Métodos Separativos - Clase 3 - HPLC: el equipo básico básico

Buenas tardes a todos.

Esta es la primera versión del curso de métodos separativos en su forma COVID-19. Considerando la situación actual que estamos teniendo, la vamos a tratar de pasar las clases a este formato en el cual ustedes puedan ver las transparencias y nosotros, digamos, hacemos la clase solamente hablada.

El asunto para las dudas y las consultas, nosotros esperamos que ustedes participen dentro de los foros del curso. En los foros del curso ustedes pueden entrar y consultar las dudas que tengan o despejar cualquier otra cosa, hacer comentarios. Estamos abiertos a todo tipo de consultas, así que, por favor, traten de hacer uso de eso, ya que no vamos a estar dando las clases en forma presencial por este momento.

Bueno, la clase de hoy, lo que vamos a hacer es hablar acerca del HPLC, sobre el equipo básico. HPLC, la sigla de HPLC, en realidad hace referencia al High Pressure Liquid Chromatography o también a veces dicho como High Performance Liquid Chromatography. Cualquiera de las dos es válida, ya que estamos en realidad trabajando con equipos que tienen una alta performance justamente por la presión a la cual están trabajando.

Bueno, lo que vamos a tratar de ver hoy en esta clase es, en un primer momento, los esquemas generales para todos los equipos de HPLC, digamos, el equipamiento básico que tienen que tener sí o sí para poder trabajar en un HPLC. Después, vamos a pasar un poco a lo que es la parte de cada componente en sí. De eso, vamos a hablar un poco del bombeo de la fase móvil y la fase móvil. Después, vamos a hablar un poco de la conectividad entre las distintas partes del equipo. Eh, después, vamos a tomar un tiempito para hablar sobre la introducción de la muestra al sistema cromatográfico y, por último, vamos a dar una breve acercamiento a las columnas, pero solamente a las generalidades, ya que van a tener posteriormente una clase que va a hablar justamente sobre las fases estacionarias y los distintos tipos de fases estacionarias. Como ustedes ven, tampoco estamos tocando el tema del detector, porque va a haber una clase exclusiva para los detectores de HPLC y los distintos tipos de detectores que podemos tener.

Bueno, lo que tenemos acá en esta imagen es básicamente el esquema general del equipo de HPLC. En el mismo podemos ver, por un lado, acá una botella, un reservorio para la fase móvil, para el disolvente que vamos a usar. A partir de este reservorio de fase móvil, pasamos a nuestra bomba, que es la que va a aplicar el flujo constante de la fase móvil a través de la fase estacionaria y es la que va a generar la presión necesaria para trabajar en condiciones de alta presión. Luego de que tenemos nuestra fase móvil a alta presión, lo que necesitamos es introducir la muestra de alguna manera, y ahí lo que vamos a tener en nuestro sistema de inyección para poder poner nuestra muestra dentro de este sistema que está a alta presión. Una vez que introducimos la muestra, pasamos propiamente a nuestro sistema cromatográfico, pasamos a la columna cromatográfica, que es la que tenemos acá. Y una vez que terminamos de sacar nuestros analitos de la columna cromatográfica, evidentemente necesitamos pasar por un sistema que nos detecte, que nos detecte qué es lo que está pasando. Entonces, necesitamos un detector que va a generar una respuesta a partir de los analitos y va a generar entonces, a partir de eso, con nuestro sistema de recopilación de datos, vamos a poder ver un cromatograma. Luego de acá, la muestra puede ir directamente hacia un descarte o, dependiendo del caso, lo podemos recuperar para tratar de quedarnos con cada uno de los analitos que van saliendo.

Básicamente, esto que tenemos acá, este esquema, es el circuito que sigue el líquido, nuestra fase móvil. Nuestra fase móvil empieza directamente desde los botellones que la están conteniendo y de ahí van a pasar, por ejemplo, a este mezclador y de aquí vamos a llegar hasta la bomba. A partir de que llegamos a la bomba, la bomba bombea y empezamos a mantener nuestro sistema todo a alta presión. ¿Por qué hacemos una diferencia entre todo esto? Hay una diferencia grande en líquido, particularmente en los tamaños de las tubuladuras. Digamos, en la parte previa a la bomba, nuestro sistema no está a alta presión y, al no estar a alta presión, las tubuladuras tienden a ser de un diámetro interno bastante más grande, porque entonces permitimos un flujo este del disolvente bastante bueno. Ahora, una vez que salimos de la bomba y tenemos que mantener la alta presión, mantener una presión alta con una tubuladura de diámetro interno muy grande es bastante más complicado. Entonces, los diámetros se achican para poder mantener los flujos y los volúmenes en una forma contenida y tener, digamos, una presión en, digamos, una presión aceptable para poder trabajar, particularmente después de pasar el puerto de inyección. Aquí tenemos un descenso en el tamaño de la tubuladura, como les marca acá, un diámetro interno de 0,1 mm, debido a que nosotros estamos tratando de disminuir que nuestra muestra se diluya en la fase móvil, porque si no, una vez que llega al detector, la muestra puede estar muy diluida y estamos perdiendo parte de la muestra porque no somos capaces de detectar bien.

Los sistemas de HPLC, básicamente, los podemos ver como sistemas en módulos. ¿Qué es lo que se refiere esto? Cada una de las piezas esas que nosotros veíamos aisladas en el esquema, si volvemos a mirar el esquema primero que teníamos, cada una de las piezas que nosotros vemos en el esquema, en realidad está compuesta por un módulo y esos módulos los podemos tomar como unidades separadas y, en general, podemos intercambiarlos para darle las prestaciones que nosotros queremos al equipo.

Después, ¿cómo controlamos cada uno de esos módulos? Tenemos dos opciones. La primera es, como en el caso de este que tenemos en la foto, en el cual tenemos un sistema que tiene dos bombas, como podemos ver ahí, un detector, un horno para termostatizar las columnas, un inyector automático y un controlador. Cada uno de estos módulos tiene un panel propio y un visor propio que nos permite a nosotros controlar cada uno de los módulos en forma independiente. Sin embargo, tenemos otro tipo de equipos en los cuales tenemos todos los módulos, pero todo el control de cada uno de esos módulos se hace a partir del software que lo tenemos en una computadora.

Bueno, ahora vamos a hablar un poco acerca del bombeo de la fase móvil. El bombeo de la fase móvil funciona a partir del sistema de distintos sistemas de bomba que van a variar, de repente, en la forma en la que se ven dependiendo del fabricante, pero en general, la parte interna y el funcionamiento de los mismos es bastante parecido y lo podemos englobar dentro de ciertas cosas. El bombeo de la fase móvil podemos distribuirlo en dos formas, lo podemos diferenciar en dos formas, en si lo estamos trabajando con un flujo constante o una presión constante. Este es importante también la composición de la fase móvil que nosotros vamos a estar trabajando y si requerimos o no de un mezclado y los tipos de bombas con los que estamos trabajando. En general, como yo les decía, las podemos separar entre si son de flujo constante o presión constante. No podemos regular las dos cosas a la vez, ya que la presión es una consecuencia del flujo. Entonces, si nosotros controlamos la presión, el flujo se va a ir a la presión que queremos mantener y viceversa. Eh, las bombas de presión constante, lo que hacen básicamente, funciona trabajando a una presión constante. No es lo más corriente trabajar con una presión constante. La mayoría de las formas de trabajo y las operativas se rigen a trabajar con un flujo constante.

Las bombas de flujo constante son de dos tipos. Tenemos las bombas de tipo de jeringa y las bombas de tipo de pistones. Las bombas de tipo de jeringa tienen una ventaja importante que es no tienen las pulsaciones naturales de la bomba de pistones, ya que el flujo se entrega en una forma sumamente homogénea. Pero tiene la desventaja de que el flujo está limitado al volumen que tenga esa jeringa. Las bombas de pistones, por otro lado, sí presentan pulsaciones debido a la naturaleza misma del desarrollo, pero nos pueden entregar una cantidad de fase móvil prácticamente siempre y cuando uno mantenga rellenando las botellas contenedoras de disolvente. Entonces, de estos dos tipos de bombas, en general, las bombas de pistones son las bombas que se usan en la mayoría de los lugares.

