinado compuesto, no sé cuánto es el valor interno, interno, valor del área, referencia, aporta el área de uno y otro, aporta lo que estaba. Y en lo posible, compuesto similar al compuesto usado como interno. De encontrar con concentraciones similares a los componentes. Perfecto. En las mezclas complejas, esto también es un problema. Tengo compuestos en niveles traza, compuestos en eh, cantidades importantes, en valores medios, en valores intermedios, de todo. Pero es de los que son de ese método de elección para tratar de resolver este problema. Cuando se trabaja con eh, buscando un analito en particular, una de las técnicas más utilizadas, ¿verdad?, es la técnica de adición de estándar. Esta técnica tiene limitación cromatografía de la dificultad de inyectar en forma exacta cantidades conocidas de muestra. Pero eso superado con los inyectores automáticos, ¿verdad? Lo que se hace es, si yo tengo un analito de interés X en una mezcla, si lo que se hace es se va agregando la misma cantidad de estándar de analito y aumenta la concentración y aumenta el área. Entonces, la cantidad es corresponde a esta fórmula que responde a esta gráfica. O sea, yo tengo la la muestra, ¿cómo se llama?, sin agregado, a la muestra agregada. Y de esa manera lo puedo determinar, por ejemplo, por relaciones directas o utilizando un estándar interno. Entonces, de esa manera, el estándar interno va a ser el mismo. Y yo lo que tengo que un área va aumentando, entonces puedo determinar la gráfica. Y esa gráfica donde no hay agregado pasa por cero, me está indicando la concentración del del compuesto que a mí me interesa. Es laborioso, pero es un método muy bueno y se utiliza en algunos casos bastante, pero es muy laborioso. Por lo tanto, la modalidad, digamos, que se ha resuelto trabajar con análisis isotópica es un caso especial del uso de estándar interno porque se utiliza, ¿verdad?, en espectrometría de masas para cuando se utiliza, no se puede utilizar en cromatografía gaseosa con el tipo de detector que no sea espectrometría de masa. Pero asumiendo que la espectrometría de masa acoplada a cromatografía gaseosa es ya se llama un equipo stop, equipo de de mesa de mesada, como es un espectrofotómetro, si ya es algo que no es imposible de entrenar, esto sí es una solución muy elegante. Es decir, tenemos el analito problema y que está que sabemos estamos buscando. Esto es para compuestos que sabemos que cuáles son. Lo contrario, técnica de estándar interno por definición. Eh, los análogos que tienen, tienen marcado, por ejemplo, deuterio, carbono 13, nitrógeno 15, se usan como estándares internos. Son la elección ideal para cuantificación en métodos basados en espectrometría de masa, o sea, que sus propiedades físicas y químicas son idénticas a casi idénticas a los análogos no marcados. Qué esto, si yo cuando marco un carbono, tengo un M+1 fragmentación, ¿verdad? O sea, el peso molecular más uno que agregué por protón, deuterio, 12 carbono, 13, 14, 15. Y pero el orden de elusión no cambia porque las propiedades fisicoquímicas no cambian. Potencialmente, no. Entonces, se distinguen por ion de masa debido al cambio de masas a masas mayores, o sea, M+1, ¿verdad? Y ahí es como se muestra. O sea, de vuelta, yo tengo el analito y el agregué el estándar interno marcado, que obviamente eluye en el mismo lugar, pero en el detector de masa yo veo, ¿verdad?, que para el mismo tiempo de retención tengo eh, una masa determinada y tengo esa misma masa más uno. Y los puedo por relación de masas, puedo este determinar el contenido. Y es de lo más elegante porque es al mismo tiempo de retención con el mismo factor de respuesta, ¿verdad? Eh, y con un sistema de detección que me permite verlo. Fantástico. Se utiliza muchísimo eh, cuando obviamente para buscar analitos que interesan, por ejemplo, en caso de trazas, por ejemplo, en caso de coelusión, funciona muy bien cuando espectrometría de masa. Vamos a ver con por qué y qué consecuencias tiene estudiar este tipo de cosas. Eh, se aconseja que haya un desplazamiento de tres unidades de masa atómica, tres Dalton. A veces se puede, o sea, M+3 compuesto o del fragmento que esté siguiendo, más tres unidades. Esto a veces es posible y a veces no. Pero es, o sea, a veces M+1 nada más y es, pero realmente, créanme, es fantástico. Lo que tener en cuenta que lo vamos a ver en espectrometría de masa es que si seguimos el peso molecular del compuesto, no hay ningún problema. Pero si estamos siguiendo un fragmento, es un pedazo de compuesto, eh, o sea, tenemos y está marcado en muchos lugares, tenemos obviamente, si es un fragmento, el marcado tiene que quedar en el fragmento. Pero si está marcado en muchos lugares, a veces hay fragmentos en los cuales queda marcado M+1, marcado M+2, marcado M+3, depende de cuáles sea la ruptura para que quede eh, los distintos marcados de átomos marcados en en un determinado fragmento. Eh, pero recuerde que es de una elegancia absoluta. Bueno, aquí esto no lo vamos a discutir. Es simplemente el sistema de los, ¿cómo se llama?, los inputs y outputs en un sistema. La creación de un método analítico. O sea, una vez elegido el método, este método eh, se va a optimizar y se va a establecer un tema de calibración. Si todo esto es posible, vamos a tener un método candidato. Vamos a terminar validarlo con todas las características de validación que hemos visto y algunas más. Si el método es validable, tenemos, se puede aplicar en forma rutinaria y pasamos a control de calidad con los ajustes que sean necesarios. Pero si el método no cumple con la validación, ¿verdad?, puede volver a la selección de, tengamos que cambiar de método o tengamos que entrar a reoptimizar. Eh, este sistema de input-output, o sea, Quality in, Quality out, calidad aporte, digamos, de ingreso, información de ingreso, información de salida. Fíjense que aquí lo que se muestra es que el sistema de control de calidad o aseguración de calidad, como ustedes quieran llamarle, aseguración de calidad que implica mucho más, tiene que tener en cuenta toda una serie de factores, entre los cuales este está procesamiento de datos también.