¿Cómo funcionan las bombas de pistón? Bueno, la bomba de pistón básicamente tiene esta este tipo de composición en el cual nosotros tenemos una leva que gira, sí, y el movimiento de la leva lo que va a hacer es el movimiento que se mueva el pistón hacia dentro y hacia fuera. Cuando el pistón se mueve hacia dentro, lo que va a hacer es empujar la fase móvil que está dentro de la cámara y esa fase móvil va a salir. En teoría, podría salir por cualquiera de los dos lados. Para evitar en la fase móvil entra y salga por el mismo lado, lo que tenemos son sistemas de válvulas. Esta diseño de bomba posee dos válvulas: una válvula superior y una válvula inferior. Las dos válvulas están compuestas por una bola de zafiro, que es el puntito rojo, y tiene un asiento, que sería la parte rosada inferior. Cuando la bola de zafiro se apoya sobre el asiento, la válvula está cerrada. Cuando la bola de zafiro está tocando contra la otra parte de la válvula, aquí la válvula está abierta y permite el pasaje de la fase móvil hacia dentro. ¿Cuál es la salvedad aquí? Bueno, las dos válvulas están puestas en la misma posición. O sea, que cuando nuestro pistón empuja la fase móvil, la presión aumenta dentro de la cámara. Eso va a hacer que las dos bolas se vayan lo más lejos posible. La bola superior va a ir hacia arriba, dejando la válvula abierta hacia el lado de la columna, y la válvula inferior, que es por la cual entra, se va a ir hacia abajo, se va a apoyar sobre el asiento y cierra esta válvula. Por consiguiente, cuando el pistón está volviendo, la fase móvil únicamente puede ir en la dirección hacia la columna. Cuando el pistón se retrae nuevamente, esta pequeña válvula se viene hacia arriba porque la presión disminuye dentro de la cámara, dejando abierta la válvula, y esta otra se viene hacia abajo también por la presión que la está trayendo aquí, se pone sobre el asiento e impide el retorno de la fase móvil desde la columna. Entonces, este sería el funcionamiento básico de un pistón en una bomba de HPLC.

¿Cuáles son los puntos sensibles de esta bomba? Bueno, son sensibles los sellos, los sellos que mantienen, digamos, evitan que el pistón pierda la fase móvil por los costados. El sello del pistón es bastante susceptible. Los pistones son susceptibles a rayarse, sí, y una de las cosas más importantes son las válvulas. Las válvulas son zonas bastante sensibles de la bomba, ya que esa pelotita de zafiro puede trancarse, se pueden pegar en el asiento y eso produce que los flujos de la bomba no sean constantes o que puedan llegar a tener problemas de que no tengan flujo en lo absoluto. Es importante también evitar la presencia de partículas y formaciones de depósitos salinos, porque las partículas y los depósitos salinos pueden rayar el pistón, produciendo que se tenga una baja en el performance mismo.

Como yo les contaba, el pistón tiene dos posiciones básicamente: una en la cual está ingresando la fase móvil adentro de la cámara, como muestra en el primer dibujo, y uno en el cual está empujando la fase móvil hacia la columna, como muestra el segundo dibujo. Eso nos trae un pequeño problema. Cuando nosotros estamos rellenando la cámara con fase móvil, como muestra este pequeño dibujo acá, lo que tenemos es una baja en la presión de la columna. Sin embargo, cuando nosotros hacemos presión y mandamos la fase móvil nuevamente hacia la columna, tenemos un aumento de la presión. Esto lo que nos da es que tengamos dos estados mientras estamos rellenando y mientras estamos bombeando, en los cuales las presiones van oscilando. Nosotros lo que queremos también es que la presión se mantenga lo más constante posible, sí, no tener pulsos de presión. Entonces, esto es un problema que no podemos evitar con este tipo de bombas, las oscilaciones de presión, que no lo tendríamos con una bomba de jeringa.

Otros problemas que podemos tener, como yo les decía, las suciedades y las partículas que puedan estar en las válvulas, que eso puede traer problemas de flujo, principalmente. Pero es importante que recuerden el asunto de que como tenemos dos posiciones, podemos tener problemas de presión. Ahora, si tenemos estos problemas de presión con estas dos posiciones, ¿cómo los podemos solucionar? Una de las opciones más sencillas es simplemente trabajar con un sistema de doble pistón. Esto que estamos viendo acá es un esquema, un sistema en paralelo de doble pistón, en el cual tenemos nuevamente una leva que, mientras empuja uno de los pistones, hace que el segundo pistón venga hacia ella. Entonces, mientras uno está bombeando fase móvil hacia el sistema, el segundo pistón está recargando la cámara. Funciona exactamente igual que como el que vimos primero, pero solamente que lo estamos haciendo en simultáneo.

¿Para qué nos sirve trabajarlo de esta manera? Al trabajarlo simultáneo, mientras un pistón está recargando, que nosotros teníamos la baja de presión, el otro pistón está bombeando, que eso produce una suba de presión. Eso lo que nos ayuda es a regular de cierta manera esas fluctuaciones de presión que teníamos con el sistema de un único pistón. Pero tiene ciertas complicaciones: uno, tenemos cuatro válvulas y recién habíamos dicho que las válvulas son zonas de, digamos, críticas dentro de la bomba, son zonas que son muy susceptibles a tener fallas que se pueden tratar de arreglar, superar, pero pueden dar problemas de flujo, pueden dar problemas de cualquier tipo. Una cosa interesante que, en realidad, las válvulas se pueden limpiar fácilmente. Las válvulas esas se ensucian naturalmente, uno puede retirarlas, se pueden sonicarr en algún disolvente apropiado, como isopropanol, y eso nos permite limpiar las válvulas y hacer que vuelvan a funcionar correctamente. Sin embargo, eso toma un tiempito en hacerlo y uno intenta que las válvulas, en general, estén lo mejor posible. Por eso, si tenemos muchas válvulas, estamos aumentando la probabilidad de tener problemas con nuestro equipo. Y el otro asunto que tenemos es que con este sistema de doble pistón tampoco se compensa completamente las fluctuaciones de la presión.

Es así que se desarrolló un sistema de doble pistón que fuera un poco más eficiente, que es el sistema de doble pistón en línea. El sistema doble pistón en línea es básicamente como este esquema que se ve acá. En el mismo tenemos dos pistones que, en vez de estar en paralelo, están en línea, pero la salvedad es que, si ustedes se fijan, el primer pistón, el pistón B, es muy parecido al pistón que nosotros vimos en el sistema de un único pistón. Tiene las dos válvulas, una por encima, hay una por debajo, y después eso comunica al pistón A. La diferencia grande que tenemos acá son los volúmenes. El pistón A y el pistón B tienen distintos, bueno, las cámaras tienen distintos volúmenes. Entonces, lo que significa es que el pistón B, digamos, la cámara del pistón B tiene un volumen más grande que la cámara del pistón A. ¿Y por qué es esto? Bien, si ustedes imaginan que, por ejemplo, el pistón B tiene la siguiente función: el pistón B, cuando se retrotrae, cierra esta válvula de aquí, abre la válvula de abajo y llena la cámara de fase móvil. Mientras el pistón B está retrocediendo, A se mueve hacia dentro, empuja la fase móvil en la cual está cargado y mantiene la presión constante dentro del sistema, mantiene un flujo de la fase móvil. Ahora, cuando el pistón B empieza a volver, cierra la válvula de entrada de la fase móvil, abre la válvula que conecta con el pistón A y lo que hace es, primero, recarga el pistón A para que el pistón A pueda, en el siguiente ciclo, descargar sobre el equipo. Pero a su vez, lo que hace es, como tiene un volumen mucho más grande, está mandando el excedente de fase móvil directamente hacia la columna. Eso lo que nos hace es, nos permite tener un flujo mucho más constante. B cumple la función de recargar a y a su vez bombear fase móvil. Entonces, tenemos constante el bombeo entre los dos. Una de las ventajas importantes, tenemos la mitad de válvulas que en el sistema que mostramos anterior, por consiguiente, eso es un poco mejor porque tenemos menos puntos en los cuales podemos estar fallando.

Si ustedes miran acá, más o menos cómo son las oscilaciones de presión en la parte de arriba, tenemos un pistón simple. Okay, este pistón simple tenemos entonces el momento en el que está bombeando y el momento que está recargando. Cuando está bombeando, la presión es máxima; cuando está recargando, la presión es mínima y tiene un movimiento así de tipo sinusoidal. Cuando nosotros tenemos una leva redonda, la leva redonda produce un movimiento de un pistón de este estilo, con este tipo de curva y da este tipo de movimiento. Una de las opciones también que tenemos para trabajar es cambiar la forma de la leva. Si nosotros cambiamos la forma de la leva a este tipo de leva, lo que producimos es un incremento mucho más gradual y un decremento mucho más rápido, dando un movimiento de este estilo para la presión, lo cual es más aceptable, ya que está durante más tiempo constante. Si bien las caídas son también grandes, cuando trabaja, bajamos en un sistema doble pistón, lo que tenemos son dos veces esta onda, pero en diferente, está movida la frecuencia. Lo que tenemos es que las dos ondas estas se van a ir cancelando una con la otra, pero obtenemos un movimiento de este estilo. Seguimos teniendo pulsos, pero son bastante menores.

Ahora, otra de las cosas que se puede hacer es que, una vez si no tiene un sistema de este estilo con la leva optimizada, es agregarle un damper, un amortiguador. Y entonces, agregando un damper, podemos llegar a mejorarla a tener este estilo de sistemas de pulsos en las presiones. Si ustedes hacen, como les dice acá, se acercan mucho hacia la línea de base del cromatograma, pueden llegar a ver los pulsos de la bomba, particularmente cuando los pulsos están generando un movimiento bastante marcado.

Bien, ahora vamos a tratar de explicar simplemente qué es un damper o un amortiguador y cómo es que funciona. Los dampers, básicamente, lo que hacen es tratar de amortiguar esos efectos de las variaciones de presión dentro del equipo. O sea, frenan un poco la fase móvil cuando hay mucha presión y liberan un poquito de esa presión que amortiguó en un primer momento cuando la presión desciende en los pulsos de la bomba. Y los dampers vienen básicamente en dos formas: en una forma de tipo resorte, como el que vemos a la izquierda, en el cual ese resorte lo que hace es hace un paso de fase móvil y cuando la fase móvil llega con mucha presión, eso de cierta forma se contrae y amortigua a la fase móvil para que cuando la presión disminuye porque el pulso natural de la bomba, ese resorte, digamos, se vuelve a estirar y libera ese exceso de fuerza, controlando de cierta manera la presión. Los dampers, igualmente, los más usados son los dampers de membrana, que es los que vemos en el lado derecho. Este damper de membrana lo que tienen es una membrana que está aquí, que separa un fluido que está de este lado de la cámara donde está la fase móvil. Por este lado tenemos el ingreso de la fase móvil y por este lado tenemos la salida. ¿Qué es lo que sucede? Cuando ingresa la fase móvil con una presión un poco más alta, este fluido que está aquí se comprime y al comprimirse genera, alena una cierta cantidad de energía. Cuando disminuye la presión en esta cámara, porque estamos en el pulso más bajo de la presión, libera la presión esa y mantiene en la salida una presión cuasi constante. Eso lo que nos da es una mejora bastante grande con respecto a los pulsos de la presión.

Ahora vamos a hablar un poco de las fases móviles en general, de las que tenemos para usar. Eh, cosas interesantes de las fases móviles que tiene, tienen que tener claras las fases móviles que ustedes vayan a usar. Los disolventes que vayan a utilizar siempre tienen que ser solventes puros de calidad HPLC o espectroscópica. Hoy en día, los disolventes de calidad HPLC no tienen un costo tan alto, son fácilmente asequibles, están por todos lados, todos los proveedores tienen y son solventes de una calidad muy aceptable porque son muy limpios para trabajar con los detectores, están sumamente filtrados, por lo cual no tienen partícula ni nada y se pueden usar directamente en los equipos. Si ustedes van a utilizar buffers, soluciones salinas dentro del equipo, es importante que estén recién preparados y que no tengan partículas, o sea, que hay que filtrarlos para remover las partículas. Y el que estén recién preparados es importante porque las soluciones acuosas salinas tienden a ser un buen caldo para generar bacterias, hongos, algas, que eso va siempre a complicar dentro del equipo, sí. Y después, que cuando ustedes vayan a preparar la mezcla previamente a introducirla en el equipo, tengan en cuenta que las mezclas volumen en volumen las tienen que preparar siempre midiendo cada uno de los disolventes independientemente. ¿Por qué? Bueno, particularmente para los disolventes más polares, la contracción de volumen al agregar dos volúmenes es bastante visible. Ustedes, si mezclan agua con metanol, van a tener una contracción de volumen que les puede llegar a afectar en lo que ustedes están tratando de medir. Si miden todo en un mismo recipiente, no se puede agregar medio litro de agua y después llevar a 1 litro y pretender que esa mezcla sea de repente 50/50. Se miden 500 y 500 y tenemos el litro.

Para el filtrado de las muestras, bueno, es importante porque hay que eliminar todas las partículas. Sí, tengan en cuenta que todos los equipos de HPLC tienen una serie de filtros por todo el equipo. Hay filtros en la toma de la fase móvil, hay filtros en la entrada de la bomba, hay filtros en la salida de la bomba, hay filtros en la entrada de la columna. El equipo está lleno de filtros, pero esos filtros se pueden ir tapando también. Nosotros, eliminando las partículas, nos aseguramos de que no estamos bloqueando esos filtros, sino eventualmente no vamos a poder bombear más fase móvil y también nos aseguramos que las válvulas tengan un buen funcionamiento, que los pistones se mantengan en condiciones, los sellos no se estropeen y que las columnas no queden tapadas.

El filtrado se hace básicamente con membranas filtrantes, muy parecida a las membranas esterilizantes que se usaban en micro, pero sin ser estériles. En general, de un tamaño de poro de 0,22 micras, 0,45 micras. Son básicamente iguales, que pueden ser de distintos materiales, como ser teflón, nylon, celulosa, acetato de celulosa, nitrato de celulosa. Eh, particularmente, tengan en cuenta que ustedes pueden comprar cualquiera de ellas, pero la membrana que vayan a usar tiene que tener un material compatible con los disolventes que vayan a filtrar. En general, el teflón y la celulosa reconstituida soportan prácticamente todos los disolventes, pero el teflón es más hidrofóbico y la celulosa es mucho más hidrofílica. Y por otro lado, hay algunos de los materiales que se utilizan para hacer membranas que se solubilizan en algunas fases móviles, así que tienen que tener cuidado con eso. Sí, acá a la derecha, lo que tenemos es el sistema clásico de filtrado para HPLC, en el cual tenemos un vaso en el cual se agrega la fase móvil a filtrar, tenemos un recipiente contenedor en la parte baja en donde va a ir recuperando toda la fase móvil y por aquí tenemos una salida que se conecta al vacío. Tengan en cuenta que todo este equipamiento tiene que ser apto para trabajar a vacío. Se conecta a vacío y eso ayuda a que filtre. Aquí, entre medio del vaso y una placa filtrante como esta que vemos acá, y por ahí es donde se está filtrando la fase.

Bien, ahora vamos a hablar de un tema que habíamos discutido en la clase dos, en la de principios de cromatografía, que es el problema general de ilusión. Ustedes imagínense este cromatograma que vemos acá, en el cual tenemos cuatro picos en el principio, en los cuales tienen una resolución bastante buena y salen en unos tiempos bastante decorosos. Sin embargo, tenemos dos picos que salen en los 32 minutos y en los 40 minutos, que son picos que no tienen una forma aceptable y están bastante retenidos. Y a su vez, entre los 11 minutos y los 30 minutos, no está pasando absolutamente nada dentro de nuestro cromatograma, por lo cual estamos perdiendo mucho tiempo y fase móvil. Esto cuando lo estamos trabajando en condiciones isocrática e isotérmicas, manteniendo constante la fase móvil y la temperatura.