Bien, para terminar, una de las mayores limitaciones que encontramos en cromatografía gaseosa es que no es capaz de compuestos que no son volátiles. Lo mismo ocurría en HPLC cuando teníamos teníamos cromóforos, por ejemplo, o absorbencia. Entonces se le podía agregar derivados, agregando compuestos en HPLC. Los problemas volátiles no existen, pero hay técnicas de transformar en los compuestos, ¿verdad?, si se quiere analizar por cromatografía de gases para que sea posible hacer. Es el caso de azúcares, polímeros. Y llegamos al concepto de derivatización. Eh, las razones para transformaciones químicas para producir derivados son, en caso de cromatografía, son cómo no volátil, podría ser transformado en volátil, no en todos los casos, pero en muchos casos. Mejorar la detección a través de derivados. Esto en el caso fundamental. Y los derivados son generalmente térmicamente más estables que el analito. La derivatización involucra una reacción química entre el analito y un reactivo, de modo que el producto de reacción cambie sus propiedades químicas y físicas de eh, más visible al detector o analizable. Por la selección del agente derivatizante es tener una cinética de reacción, la reacción razonable y cuantitativa. No nos puede quedar analito sin derivatizar. El exceso de reactivo o su producto no deben ser detectables o no fastidiar. Debe reaccionar con el analito que hay que para cada analito, hay condiciones experimentales para cada naturaleza de analito. Debe ser tóxico y manejo. Esto no es broma. El derivatizante más utilizado por todos nosotros por trabajar en grasas es este, llama un reactivo que hoy día no no se utiliza por su toxicidad, aunque bueno, en algunos casos llama, se sigue usando bajo campana y sí, pero hay limitaciones importantes. Y que haya disponibilidad del reactivo que necesitamos. La mayor parte de las reacciones de derivatización se pueden clasificar en tres grupos: sililar, alquilar o acilar. La mayoría de reacciones, cantidades mínimas de reactivo, o sea, para lo que nosotros son limitantes, siempre la cantidad de muestra. Y las reacciones de derivatización se realizan a temperatura ambiente. El calentamiento puede llegar a ser de 60 a 100 grados como máximo. La mayoría están entre 40 y 60 grados. La acilación es la más usada. Implica reemplazar un hidrógeno activo en un soluto, un alcohol, un ácido, una amina por un grupo alquilo, generalmente trimetilo, ¿verdad? Y estos ésteres, derivatizantes, derivados es que hacen que el soluto se forme menos polar, más volátil y más termoestable. El más utilizado es el trimetilsilil cloruro. Forma este tipo de derivados los ácidos y los hace o los alcoholes y los hace. Hay otros. El silano ha sido sustituido por otros que son como llama, un poco más deficientes. Amida, la trifluoroacetamida, p-amida. Estos son, este es uno de los más utilizados. Son estos dos. [Música] La etilamina, acetamida, forman derivados trimetilsililados. Derivado es siempre el trimetilsililado, este derivado, este siempre. Pero son más estables con la mayor parte de los grupos orgánicos funcionales en condiciones de reacción relativamente suaves, o sea, que no hay que someter a los analitos a condiciones muy, muy drásticas, aún con los rangos que mencionamos. Y son este, son bastante estables. La alquilación, lación de un grupo alquilo a un grupo funcional activo de soluto. Un ejemplo muy común es la esterificación de ácido carboxílico por alquilar un éster metílico volátil. Y se utiliza fundamentalmente trifluorometanol, metanol. Funciona muy bien. Obviamente, aquí no mostramos lo que queda. Lo que queda implica que este no nos afecte los cromatogramas. La acilación implica transformación del soluto en derivados acilados. Se utiliza en general para mejorar la volatilidad de alcoholes, fenoles, tioles y aminas. Este tipo de grupos. Como otro tipo de reacciones, G, la oxidación también puede utilizarse la respuesta de un soluto detector. Por ejemplo, inclusión de átomo de flúor en el agente rante permite la detección de solutos en en captura electrónica. Es decir, cumplen las dos funciones. Por un lado, facilita el análisis cromatográfico en cromatografía de gases, haciéndolo más volátil. Pero además, como ocurre mucho en HPLC con los cromóforos, aquí el agregado de halógenos, por ejemplo, caso de flúor, permite un mayor sensibilidad a el captura electrónica, ¿verdad? Trifluoroacético, sí, es uno de los más utilizados. Bueno, se ve la reacción. Otro tipo de reacciones, alquilantes, acilantes son