Ahora, analicemos bien esos picos en los cuales tenemos unas posibilidades como de mejora. Si nosotros aumentáramos, hacer que los últimos dos picos se acerquen y salgan más rápido, pero perderíamos la resolución entre los primeros picos y puede ser que esos picos se superpongan unos con los otros. Entonces, tenemos que tratar de hacer algo más para tratar de solucionar esa situación. Entonces, en estos casos es donde nos vemos en la necesidad de utilizar un sistema con gradiente. ¿Qué es un gradiente? Bien, vamos a tratar de hablar un poquito de los dos sistemas: sistema isocrático, que es el que les mostraba recién, y un sistema con gradiente.

¿Qué es un sistema isocrático? Un sistema isocrático es cuando la fase móvil es constante. En contraposición, el sistema de gradientes es cuando la fase móvil no es constante. Pero ahora vamos a hablar un poquito más de cómo va a cambiar esa composición. Isocrático, les decía, que la composición de la fase móvil es constante. Si ustedes miran la gráfica de la derecha, en el cual tenemos en la parte en rojo, es un sistema isocrático. Básicamente, tenemos un solvente B que empieza la corrida con 10% del mismo y sigue hasta el final de la corrida, siempre en un 10% del solvente B, un 90% de un componente A. Vamos a suponer que nuestro componente B es el disolvente más fuerte para esa determinada fase estacionaria. Este tipo de sistemas es el sistema óptimo para trabajar en separaciones simples, sí, porque se obtiene una muy buena resolución y, en general, se obtienen tiempos cortos de corrida.

Ahora, si nos encontramos en una situación como la anterior, en la cual perdemos mucho tiempo en realidad, porque tenemos unos picos que quedan muy retenidos con respecto a la otra serie de picos, bueno, una de las opciones, yo les decía, es podemos utilizar un sistema con gradiente. Un gradiente es cuando tenemos una fase móvil que incrementa la fuerza de la misma con el tiempo. Si yo les decía que imaginemos que el componente B es el disolvente que tiene la mayor fuerza alotrópica de los dos disolventes, o sea, que aumentar el disolvente B en la mezcla nos va a hacer que todo los analitos, todo lo que tengamos en esa mezcla, eluya más rápido. Sí, es importante que quede esto claro, porque cuando uno hace un gradiente, siempre incrementa el disolvente de la mayor fuerza alotrópica, el que hace que todo salga más rápido y no al revés. Lo que nosotros tratamos de hacer entonces en el sistema con gradiente es aumentar gradualmente la cantidad del disolvente más fuerte en el tiempo. Entonces, cuando empezamos, empezamos con una fuerza alotrópica relativamente baja, pero cuando terminamos, nuestra fase móvil tiene una capacidad de sacar los analitos mucho más grande. Estos sistemas son mejores para mezclas complejas, mezclas como las que vimos en el caso anterior. Particularmente, disminuye la resolución porque al acelerar la elusión de los picos, hace que los picos se junten más y, por consiguiente, el tiempo entre los picos es más bajo. Pero hay una salvedad: esos picos también, al acelerarse tanto, muchas veces se afinan y si se afinan lo suficiente, como la resolución considera el ancho del pico y el tiempo entre los dos picos consecutivos, puede llegar a aumentar la resolución. Y en general, lo más común son los gradientes lineales, que es lo que tenemos acá en la curva azul. Tenemos un gradiente que crece en una forma lineal, pero podemos hacer gradientes de otros tipos y vamos a ver por qué podemos hacer eso.

Bien, primero que nada, es cómo se hace un gradiente en un equipo cualquiera. Básicamente, lo que uno le tiene que indicar al equipo son los puntos y después el equipo lo que va a hacer va a unir esos puntos. Entonces, si nosotros queremos hacer un gradiente lineal, le indicamos la concentración con la cual queremos iniciar. Por ejemplo, le decimos al equipo que queremos empezar en el tiempo cero con una concentración de 10% de nuestro componente B y queremos terminar nuestra corrida a los 20 minutos con un 100%, y lo marcamos ese otro punto acá arriba. Al marcar estos dos puntos, el equipo inmediatamente va a trazar una línea con eso y lo que va a hacer es va a ir, digamos, modificando eso gradualmente durante toda la corrida y la composición va a ir cambiando gradualmente durante toda la corrida.

Otra opción es no hacer un gradiente lineal, ya hacer un gradiente que se llama escalonado. Un gradiente escalonado tiene esta forma. Supongamos que en algún caso nosotros queremos mantener durante un primer, los primeros 5 minutos de nuestra corrida, la corrida en las condiciones iniciales, mantener condiciones isocráticas, pero después de eso podemos aumentar, hacer un pequeño gradiente entre los 5 minutos y los 10 minutos y cambiar, como les muestra acá, de un 30% a un 50% la composición. Una vez que llegamos a los 10 minutos, podemos nuevamente mantener nuestro sistema en forma isocrática a 50% y luego de eso, en los últimos 5 minutos, aumentarlo desde 50 hasta 100%. Esto es lo que se llama un gradiente escalonado y nos permite a nosotros ir separando, de repente, series de compuestos que de otra forma se podrían juntar.

Ahora, ¿para qué nos sirve trabajar en el caso de arriba con un gradiente lineal o un gradiente escalonado que parece ser más complejo a priori? Bueno, vamos a ver, por ejemplo, este caso. En este caso, tenemos en un principio, tenemos cinco picos acá mayoritarios que tienen una buena resolución. Esta corrida que tenemos acá es isocrática, pero tenemos dos picos al final que están muy separados entre sí y nos queda mucho tiempo perdido dentro de esta corrida. En este es un caso en el cual un gradiente lineal sería óptimo, porque acá estamos manteniendo nuestras condiciones isocráticas y luego aumentamos rápido la concentración de nuestro solvente con mayor fuerza alotrópica en la mezcla y luego lo mantenemos constante hasta terminar de sacar todo. Eso lo que nos va a hacer es que el este pico de acá, el de 6 minutos con 6, y este otro, 13 minutos, van a eluir mucho más rápido y no va a ser más corto el tiempo de la corrida.

Una cosa que no les comenté, en realidad, con los gradientes es que tienen otro problema y es que una vez que nosotros terminamos la corrida, nosotros empezamos la corrida en esta composición, pero la terminamos esta. Por consiguiente, tenemos que volver a las condiciones iniciales y esperar a que el sistema se estabilice de vuelta, por lo cual siempre tenemos un tiempo perdido que es el tiempo de estabilización de la corrida. Pero supónganse que en otro caso tenemos este sistema, el cual tenemos nuestros cinco picos que salen bien resueltos y no los podemos acelerar más porque perderíamos la resolución, y ah, tenemos este acá, este pico aquí en el medio y otro pico más aquí al final. Si nosotros aceleramos linealmente todo esto como lo hicimos la otra vez, capaz que tenemos posibilidad de que estos dos picos se junten y este otro también quedaría muy. Entonces, una de las opciones que podemos hacer aquí es hacer un gradiente lineal en el cual mantenemos un, perdón, gradiente escalonado en el cual tenemos un sistema isocrático para poder sacar nuestros primeros cinco componentes, luego aumentamos la fase móvil para poder sacar estos otros tres componentes que tenemos acá, pero que se sigan resolviendo entre ellos, y luego hacer otro escalonado más grande acá arriba para poder traer más cerca del último pico. Quizás, si nosotros lo lleváramos hasta la concentración más alta en un primer momento, perderíamos la resolución en estos tres picos que tenemos en el medio.

Bien, ahora cuando nosotros queremos hacer un gradiente, nos vemos forzados a mezclar las distintas fases móviles e ir cambiando esa composición a lo largo de toda la corrida. Y al mezclar fases móviles, siempre nos vamos a encontrar con una serie de problemas, entre ellos, vamos a tener formación de burbujas, controlar la homogeneidad del mezclado, ya que si no tenemos la fase móvil bien mezclada, vamos a tener mucho ruido en la línea de base. Y otra cosa que es importante es la precipitación salina. Cuando tenemos soluciones de baja, ustedes tengan en cuenta, cuando ustedes tienen una solución acuosa salina, uno la mira y está totalmente disuelto, pero si nosotros le empezamos a agregar una cantidad de un solvente orgánico, por ejemplo, acetonitrilo, al empezar a agregar acetonitrilo, la solubilidad de esa sal va a ir disminuyendo y podemos llegar hasta un punto en el cual la cantidad de acetonitrilo es tan grande en la mezcla que la sal no es más soluble y por lo cual empieza a precipitar. Si esa precipitación ocurre dentro del equipo, es un problema muy grande porque se empiezan a formar cristales que no son solubles en la fase móvil adentro del equipo y eso puede generar ralladuras en los pistones y otra serie de problemas. Hay que tener mucho cuidado en eso. Como les dice acá, ojo con los buffers salinos. Si ustedes van a hacer un gradiente y trabajar con un buffer salino, siempre corroboren que no precipita en la concentración más alta del modificador orgánico de la que vayan a usar. Traten de, como línea general, nunca lleguen a un 100% de modificador orgánico si ustedes están usando un buffer salino.

Bien, ¿cómo hacemos con los otros temas para eliminar la formación de burbujas? La mejor opción es el desgasificado. Todos los disolventes tienen un montón de gases que están disueltos en los mismos, particularmente los disolventes polares. Si esos gases se empiezan a liberar dentro del equipo, se entran a formar burbujas. Las burbujas en sí no tienen una viscosidad, porque los gases no tienen una viscosidad que sea apreciable, entonces no van a generar problemas en el sistema, fluyen a través de él, pero lo que van a hacer es se van a ir mezclando en la fase móvil y al llegar al detector van a dar señales que pueden ser extrañas dentro de eso y no van a tener nada que ver con las muestras. Es un problema simplemente de que están pasando burbujas. Entonces, es imprescindible desgasificar las fases móviles para usar los gradientes. Y tenemos dos opciones para desgasificar las fases móviles. La primera es el tratamiento en línea, es utilizar un sistema desgasificador dentro del mismo equipo, que ahora lo vamos a ver. Y la otra son los tratamientos previos de las fases móviles que le podemos hacer a la fase móvil o a cualquiera de los disolventes puros. La primera es tratamiento al vacío. Simplemente, cuando uno está filtrando, por ejemplo, filtrando el buffer por membrana, si uno lo mantiene durante 5 minutos después de que trató de terminó de filtrar, eso en sí ya es bastante práctico para desairear esa fase móvil, le sacamos la mayoría de los gases que están disueltos. La otra opción es el calentamiento, ebullición. El calentar, ebullir esos gases que están disueltos, cambia la solubilidad de los gases y en general disminuye, y eso hace que esos gases se vayan y la solución queda desgasificada por un tiempo. Y la otra es utilizar un baño de ultrasonido. Los baños de ultrasonido son muy efectivos para desgasificar disolventes.

Y ahora vamos a ver un poco el en línea. Son muy populares hoy en día, particularmente para lo que vamos a ver ahora, que son los mezclados a baja presión. El desgasificador en línea lo que es es un sistema que tiene la entrada por un lado de todos los canales de fase móvil, o sea, la fase móvil ingresa por un lado, sí, y por el otro lado sale y va directamente hacia la bomba. Dentro lo que tenemos es una cámara de vacío en donde tenemos unos conductos que son selectivamente permeables para los gases. Entonces, al pasar nuestra fase móvil por adentro, los gases esos empiezan a desprenderse, salen los disolventes, permean a través de esa membrana y los podemos eliminar pasando de largo nuestra fase móvil.

Bien, ahora vamos a hablar un poquito de los sistemas de gradiente. ¿Cómo hacemos para mezclar estos disolventes? Porque para hacer un gradiente, nosotros tenemos que mezclar nuestros disolventes dentro del equipo e ir cambiando esa composición constantemente durante la corrida. Tenemos dos opciones básicas. La primera es el mezclado a baja presión y, en contraposición, tenemos el mezclado a alta presión. Los dos tienen ventajas y desventajas. En el caso del mezclado a baja presión, una de las ventajas que tenemos es que trabajamos con una única bomba, sí, y el mezclado se da fuera de la bomba, antes de ingresar. Aquí, esto que tenemos acá es una válvula solenoide que lo que hace es tomar una cantidad del disolvente A y una cantidad del disolvente B y mezclarlos antes de pasarlos a la bomba. Bien, eso es un sistema bastante práctico. En general, la mayoría de las válvulas solenoides que conozco yo, por lo menos, contienen este cuatro canales, nos permite trabajar con mezclas ternarias inclusive y son bastante prácticos en este sistema. Pero tenemos un pequeño problema: el mezclado a baja presión produce mucha cantidad de burbujas. Entonces, para trabajar en un mezclado a baja presión, necesitamos sí o sí tener un desgasificador, porque al mezclar estos distintos gases a baja presión se van a formar burbujas necesariamente.

Ahora, el mezclado a alta presión tiene la dificultad de que necesitamos un sistema de dos bombas. Necesitamos una bomba para cada uno de los disolventes que va a tomar directamente cada disolvente y lo va a bombear hacia un mezclador y ahí generamos el mezclado a alta presión. La ventaja en este caso es que al tener el mezclado a alta presión y al estar tratando de mezclar todos los disolventes a tan alta presión, no se pueden formar burbujas, porque para que se pueda formar una burbuja, eso tiene que liberar una cierta cantidad de gas y esa burbuja de gas no se puede formar a una presión tan alta. Entonces, lo que va a pasar es que, por más de que haya un poco de

Gases y que intenten liberarse no van a poder hacerlo dentro de ese sistema tan presurizado. Sí, como yo les contaba, eh, básicamente en el sistema de baja presión lo que tenemos es una válvula solenoide que es lo que vemos acá. Esta válvula solenoide lo que va a ir haciendo va a ir tomando, eh, cada uno de los disolventes dependiendo de la mezcla que nosotros queremos hacer. Como se lo marque la bomba, lo que va a pasar es que si uno le dictamina a la válvula que queremos un 50% de este y 50% del otro disolvente, va a ir tomando cada uno porque esa válvula tiene distintas aperturas en este lado y en este otro. Entonces, abre esta durante una cierta cantidad de tiempo y abre esta por la misma cantidad de tiempo. Como la bomba está bombeando constantemente a un flujo que uno lo puede determinar, dependiendo cuánto tiempo está abierta cada una de las válvulas es cuánto va a tomar de cada uno de los disolventes. Acuérdense que cuando se trabaja en un sistema de mezclado a baja presión es importante tener un desgasificador antes de la válvula.

Ahora, cuando tenemos un sistema de mezclado a alta presión, ya habíamos dicho que no era tan necesario trabajar con un desgasificador. Sí, acá nuevamente tenemos una bomba y otra bomba, cada una de las bombas mandando el disolvente hacia un mezclador. Y si hacemos básicamente un acercamiento, lo que vemos es esto que tenemos acá, en donde tenemos el ingreso de una de las bombas, el ingreso de la otra bomba. Esta es la salida y aquí en el medio lo que tenemos es un mezclador, que es esto que tenemos acá. El mezclador lo que hace es producir una turbulencia entre las dos entradas de las dos fases móviles para poder hacer una mezcla más, este, homogénea que después vaya hacia el sistema de la del inyector y la columna.