lo que la metilacetamida, como que se que también produce este tipo de reacción. Y con eso tendríamos básicamente cubierto todo lo que queríamos ver. Un poco para este, un poco para resumir lo que hemos visto ahora, ¿verdad? Digamos aquellos factores que nos fastidian la vida, o sea, los problemas. Todos, muchísimos libros están dedicados a esto, a las categorías de, o sea, qué tipo de problemas pueden aparecer. Los más importantes son cuando se muestra ahí alteraciones de la línea de base, forma, tamaño de los picos, desplazamiento de los tiempos de retención, pérdida de separación o resolución, dificultades en la cuantificación, deterioro acelerado de las columnas. Gascopic, los famosos artefactos y picos de solvente ensanchado. Estos son los más importantes. No es nada nuevo, es un resumen exactamente de lo que vimos hasta ahora. La línea de base, nosotros la referimos siempre a ruido, esto lo frecuente, pero pueden aparecer otras situaciones como llaman spiking, es decir, que son señales eléctricas, ¿verdad? Hoy día con los software se pueden ampliar y se ve que tiene una pequeñísima área, ¿verdad?, pero son básicamente eh, alteraciones de la línea de base por eh, suministro de energía. Las ondas también pueden aparecer. Esto normalmente está asociado a problemas neumáticos, o sea, problemas en las líneas de suministro de eh, gas portador. Eh, la parte de deriva de la línea de base, esto ya lo vimos, que ocurre con alguna fase, programa de temperatura, por sangrado de las columnas, eso es un problema. Y este tipo de fenómeno que se observa muy poco, pero que puede aparecer tanto positivo como negativo y que establece un problema de discontinuidad en el sistema de detección. Y esto hay que hay que estudiarlo para cada detector y para cada tipo de muestra. Pero eh, por ejemplo, el en el otro día en las preguntas, decían, había aparecido uno que tiene que ver con la fluorescencia, decía apantallamiento. Bueno, aquí hay algo parecido, pero depende de cada tipo de detector, o sea, que no vemos, pero fíjense que hay variaciones. Solo son la línea de base por distintas razones que uno puede, en principio, en estos casos identificar. Hay combinaciones, o sea, que es más complejo que esto, pero digamos que estos cuatro tipos son de equilibrio. El tipo de pico, simplemente para mostrar también todo lo que puede aparecer. Fíjense, pico simétrico, porque lo que queremos. Tailing, el tailing es esto, o sea, yo tengo una respuesta muy rápida y luego una bajada muy lenta. El fronting, que ya vimos. Bueno, eh, la digamos, el agujero en la línea de base o después o antes, en realidad, es un pico negativo. Hay que mirarlo como un pico negativo. Aquí, fíjense que eh, cuando aquí nos da una explicación es muy básica, pero dice, bueno, cuando hay tailing, distribución está la interacción entre las fases está eh, modificada, está cambiada, ¿verdad? Una de las formas es por gran cantidad de solventes que quedan compuestos. Aquí hay como lo mencionaba, eh, tanto el pico negativo delante o detrás habla de interacciones no deseadas con el detector. Por eso hay que verlo para cada detector, como ya decía. Separaciones pobres, eh, hombros, separaciones a línea de base, agrupamiento. Esto parece muy, esto parece muchas veces y es muy difícil saber si se trata de muchos picos que están coeluyendo, respuesta picos negativos, ensanchamientos. Se refiere el pico negativo son problemas de de conexiones de polaridad. O sea, esto hoy día prácticamente no pasa, pero en, o sea, los detectores tienen polaridad, ¿verdad? O sea, yo establezco entre por dimensión de llama, yo tengo una diferencia potencial establecida de una determinada manera, pues yo puedo cambiar la polaridad eh, y aparece el mismo pico negativo. Hay que tener mucho cambio de polaridad que lo bueno. Ensanchamiento, problemas de flujos. Esto es típico cuando tiene un pico cortado de esta manera, es que hay saturación del detector. Ha arriba, el detector saturó y no lo puede medir. Se picos dobles. Esto es inyecciones no son adecuadas por inyecciones manuales, es inyección nerviosa, si inyectar terminando inyectando dos veces. Y bueno, después otro tipo de cosas, ¿verdad?, que aparece de acuerdo. Bueno, eso es más o menos el resumen de lo que quería la clase. Nosotros vamos a tener la oportunidad de intercambiar ideas este acerca de esto. Por supuesto, todo tipo de consulta, duda, lo pueden hacer directamente a eh, nuestros correos electrónicos o mejor al aula virtual para poder compartir. Nos está viendo.