Bien, los mezcladores que yo les acabo de comentar ahora en el sistema de alta presión son una parte muy importante de los equipos. ¿Y por qué? Si ustedes lo miran acá, en la parte A tenemos un sistema de baja presión y en la parte B un sistema de alta presión. En los dos tenemos los los disolventes, llegan hasta hasta la válvula, se mezclan, llegamos a la bomba y se bombean. Pero como yo les contaba, el funcionamiento de la válvula solenoide en el sistema de baja presión primero abre para un canal y después abre para el otro. Por consiguiente, lo que está entrando son un poco de un disolvente y después el otro del otro disolvente. Esos dos van a ir moviéndose y si bien se van a ir mezclando, si uno analiza la mezcla, tenemos primero esto: un solvente magenta, solvente cian, solvente magenta, solvente cian, solvente magenta y solvente cian. Probablemente estén un poquito más mezclados que estos porque son miscibles entre sí, pero vamos a tener como etapas de cada uno de los disolventes. El mezclador lo que hace es homogeneizar esa fase móvil para que realmente sea una mezcla homogénea.

Okay, en el caso de dos bombas también podemos llegar a tener este tipo de situaciones en el cual tenemos este los dos no completamente mezclados, sino tenemos un sistema, un mezclador que nos permita dar una buena mezcla. Bien, acá tenemos simplemente un un detalle de cada una de las bombas. Esto que vemos acá es un sistema de bombas de mezclado a baja presión. Lo que podemos ver acá, esta es la válvula solenoide que si ustedes se fijan tiene cuatro canales de ingreso y un canalcito de salida que va hacia el cabezal de la bomba o dónde están los pistones. Los pistones estarían aquí adentro. Lo que hace es va tomando cada uno de los disolventes, sí, a medida que vayan pasando y después los va mandando hacia la bomba para que la bomba los bombee.

En este otro caso tenemos, en contraposición, el sistema de dos bombas, sí, en el cual tenemos las dos bombas que son iguales, cada una toma una fase móvil particular y las va a bombear hacia acá, que es donde está el mezclador. En este caso, acá tenemos este un acercamiento del del sistema de del cabezal de la bomba, sí, cada uno de los pistones está en uno de estos de estos acá. Y acá tenemos un acercamiento del mezclador, que era esto que veíamos en el citó, que muy acercado no está realmente, pero está ahí, lo pueden ver.

Bueno, ahora vamos a comparar un poquito los dos sistemas: el sistema de baja presión versus el sistema de alta presión. Ventaja: bueno, el sistema de baja presión, como yo les decía, podemos trabajar con una única bomba y trabajar con un sistema de cuatro reservorios. Eso es sumamente práctico, particularmente cuando queremos hacer mezclas más complejas, sin contar con que la bomba es una parte cara del equipo y comprar una única bomba siempre va a ser mejor. La desventaja es imprescindible tener un desgasificador. Tenemos que tener un desgasificador en línea, pero igual en los costos sigue saliendo más económico tener este tipo de sistema. Por lo cual, menor costo y está sobrado y son bastante buenas para las separaciones estándar, sí, para las cosas comunes que hay, son sumamente buenas.

El sistema de alta presión nos requiere tener dos bombas, sí, y vamos a tener que mezclar este dos reservorios únicamente y no podemos trabajar con más cantidad. El desgasificador no va a ser imprescindible, sí, es bueno siempre desgasificar las fases móviles, pero no necesitamos un desgasificador. Particularmente una de las ventajas que tienen es que tienen un menor volumen de demora al hacer un gradiente, que es lo que pasa. O sea, ustedes no se olviden que cuando ustedes se ponen a hacer un gradiente, el gradiente en realidad lo que hace es darle la orden a la bomba, por consiguiente la bomba va a empezar a bombear, pero todavía hay que llegar desde la bomba hasta el final del equipo. En los casos cuando tiene un sistema de dos bombas, el volumen en el cual se está trabajando es menor y el mezclado es más eficiente, por eso es mucho mejor para cuando se trabaja con gradientes en flujos muy bajos.

Ahora vamos a hablar un poquito sobre las conexiones que van a mantener en el equipo, porque nosotros decíamos que teníamos distintos módulos en el equipo, teníamos el módulo de la bomba, teníamos el módulo del, tenemos el módulo de la columna, pero todos esos módulos tienen que estar conectados y la fase móvil tiene que ir desde uno al otro y todo el equipo va a tener que tener tubuladuras para eso. ¿Cómo van a ser esas tubuladuras y cómo van a hacer las conexiones? Bueno, tenemos en general dos tipos de de tubuladura básica. El primero es la la cañería de acero. El acero 316 es una de las más usadas, particularmente para las partes que son fijas del equipo. ¿Por qué? Porque es mucho más resistente. Si bien no se puede trabajar con pH menores de dos, no se puede trabajar con ácidos halogenados, eso siempre es un problema, porque porque claro, son metales y no no resisten este tipo de condiciones, pero son mucho más resistentes a todas las demás cosas, a la temperatura, los disolventes orgánicos. Otra este contrariedad que tiene es que las balonas, que es esta parte que tenemos acá, esa balona una vez que se fija, no la podemos mover más y no la podemos reajustar. En por consiguiente, una vez que uno ajusta una cañería o una conexión, digamos, de acero a una posición, eh, no la podemos poner en cualquier otro lado. En general, cuando uno ajusta una pieza de acero, esa pieza va a tener que quedar en ese lugar, no porque no se pueda remover la cañería, la cañería se puede remover, pero probablemente no ajuste bien en otro lado. Sí, por eso les les decía, son las favoritas siempre para trabajar en las partes que van a quedar fijas y no vamos a andar intercambiando piezas, sí, no son intercambiables, como les dice acá. Y otra cosa importante que tienen es que requieren un ajuste con herramientas, siempre está este tipo de de conexiones se ajustan con una llave.

Por otro lado, tenemos las conexiones de plástico. Las conexiones de PEEK. El PEEK es un plástico bastante más más flexible, eh, permite otro tipo de de manipulación mucho más práctica a veces que la cañería de acero, pero tiene sus contraindicaciones. Tiene una temperatura máxima de trabajo de 100 grados Celsius. No es que vayan a trabajar siempre con 100 grados Celsius, es bastante poco probable que trabajen un HPLC a 100 grados, pero ténganlo en cuenta. Y son incompatibles con varios disolventes que, si bien no son los más usados, se usan como el THF, dimetil sulfóxido, solventes clorados. Esos disolventes no se pueden trabajar. Bueno, no es que no se puedan trabajar, no se pueden trabajar en concentraciones altas. En general, con concentraciones menores a un 30% de esos disolventes se puede llegar a trabajar con el PEEK sin problemas. Más de eso empiezan a afectar los plásticos. Son frágiles, sí, entre comillas, pero son flexibles y eso es una ventaja muy buena. Y la otra es que el ajuste es manual y como el ajuste es manual, nos permite a nosotros ajustarlo y desajustarlo constantemente para cada caso. Eso es super práctico al momento de estar poniendo y sacando de repente columnas, que es lo que uno cambia más en un equipo. Otra salvedad que tienen es que en general soportan presiones de hasta 400 bares. Más de eso el PEEK no soporta, lo cual no sería un problema cuando trabajamos en HPLC, pero cuando empezamos a trabajar en UPLC o en UHPLC, ahí sí empezamos a tener problemas porque estamos por presiones por arriba de los 400 bares y ahí estamos restringidos al uso de acero.

Ahora vamos a hablar un poquito de la inyección de la muestra. La inyección de la muestra es sumamente importante en los equipos de HPLC y una de las ventajas más grandes que tenemos son el tipo de inyectores que trabajamos. Los inyectores los podemos separar entre inyectores manuales y automáticos. Si bien el funcionamiento de los dos es básicamente el mismo en el inyector en sí, en el inyector manual, que es el inyector de tipo Rheodyne, que es el que vemos acá en las fotos, lo que tenemos es un sistema de dos plaquitas que son estas que vemos acá. Esas se juntan una sobre la otra. El inyector tiene dos posiciones, okay, una posición de inyección y una posición de carga. Lo que nos permiten estas dos cosas es a nosotros trabajar y hacer la inyección independientemente de la presión del equipo. Ustedes no se olviden que de repente ustedes están trabajando a una presión de 100 bares, 200 bares, 300 bares, hasta 400 bares. HPLC es una presión bastante alta, no está bueno que ustedes estén tratando de inyectar sobre ese sistema tan presurizado. Y el, digamos, el centro de la parte de este inyector es lo que se llama el loop, que es esto que vemos acá. El loop es un cañito graduado únicamente que este que les marca acá dice 20 microlitros, pero técnicamente van de 5 a 25 microlitros. Si bien hay de otros tamaños, esto es para casos analíticos.

¿Cómo es que funciona el inyector de tipo Rheodyne? Básicamente, lo que nosotros tenemos es un esquema de este estilo en el cual tenemos cinco agujeritos acá: agujero uno, dos, tres, cuatro, cinco y seis, que se conectan a través de dos canales que son este y este. En este sector acá, lo que tenemos es la fase móvil que viene desde la bomba, pasa por el punto tres, el canal punto cuatro y va directamente hacia la columna. En el punto central acá es donde viene la inyección de la muestra y la inyección de la muestra va a venir por acá y va a rellenar esto que está acá fuera, que no es otra cosa que el loop. Sí, cuando nosotros inyectamos nuestra muestra, tenemos la fase móvil sigue circulando por este mismo circuito, no hay ningún cambio, solamente que ahora inyectamos nuestra muestra, que es esto anaranjado, inyectamos la muestra, rellenamos el loop y el excedente de la muestra sale a un descarte y se pierde. Eso no nos importa. ¿Qué es lo que pasa cuando nosotros giramos el loop de la posición de carga a la posición de inyección? Lo que hacemos es girar este canal que estaba unido entre seis y cinco, pasa a estar unido entre cinco y cuatro, y el que estaba unido entre tres y cuatro, pasa a estar unido entre dos y tres. ¿Qué cambió esto? Cambió que el flujo que venía ahora de la bomba, en vez de ir directamente hacia la columna, pasa antes por el loop y al pasar por el loop va a arrastrar toda la muestra que nosotros inyectamos y la va a llevar hacia la columna. Ahí quedan abiertos el puerto de inyección, sí, y el canal quedan todos hacia un descarte. De esta manera, nosotros podemos inyectar mientras que toda la inyección está a baja presión, o sea, que no tenemos nunca contacto con la presión del equipo y después al cambiar a la posición de inyección, nuestra muestra se arrastra completamente hacia la columna.

Es importante que tengan en cuenta de que siempre hay que cargar ese loop si queremos estar seguros un poco más. O sea, si el loop es de 20 microlitros, siempre hay que inyectar un poquito más de muestra. Inyecten 40, 100 microlitros cuando tienen muestras analíticas. Generalmente tienen bastante más de lo que lo que tienen que poner en el loop.

Condiciones que tenemos que tener en las jeringas para utilizar en en los inyectores manuales: es importante el largo y el diámetro de de la aguja, porque si la aguja tiene un largo o un diámetro que no calce dentro del inyector perfectamente, podemos tener pérdidas. Este tiene que tener un diámetro interno pequeño para no retener demasiada muestra y importantísimo que la punta sea roma. Punta roma es un corte a 90 grados, es una punta totalmente plana, que se difiere del biselado o de la punta, este, la punta de aguja, que son las que se usan en otros sistemas. La punta roma es porque si no, cualquier otro tipo de aguja puede dañar los sellos del inyector. Y como les dice ahí, el volumen de la de la jeringa tiene que ser por lo menos dos veces el volumen del loop, sí, o sea, en general, traten que la aguja, la jeringa, perdón, sea grande, más grande que el volumen que ustedes van a inyectar. Si ustedes tienen un loop de 20 microlitros, una jeringa de 100 microlitros es perfecta para ese tipo de situaciones.

El caso de los inyectores automáticos, bueno, no se olviden de como vimos recién, todo el sistema de loop, porque es muy parecido todo eso. El sistema tiene dos posiciones de inyección y todo lo demás, pero tiene distintas cosas. Bueno, el inyector es automático, obviamente, tiene un rack para poner los distintos viales, que son como estos que vemos aquí, aquí, acá, tenemos todos una serie de viales con tapitas de colores con muestras coloridas, que pueden tener estos inlets que nos permiten tener menos cantidad de muestra para llenar el vial. El vial es donde se, perdón, los racks, aquí es donde se colocan los viales para después la aguja pueda ir y tomar la muestra, o algunos inyectores toman la muestra y la llevan hacia la aguja, sí. Esto que vemos aquí es la aguja de inyección. Tenemos otros modelos también de inyectores en los cuales este tenemos este sistema de acá, en el cual tenemos un brazo que va y toma el vial y lo pone sobre la aguja. La aguja simplemente va hacia arriba y hacia abajo y toma.

¿Qué es lo interesante que tienen estos tipos de inyectores? Es particularmente que en general no tienen un loop fijo. Sí, una de las ventajas importantes para mí que tienen los inyectores automáticos es esto: la inyección de volumen es variable. Nos permite trabajar con volúmenes de inyección entre 1 y 100 microlitros. Algunos nos permiten trabajar inclusive con menos de 1 microlitro. ¿Cómo funciona esto? Bueno, en realidad, tener un loop fijo, lo que tienen es una bomba de jeringa que toma distintos volúmenes desde la muestra. Uno elige cuánto es que quiere tomar. Eso lo hacen super versátil. A su vez, permiten hacer un programa de análisis y dejar trabajando el equipo sin tener supervisión. No tenemos a un operario trabajando constantemente haciendo las inyecciones.

En algunos casos puede ser necesario incluir un lavado del inyector, porque hay inyectores que podemos tener, digamos, la posibilidad de limpiar la aguja. Ustedes no se olviden que esa aguja va directamente adentro de una una solución y esa aguja después va a pasarse a otras soluciones distintas y podemos arrastrar de repente un poquito de muestra entre uno y otro. Ese fenómeno se llama el carryover. Hay algunos equipos que le permiten a uno poder hacer secuencias de lavado para enjuagar múltiples la aguja esa y antes de hacer una inyección nueva. En general, hoy en día las agujas esas se lavan bastante entre inyección e inyección. Y la otra cosa es que muchas veces se pueden programar derivatizaciones previas dentro del mismo equipo, o sea, podemos hacer que la aguja tome muestra, la ponga en otro vial, se una reacción sobre eso, la mezcle y después tomemos ya el resultado de esa reacción y eso es lo que inyectamos en la columna.

Bueno, y ahora vamos a hablar un poquito de las columnas cromatográficas, pero muy por arriba. Sí, las columnas cromatográficas hoy en día ya no se parecen tanto a la columna de Arquímedes esa en la cual estaba tratando de bombear una fase móvil de de aire. Se parece más o menos a estas que tenemos acá. Si bien las formas y los tamaños pueden variar hoy en día muchísimo, el concepto básico de la columna es igual en todas. Sí, las columnas de HPLC básicamente son una cosa como esta. Tenemos el cuerpo de la columna en el cual está contenida la fase estacionaria a su elección y tenemos dos terminales aquí, que es donde están las conexiones para poder conectar la entrada y la salida de la fase móvil.

Es importante saber cómo vamos a este a clasificar estas columnas. La primera forma de clasificar a partir de las dimensiones. Es importante saber el largo de la columna, el diámetro interno de la columna, porque estas dos magnitudes lo que nos van a estar diciendo es qué volumen tenemos relleno de nuestra fase estacionaria. Y la otra son las características propias del relleno de la fase estacionaria, que esto lo van a estar viendo mucho más, este, más adelante, que necesitamos saber el tipo de la fase estacionaria, las especificaciones de esa fase estacionaria, el tamaño y la forma de la partícula, tanto así como la porosidad y el área superficial. Sí, todas estas cosas nos van a definir mucho de cómo se está comportando esta fase estacionaria.

Bien, muchas veces las columnas aparte las podemos proteger con precolumnas. La precol, ¿qué es lo que es? Es bueno, es básicamente una pequeña columna que se pone adelante de la columna para evitar que la columna sufra este algún tipo de desgaste o deterioro. ¿Qué es lo que hace? Bueno, generalmente la la precol, como dicen ahí, retiene partículas y componentes que se fijan sobre la fase estacionaria. Ustedes piensen, de repente, no piensen en un analito que está puro, un único analito, pero piensen en una mezcla de origen biológico, un extracto natural, eh, de repente tenemos una serie de compuestos gigantesca y algunos de ellos se pueden retener en la fase estacionaria de una forma muy fuerte y no los podemos eluir después de la fase estacionaria. Componentes de ese estilo, si nosotros lo usáramos directamente sobre la columna, irían haciendo que la performance de nuestra columna vaya cambiando a lo largo del tiempo, porque cada vez tendríamos más cantidad de ese componente que no se eluye. Tramos en el principio de la columna, eso nos cambiaría cómo se va comportando. Ahora, si nosotros estamos una precolumna, todos esos componentes se quedan retenidos en la precolumna, que en general tiene el mismo relleno de la fase estacionaria. Entonces, al irse reteniendo ahí, actúa como un filtro, digamos, este, para esos componentes que pueden dañar nuestra columna. Y lo bueno que tienen es que estos simplemente se retiran, se descartan y se puede conseguir uno nuevo para reemplazarlo, pero sin tener que reemplazar toda la columna. Básicamente, los los las precolumnas son una cosita, sí, es como tener una columna muy pequeña que se pone adentro de un cartucho. Sí, si esto se introduce dentro de este cartucho y eso se conecta a la entrada de la columna, se recambia fácilmente y nos permite a nosotros no tener que andar descartando columnas, sino descartando solamente esos pequeños cartuchos. Como dicen acá, pueden o no tener un relleno de fase estacionaria. En general, tienen el mismo relleno de la misma fase estacionaria para entonces no cambiar cómo son las interacciones que después va a tener dentro de la columna.

Bien, y sobre la conexión de la columna, yo les decía hoy que ustedes cuando trabajan con conexiones de acero, como las que vemos acá, la balona esta que tenemos acá o el ferrule queda fijo en una posición. ¿Y por qué eso es importante? Si ustedes los miran estos acá, tienen distintas distancias en el largo de este caño. ¿Por qué es importante? Porque cuando uno trate de conectar una columna, este largo de acá es donde va introducido el caño, aquí es donde tenemos que poner la balona que tiene forma cónica y esto donde va a enroscar al final. La rosca, las roscas son universales, la conicidad está es universal, pero esta distancia que está acá puede cambiar un poco. Entonces, si nuestro nuestro cañito en este caso queda corto o queda muy largo, el cierre no es lo suficientemente bueno y podemos tener pérdidas de la fase móvil. Por eso es importante que el encastre acá sea bueno. Si bien hoy en día la mayoría de estas de estas uniones, la mayoría de estas uniones son casi que universales y se pueden intercambiar sin problemas, en algunos casos podemos tener alguna falla. Sí.

Bien, y ahora, este, para el cuidado del cambio de las columnas, eh, cuando ustedes están cambiando una columna dentro de un equipo, es importante tener consideraciones sobre el cambio de las fases móviles, sí, porque no todas las columnas son compatibles con todos los disolventes. Es más, gran parte de las columnas son muy sensibles al cambio de disolventes. Hay que tener en cuenta la compatibilidad de cada columna con los solventes y las condiciones, a su vez también con el pH, la presión máxima. Si tienen dudas sobre cualquier cosa de estas, consulten los manuales de las columnas. Hoy en día ya no vienen más con las columnas, pero siempre están online o en los catálogos. Eh, los manuales contienen muchísima información sobre todas las condiciones que puede soportar la columna, cuáles son las condiciones óptimas, cómo limpiarlas, cómo darles este mantenimiento, todas esas cosas están ahí. Sí, es importante porque para cada columna y cada fase estacionaria que ustedes vayan a trabajar, eso va a ser distinto. Okay, pero como norma básica, cuando ustedes van a cambiar de un tipo de fase estacionaria a otro tipo distinto de fase estacionaria, como les dice acá, purgar todo el sistema antes de conectar la columna. Ustedes no se olviden que no es solamente la bomba la que está llena de fase móvil, todo el sistema está lleno de fase móvil. Es importante limpiarlo completamente antes de cambiar la columna. Cuando uno cambia la columna, puede si no arrastrar la fase móvil que haya quedado antes de la columna y que eso no sea compatible y a veces cantidades muy pequeñas de una fase móvil no compatible pueden arruinar una columna.

Otra cosa interesante es verificar el sentido de la columna. Si ustedes, eh, agarran una columna cromatográfica de HPLC cualquiera, la columna va a tener un sentido para el flujo y les va a decir el flujo entra por acá y sale por allá. Okay, eso dice algo acerca de la columna. En realidad, no, la columna es exactamente igual de un lado y del otro. Si ustedes le ponen de un sentido o la ponen en el otro, la columna tanto le da, porque son simétricas y da lo mismo. Pero, ¿cuál es el problema? Una vez que uno empieza a utilizar una columna, esa columna empieza a generar que ese empaque se empieza a empacar más hacia un lado, valga la salvedad, no. Este, al empezar a empacarse más hacia uno de los lados, lo que va a hacer es que tenga un comportamiento eh, distinto. Si nosotros la damos vuelta, porque si nosotros la damos vuelta, puede que se empacó hacia un lado, va a empezar a reempacar hacia el otro lado y eso puede cambiar cómo se comporta la columna. Por eso es que particularmente le dicen que mantengamos un mismo sentido de la columna. Está marcado para que uno lo pueda usar siempre en ese sentido. Pero en situaciones de emergencia, por ejemplo, si ustedes detectan que la columna se obstruyó en la entrada con alguna partícula, si se obstruye una partícula, la forma más fácil de retirar esa partícula es desconectar la columna y la damos vuelta y bombeamos la fase móvil al revés. De esa manera sacamos las partículas justo de donde están. Eso se puede hacer perfectamente. Inclusive hay veces que las columnas cuando empiezan a perder un poquito de performance se las puede dar vuelta para usar al revés. Y la otra es que verifiquen que los conectores que están utilizando son compatibles con el tipo de de columna que están usando.

Y la última cosa que queríamos ver es el calentamiento de las columnas. Nosotros hablamos mucho acerca de mantener la temperatura constante dentro de un sistema y bueno, ¿cómo hacemos para mantener la temperatura constante más en un país donde te cambia la temperatura este 10, 15 grados en un así como si nada? Bueno, la primera opción es siempre tener un horno. La metemos la columna dentro de un horno y tenemos un calentamiento por convección y empieza a calentar la columna hasta que está todo caliente ahí adentro. No es el mejor sistema de calentamiento, ah, para ser sinceros, porque en realidad demora un poco de tiempo en calentar la toda la la columna, sí, porque estamos calentando todo el cuerpo, la columna, los caños, las conexiones, todo para poder calentar la fase, este, estacionaria, que es lo que queremos realmente mantener caliente.

La otra opción que tenemos son los calentadores por Peltier, que calientan la fase móvil mediante un sistema de Peltier, que son dos placas semiconductoras que lo que tenemos es que si uno les aplica un voltaje, pueden llegar a a calentar el interior de las mismas, pero si aplicamos el voltaje en la forma inversa, lo que vamos a hacer es enfriarlo. Entonces, el Peltier nos da dos opciones: calentar y enfriar la fase móvil. También el enfriamiento de la fase móvil en general es limitado, enfriará hasta unos 15 grados, no, no es que uno pueda agarrar y enfriar muchísimo, pero el calentamiento es bastante bueno. Y lo interesante que tiene es que nosotros estamos en ese caso calentando la fase móvil antes de que ingrese a la columna, sí, y no la estamos calentando la columna per se. Entonces, es la misma fase móvil la que está calentando después la fase estacionaria. Como sistema de de calentamiento es bastante más eficiente. Sí.

Bueno, y esto es básicamente todo lo que les teníamos para contar sobre este tema. Este, no se olviden de que pueden participar en los foros y cualquier duda que tengan, la consultan directamente sobre los foros, así vamos discutiendo.